Caratterizzazione di Fish Scales Sovrapposizione (

L'obiettivo generale di questa procedura è determinare la struttura, la chimica e le proprietà meccaniche di scaglie di pesce mineralizzate multistrato eseguendo tomografia computerizzata a raggi X, nanoindentazione, spettroscopia infrarossa a trasformata di Fourier e microscopia elettronica a scansione abbinata a spettroscopia dispersiva di energia a raggi X. Questo viene realizzato preparando innanzitutto le singole scaglie per l'analisi, rimuovendo il tessuto molle dalle scaglie, montandole e sezionandole, quindi eseguendo una lucidatura progressiva. Il secondo passaggio consiste nell'eseguire una nanoindentazione spazialmente correlata lungo la sezione trasversale della scaglia con una punta in diamante di tipo Berkovich per determinare le proprietà nanomeccaniche locali.

Successivamente, i layer interno ed esterno della squama del pesce vengono esaminati mediante microscopio FTIR per identificare i principali gruppi funzionali nei rispettivi strati. L'ultimo passaggio consiste nell'utilizzare il rivelatore EDX del microscopio elettronico a scansione per correlare la composizione chimica locale alle nanoindentazioni effettuate sulle squame del pesce e per acquisire immagini delle indentazioni negli strati diversi e sulle superfici di frattura. In definitiva, combinando queste diverse tecniche sperimentali, i principi naturali di progettazione delle squame di pesce mineralizzate vengono chiariti attraverso la comprensione delle relazioni tra struttura e proprietà.

Il principale vantaggio di questa tecnica rispetto ad altri metodi di prova esistenti, come la nanoindentazione statistica su campione massivo, è che fornisce effettivamente una correlazione diretta tra composizione chimica, struttura e proprietà meccaniche locali. In particolare, abbiamo applicato questo metodo per studiare la distribuzione spaziale, la composizione chimica, la struttura e le proprietà meccaniche nei biomateriali strutturali. La tecnica ha inoltre numerose applicazioni, tra cui materiali a base di cemento, compositi multifase e, in generale, qualsiasi tipo di materiale eterogeneo che presenti tale eterogeneità su scala micrometrica e nanometrica.

Per esaminare una sezione trasversale dell'asse corto di una squama di pesce, posizionare la squama all'interno di un modulo campione di diametro 32 millimetri, utilizzando un supporto campione in plastica disponibile in commercio per mantenere l'orientamento corretto del campione durante il montaggio nell'epossidico. Una volta posizionato il campione nel modulo, versare sopra il campione una resina epossidica non polimerizzata. Dopo aver lasciato polimerizzare l'epossidico seguendo le indicazioni del produttore, sezionare il campione montato utilizzando una sega di precisione con lama al diamante lungo la linea mediana del campione.

Una volta caricato il campione nel nanoindentatore, utilizzare i controlli software per posizionare il campione nel punto del primo indentamento ed eseguire quattro file parallele di indentazioni distanziate di 15 micrometri per ottenere un insieme di dati statisticamente significativo a partire da questa posizione. Impostare quindi il nanoindentatore su un carico massimo di cinque millinewton, con velocità di carico e scarico di 0,1 millinewton al secondo, un tempo di permanenza di 30 secondi e una distanza minima tra le indentazioni di cinque micrometri per ogni fila. Al termine del ciclo, eseguire con il nanoindentatore indentazioni di riferimento (fiduciali) con un carico massimo di 100 millinewton al primo e all'ultimo indentamento, che dovranno trovarsi nell'epossidico prima del livello anoe e dopo il livello osseo rispettivamente.

Dopo la nanoindentazione, riposizionare il campione nella soluzione di PBS per evitare ulteriore disidratazione. Montare rigidamente il campione in modo che la dimensione più lunga sia parallela al rivelatore. Dopo aver configurato lo scanner, fissare il campione montato sulla piastra dello scanner utilizzando materiali trasparenti ai raggi X, come polistirolo e paraformaldeide.

Posizionare il campione in modo che si trovi al centro di rotazione. Durante la scansione, selezionare la risoluzione più elevata che consenta all'intera scala di rimanere nel campo visivo, che in questo caso è di 7,5 micrometri. Al termine dell'acquisizione dei dati, ricostruire le immagini di proiezione a raggi X per creare un set di dati contenente immagini trasversali.

Quindi utilizzare il software per ottenere l'immagine finale in scala di grigi 3D. Regolare l'intervallo della scala di grigi a un livello appropriato per rimuovere gli artefatti derivanti dal polistirolo e dal paraformaldeide. Per l'immagine al microscopio elettronico a scansione (SEM) o microscopia elettronica a scansione degli indentazioni nanostrutturali sul campione lucidato, fissare il campione su un supporto per SEM utilizzando nastro di carbonio bifacciale, con la superficie indentata rivolta verso l'alto. Successivamente, inserire il campione nella camera del SEM e portare la camera in modalità vuoto basso.

Regolare la distanza di lavoro tra 3,0 e 5,0 millimetri. Attivare l'alta tensione e spostarsi sulle regioni di interesse del campione, che in questo caso sono le strutture presenti negli strati di anoe e osso. Successivamente, acquisire immagini con un'alta tensione compresa tra cinque kilovolt e 15 kilovolt e una corrente del fascio più bassa di 3,9 nanoampere.

Per migliorare la risoluzione, acquisire immagini da almeno tre aree di interesse a ingrandimenti compresi tra 250 x e 10.000 x utilizzando il rilevatore di elettroni retrodiffusi BSE in vuoto basso per facilitare l'identificazione di variazioni nel contenuto e nella densità di biomateriali mineralizzati. Successivamente, spostarsi su un'area di interesse del campione lucidato che includa una griglia di nanoindentazione indicata da segni fiduciali all'estremità di ciascuna fila di indentazioni. Assicurarsi che la tensione elevata sia di almeno 15 kilovolt.

La corrente del fascio è di almeno 3,9 nanoampere e la distanza operativa è superiore a 5,0 millimetri. Successivamente acquisire l'immagine degli elettroni retrodiffusi della regione da analizzare mediante EDX. Utilizzando il software di analisi EDX.

Catturare la stessa immagine per facilitare l'individuazione delle aree in cui eseguire l'analisi chimica lungo la linea degli indenti. Successivamente, utilizzando la tecnica di analisi lineare, posizionare una linea per effettuare l'analisi chimica lungo la linea di interesse degli indenti, partendo dal primo indent e terminando con l'ultimo. Specificare il numero di punti di analisi da posizionare lungo la linea, utilizzando lo stesso numero degli indent presenti, al fine di ottenere una correlazione spaziale diretta tra la composizione chimica e le proprietà meccaniche.

Quando la linea è posizionata e i punti sono specificati correttamente, avviare l'analisi della linea utilizzando il software EDX. Al termine dell'analisi della linea, identificare gli elementi di interesse da quantificare a partire dagli spettri puntuali ottenuti lungo la linea specificata sulla superficie lucidata del campione.

Una volta identificati gli elementi di interesse, eseguire una calibrazione del fondo per tenere conto della radiazione di frenamento e di altri effetti. Selezionare l'opzione di analisi di deconvoluzione del software per ottenere un'analisi quantitativa su ciascun punto lungo la linea specificata, al fine di quantificare la composizione chimica in ogni punto. Infine, salvare i risultati dell'analisi chimica quantitativa insieme all'immagine della linea specificata che è stata analizzata, per facilitare la correlazione spaziale con le proprietà meccaniche misurate mediante nanoindentazione nello strato anoe; la nanoindentazione ha calcolato un modulo medio di 69,0 giga pascal e una durezza di 3,3 giga pascal.

L'indentazione nano ha determinato un modulo medio di 14,3 giga pascal e una durezza di 0,5 giga pascal per lo strato osseo. Lo strato di anoe e quello osseo presentano differenze quantificabili nella composizione chimica. L'aumento di carbonio nello strato osseo può essere attribuito a una bassa mineralizzazione, che comporta un incremento del carbonio e una diminuzione della luminosità nell'immagine BSE. Gli spettri FTIR degli strati osseo ed ENE mostrano firme di idrossiapatite nello strato esterno gwe e firme di collagene nello strato osseo interno.

La tomografia computerizzata a raggi X mostra che lo strato di gwe non ricopre lo strato osseo nelle zone in cui le squame si sovrappongono. Gli strati di gwe di grigio più chiaro sono più densi, duri e rigidi, mentre gli strati ossei di grigio più scuro sono meno densi e meno rigidi. Si osservano evidenti depressioni al centro dello strato ging, che ne dimostrano l'non uniformità.

L'immagine SEM a basso ingrandimento della superficie di frattura incisa ha rivelato nanostrutture organizzate in un modello stratificato per lo strato gingivale, il che corrisponde all'ingrandimento più elevato della SEM e alle immagini della superficie di frattura incisa che mostrano nanostrutture allineate a forma di bacchetta nello strato gingivale, mentre una nanostruttura simile a fibre viene osservata nello strato osseo dopo il suo sviluppo. Questa tecnica ha aperto la strada a ulteriori ricerche sui biomateriali e sui materiali compositi per studiare la distribuzione spaziale della composizione chimica, della struttura e delle proprietà meccaniche, nonché per analizzare le interfacce nei materiali compositi multifase. Bene, dopo aver visto questo video, dovreste avere una buona comprensione di come preparare campioni ed eseguire analisi per correlare spazialmente la composizione chimica con la struttura e le proprietà meccaniche nei biomateriali strutturali.

Queste tecniche sono inoltre applicabili e adattabili allo studio di altri tipi di materiali multifase eterogenei.