Caratterizzazione di Fish Scales Sovrapposizione ( Atractosteus spatola) Usando Nanoindentazione, X-ray CT, FTIR e SEM

L'obiettivo generale di questa procedura è determinare la struttura, la chimica e le proprietà meccaniche delle squame di pesce mineralizzate multistrato eseguendo la tomografia computerizzata a raggi X, la nanoindentazione per la spettroscopia a infrarossi trasformati e la microscopia elettronica a scansione abbinata alla spettroscopia a raggi X a dispersione di energia. Ciò si ottiene preparando prima le singole bilance per l'analisi rimuovendo i tessuti molli dalle squame, montando e sezionando le squame e quindi eseguendo la lucidatura graduale. Il secondo passo consiste nell'eseguire una nanoindentazione spazialmente correlata lungo la sezione trasversale della scala con una punta di diamante percovich per determinare le proprietà nanomeccaniche locali.

Successivamente, gli strati interni ed esterni delle squame di pesce vengono esaminati con un microscopio FTIR per identificare i principali gruppi funzionali nei rispettivi strati. Il passaggio finale consiste nell'utilizzare il rivelatore EDX al microscopio elettronico a scansione per correlare la composizione chimica locale alle nano rientranze praticate nelle squame di pesce e per catturare immagini delle rientranze nei diversi strati e superfici di frattura. In definitiva, combinando queste varie tecniche sperimentali, i principi di progettazione naturale delle squame di pesce mineralizzate vengono chiariti attraverso la comprensione delle relazioni tra le proprietà della struttura.

Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ad altri metodi di test esistenti, come la nanoindentazione statistica di massa, è che fornisce davvero una correlazione diretta tra la struttura della composizione chimica e le proprietà meccaniche locali. Nelle regioni di interesse, tuttavia, abbiamo applicato questo metodo per studiare la distribuzione spaziale e la struttura della composizione chimica e le proprietà meccaniche nei biomateriali strutturali. Ha anche molte applicazioni, tra cui materiali a base di cemento, compositi multifase e qualsiasi tipo di materiale eterogeneo che mostri tale eterogeneità su scala di lunghezza micrometrica e nanometrica.

Per esaminare una sezione trasversale di un asse corto di squame di pesce, tenere la squama di pesce in uno stampo per campioni di 32 millimetri di diametro, utilizzando un supporto per campioni in plastica disponibile in commercio per mantenere il campione orientato correttamente durante il montaggio nella resina epossidica. Una volta che il campione è stato trattenuto nello stampo, versare una resina epossidica non polimerizzata sul campione. Dopo aver lasciato indurire la resina epossidica secondo le indicazioni del produttore, sezionare il campione montato utilizzando una sega da taglio ad alta precisione con disco diamantato sulla linea mediana del campione.

Una volta che il campione è stato caricato nel nano e nell'entrata, utilizzare i controlli del software per spostare il campione nella posizione per il primo rientro, eseguire quattro file parallele di rientri distanziati di 15 micrometri l'uno dall'altro per ottenere un set di dati statisticamente significativo a partire da questa posizione. Quindi impostare il nano indenture su un carico massimo di cinque millinewton velocità di carico e scarico di 0,1 millinewton al secondo, un tempo intero di 30 secondi e una spaziatura minima di cinque micrometri per ogni riga. Quando il lotto è completato, metà del nano indenture crea indentazioni fiduciali con un carico massimo di 100 millinewton alla prima e all'ultima indentazione, che dovrebbero essere nella resina epossidica rispettivamente prima dello strato anoe e dopo lo strato osseo.

Dopo la nanoindentazione, riposizionare il campione nella soluzione PBS per evitare un'ulteriore disidratazione. Montare rigidamente il campione in modo che la dimensione più lunga sia parallela al rivelatore. Dopo aver impostato lo scanner, fissare il campione montato al tavolino dello scanner utilizzando materiali trasparenti ai raggi X come polistirolo e paraform.

Posizionare il campione in modo che si trovi al centro della rotazione. Durante la scansione, selezionare la risoluzione più alta che consenta all'intera scala di trovarsi nel campo visivo, che in questo caso è di 7,5 micrometri. Dopo l'acquisizione dei dati, ricostruire le immagini di proiezione a raggi X per creare un set di dati contenente immagini in sezione trasversale.

Quindi utilizzare il software per ottenere l'immagine finale in scala di grigi 3D. Regolare l'intervallo della scala di grigi a un livello appropriato per rimuovere gli artefatti dal polistirolo e dalla paraforma Per l'imaging SEM o al microscopio elettronico a scansione di nano rientranze sul campione lucidato, fissare il campione su un tronchetto SEM utilizzando nastro di carbonio biadesivo con la superficie rientrata rivolta verso l'alto. Quindi, posizionare il campione nella camera SEM e pompare la camera in modalità a basso vuoto.

Regolare la distanza di lavoro tra 3,0 e 5,0 millimetri. Attiva l'alta tensione e naviga verso le regioni di interesse sul campione, che in questo caso sono le strutture presenti negli strati anoe e ossei. Quindi ottenere immagini ad alta tensione compresa tra cinque kilovolt e 15 kilovolt e una corrente del fascio inferiore di 3,9 nano ampere.

Per migliorare la risoluzione, è possibile acquisire immagini da almeno tre regioni di interesse con ingrandimenti da 250 x a 10.000 x utilizzando il rivelatore BSE a basso vuoto di elettroni retrodiffusi per aiutare a identificare i cambiamenti nel contenuto e nella densità dei biominerali. Successivamente, naviga verso una regione di interesse sul campione lucidato che include una griglia di nano indentazione indicata da segni di riferimento alla fine di ogni riga di indentazione. Assicurarsi che l'alta tensione sia di almeno 15 kilovolt.

La corrente del fascio è di almeno 3,9 nano ampere e la distanza di lavoro è maggiore di 5,0 millimetri. Quindi cattura l'immagine elettronica retrodiffusa della regione da analizzare utilizzando EDX. Utilizzando il software di analisi EDX.

Cattura la stessa immagine per facilitare l'individuazione delle aree in cui eseguire l'analisi chimica lungo la linea delle rientranze. Successivamente, utilizzando la tecnica dell'analisi delle linee, posizionare una linea per eseguire l'analisi chimica lungo la linea di interesse dei rientri che iniziano dal primo rientro e terminano all'ultimo trattino. Specificare il numero di punti di analisi da posizionare lungo la linea utilizzando lo stesso numero del numero di rientranze presenti per fornire una correlazione spaziale diretta tra la composizione chimica e le proprietà meccaniche.

Quando la linea è posizionata e i punti sono specificati correttamente. Avviare l'analisi della linea utilizzando il software EDX dopo il completamento dell'analisi della linea. Identificare gli elementi di interesse da quantificare dagli spettri puntiformi ottenuti lungo la linea specificata sulla superficie levigata del campione.

Una volta identificati gli elementi di interesse, eseguire una calibrazione di fondo per tenere conto della paglia, della paglia, delle radiazioni polmonari e di altri effetti. Scegli l'opzione di analisi della deconvoluzione del software per ottenere un'analisi quantitativa su ogni punto lungo la linea specificata per quantificare la composizione chimica in ogni punto. Infine, salva i risultati dell'analisi chimica quantitativa insieme all'immagine della linea specificata che è stata analizzata per aiutare la correlazione spaziale con le proprietà meccaniche misurate utilizzando la nanoindentazione nello strato anoe, la nanoindenture ha calcolato un modulo medio di 69,0 giga pascal e una durezza di 3,3 giga Pascal.

Il nano indenture ha determinato un modulo medio di 14,3 giga pascal e una durezza di 0,5 giga pascal per lo strato osseo. Lo strato anoe e osseo contiene differenze quantificabili nella composizione chimica. Il picco di carbonio nello strato osseo può essere attribuito a una bassa mineralizzazione, che si traduce in un aumento del carbonio e una diminuzione della luminosità dell'immagine BSE, gli spettri FTIR dell'osso e gli strati ENE mostrano firme di idrossiapatite nello strato gwe esterno e firme di collagene nello strato osseo interno.

tomografia computerizzata a raggi X mostra che lo strato gwe non copre lo strato osseo dove le squame si sovrappongono. Gli strati di gwe grigio più chiaro sono più densi, più duri e più rigidi, mentre gli strati ossei grigio più scuri sono meno densi e meno rigidi. Si osservano fosse chiare vicino al centro dello strato di ging, che ne dimostrano la non uniformità.

L'immagine SEM a basso ingrandimento della superficie di frattura incisa ha rivelato nanostrutture organizzate in un modello stratificato per lo strato di ging, che si correla al SEM di ingrandimento più elevato di FTIR, le immagini della superficie di frattura incisa mostrano nano barre orientate nello strato di ging, mentre una nanostruttura simile a una fibra si osserva nello strato osseo dopo il suo sviluppo. Questa tecnica ha aperto la strada a ulteriori ricerche sui biomateriali e sui materiali compositi per studiare la distribuzione spaziale della struttura della composizione chimica e delle proprietà meccaniche, nonché per esaminare le interfacce nei materiali compositi multifase. Bene, dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come preparare i campioni ed eseguire analisi per correlare spazialmente la composizione chimica con la struttura e le proprietà meccaniche nei biomateriali strutturali.

Queste tecniche sono applicabili e adattabili anche per lo studio di altri tipi di materiali multifase eterogenei.