One-step purificazione di proteine ​​Twin-Strep-taggate e dei loro complessi su Strep-Tactin resina reticolato con Bis (Sulfosuccinimidil) suberato (BS3)

Ciao, sono Christina McKennan dell'Università di Helsinki, in Finlandia. Una delle sfide nella caratterizzazione di un particolare complesso proteico è determinarne la composizione molecolare. Ciò richiede lo sviluppo di metodi per isolare e purificare il complesso dal suo ambiente cellulare.

L'area di ricerca sui microrganismi riguarda le interazioni tra virus vegetali e ospiti, e pertanto siamo interessati ai diversi complessi proteici nucleari virali formati durante l'infezione. In passato, abbiamo studiato con successo questi complessi utilizzando una purificazione basata su affinità con biotina, da noi condotta. La doppia biotina si è rivelata una delle migliori opzioni.

Tuttavia, abbiamo osservato alcune limitazioni nel suo utilizzo, una delle quali è il basso rendimento, e pertanto abbiamo voluto migliorare questo metodo. Ciao, mi chiamo Mata e ti guiderò attraverso il protocollo sperimentale. Ma prima, lascia che ti fornisca una panoramica del metodo.

Utilizziamo perle Strep-Tactin Macro Prep per purificare complessi specifici tra proteine doppio marcate con il tag Strep e i loro partner di legame fisiologici. Il tetramero marcati con il tag Strep è mostrato in verde, la proteina doppio marcata con il tag Strep in blu, il suo partner di legame in arancione e due copie del tag Strep in rosso.

Le proteine non legate, rappresentate come timori di grazia, vengono rimosse mediante lavaggio nell'approccio canonico. I complessi legati vengono elusi in modo competitivo con biotina, mostrata in rosa. Tuttavia, utilizzando questo approccio, abbiamo osservato un'elusione incompleta dei complessi legati, con solo una frazione che si stacca con successo dalle perle di streptavidina.

Questo porta a un basso recupero della proteina bersaglio. Per complicare ulteriori analisi, il recupero della proteina bersaglio può essere migliorato utilizzando un'eluzione denaturante con S-D-S-S-D-S. Si formano cellule Miss attorno alla proteina bersaglio con doppio marcatore Strep ttag denaturata.

Il suo partner di legame e attorno ai monomeri dissociati di streptactina. La contaminazione del campione risultante con streptactina rilasciata è inaccettabile se il campione deve essere ulteriormente analizzato mediante spettrometria di massa. Per superare il problema della contaminazione del campione, abbiamo sviluppato un metodo mediante il quale il tetramero di streptactina viene prima stabilizzato mediante cross-linking chimico.

La resina risultante reticolata viene utilizzata per purificare la proteina esca e il suo partner di legame; l'eluizione del campione con SDS garantisce un'elevata resa proteica, mentre il reticolaggio chimico della resina assicura l'eluizione della proteina esca marcate con strept e del suo partner di legame in assenza di contaminazione del campione con strept rilasciato. Equilibrare una provetta microcentrifuga sigillata, contenente due milligrammi di crosslinker BS3, a temperatura ambiente.

Preparare un puntale per pipetta per il trasferimento della resina tagliando via l'estremità del puntale. Ri-sospendere brevemente e con agitazione vigorosa la resina strep tact e macro prep, quindi trasferire immediatamente 600 microlitri della sospensione in una colonna filtrante CoStar SpinX e centrifugare a 4.000 giri al minuto per 30 secondi. Aggiungere 450 microlitri di soluzione salina tamponata al fosfato a temperatura ambiente. Lo scopo di questo passaggio è sostituire l'ammina primaria tris con fosfato non reattivo.

Scartare il flusso passante. Mescolare il contenuto capovolgendo il tubo diverse volte. Ripetere la centrifugazione e i passaggi di lavaggio due volte e lasciare la resina in 430 microlitri di P-B-S-P-H otto.

Dopo l'ultima centrifugazione, perforare la pellicola del microtubo no way con la punta di una pipetta contenente 100 microlitri di acqua milli Q. Sciogliere la polvere di BS three in acqua pipettando delicatamente su e giù. Una volta che il BS three è completamente sciolto, aggiungere immediatamente 20 microlitri della soluzione alla colonna spin X. Assicurarsi che il contenuto sia mescolato correttamente.

Ruotare la colonna per 30 minuti a temperatura ambiente, assicurandosi che la resina sia mescolata correttamente con la soluzione BS tre. Per bloccare la reazione, aggiungere sei microlitri di triss tre molare aggiustato a pH 7,5 con acido cloridrico. Ruotare la colonna per altri 15 minuti a temperatura ambiente e centrifugare a 4.000 giri al minuto per 30 secondi.

A temperatura ambiente, risospendere la resina reticolata in 450 microlitri di soluzione salina tamponata al tris con tween 20 e scartare il flusso passante. Ripetere le centrifugazioni e i passaggi di lavaggio altre due volte. All'ultimo passaggio, risospendere la resina in 450 microlitri di TBS. Trasferire la sospensione di resina in una provetta pulita, risospendere la resina rimasta nella colonna con altri 450 microlitri di TBS e trasferirla nella stessa provetta.

Ripetere l'ultimo passaggio ancora una volta per garantire il massimo trasferimento della resina dalla colonna al tubo. Lasciare il tubo con la sospensione di resina in posa per 10 minuti a temperatura ambiente e portare il volume a 600 microlitri. Rimuovendo il TBS in eccesso, la resina è pronta per l'uso immediato oppure può essere conservata a quattro gradi Celsius senza congelamento.

Questo metodo è adatto alla purificazione di qualsiasi proteina di fusione marcata con doppio strep-tag e dei suoi complessi associati. La proteina può essere di origine animale, vegetale o batterica e può essere isolata sia da lisati cellulari totali che da frazioni organellari arricchite. In questo esempio, isoliamo la proteina con doppio strep-tag VPG Pro del virus del mosaico della patata A dalla frazione nucleare di piante infette, centrifugando inizialmente un millilitro del campione della proteina bersaglio nel buffer di legame a 13.000 giri al minuto per 10 minuti a quattro gradi Celsius.

Trasferire il surnatante in una provetta nuova per minimizzare il legame delle proteine biotinilate endogene al complesso strep-tact e alla resina. Aggiungere l'avadon a una concentrazione finale di 100 microgrammi per millilitro, assicurandosi che il contenuto sia mescolato accuratamente. Incubare in rotazione per 15 minuti a quattro gradi Celsius.

Risospendere la resina reticolata mediante vortex e, utilizzando una punta pipetta a coppetta, aggiungere immediatamente 50 microlitri di sospensione di resina al tubo contenente il campione di proteina esca. Ruotare per altri 30 minuti a quattro gradi Celsius in attesa. Impostare il termoagitatatore a 55 gradi Celsius e preriscaldare 500 microlitri di tampone di eluizione per l'uso nel passaggio di eluizione; centrifugare a 2000 RPM per un minuto a quattro gradi Celsius.

Eliminare il soprannatante e lavare la resina con un millilitro di tampone di lavaggio pre-raffreddato. Primo, ruotare per cinque minuti a quattro gradi Celsius. Ripetere le fasi di centrifugazione e di lavaggio tre volte nell'ultimo passaggio.

Risospendere la resina in 250 microlitri di tampone di lavaggio numero due e trasferire la sospensione di resina in una nuova colonna spinx. Risospendere la resina rimanente nel tubo in altri 250 microlitri di tampone di lavaggio numero due e trasferirla nella stessa colonna. Centrifugare a 2000 giri al minuto per tre minuti a quattro gradi Celsius. Trasferire la colonna in un nuovo tubo dolphin nose da due millilitri e scartare il flusso iniziale.

Procedere immediatamente al seguente passaggio di eluizione. Aggiungere 150 microlitri di tampone di eluizione preriscaldato alla colonna spinx. Incubare la soluzione nel termomiscelatore per cinque minuti a 55 gradi Celsius, agitando a 1400 giri al minuto, quindi centrifugare a 4.000 giri al minuto per un minuto a temperatura ambiente e scartare la colonna.

Le proteine bersaglio purificate sono ora pronte per ulteriori analisi e possono essere conservate al di sotto di meno 20 gradi Celsius. L'immagine dimostra che l'eluizione delle proteine dalla resina strept actin macro prep con biotina è incompleta rispetto all'eluizione con SDS. La differenza nelle intensità del segnale del western blot riflette rese proteiche diverse ottenute con le due tecniche di eluizione. Sebbene l'eluizione con SDS sia molto più efficiente rispetto all'eluizione con biotina, provoca contaminazione del campione con strept actin rilasciata.

L'immagine mostra un gel colorato con argento di SDS EIT provenienti dalla resina Strept actin Macro prep; si noti la presenza di strept actin rilasciata nella corsia di sinistra ma la sua assenza nella corsia di destra. Il campione a sinistra è stato eluito dalla resina non cross-linkata e il campione a destra dalla resina cross-linkata con BS three. Sulla base di questi risultati, concludiamo che il cross-linking con BS three impedisce il rilascio di strept actin dalla resina durante l'eluzione con SDS.

In questo esempio abbiamo utilizzato una resina Strept actin macro prep reticolata con BS three per purificare la proteina bersaglio VPG PRO e i suoi partner di legame. Un'aliquote del campione purificato è stata sottoposta ad analisi spettrometrica di massa per l'identificazione delle proteine. L'assenza di una banda specifica nel controllo negativo conferma la specificità del pull down.

La banda inferiore corrisponde alla proteina esca VPG PRO e la banda superiore al suo partner di legame NIB, identificato mediante spettrometria di massa. Salve, vi abbiamo appena mostrato come il cross-linking chimico possa essere utilizzato per superare i limiti associati alla Dena e all'illusione derivante dalla resina strep tactin. Oltre alla purificazione di complessi proteina-proteina, il metodo può essere utilizzato anche per purificare complessi proteici con acidi nucleici, inclusi quelli cross-linkati al contrario con formaldeide.

Infine, il metodo può essere utilizzato per purificare proteine di membrana strep tech, solubilizzate con detergenti. I detergenti sono necessari per mantenere queste proteine idrofobiche in soluzione.

Tuttavia, la loro presenza può portare a contaminazione del campione con rilascio di streptavidina. Anche quando si utilizza una lieve eluizione della biotina, riteniamo che la cross-linking della resina possa rappresentare una soluzione al problema della contaminazione del campione. Grazie per aver guardato e buona fortuna con i vostri esperimenti. Okay.