Name: One-step purificazione di proteine Twin-Strep-taggate e dei loro complessi su Strep-Tactin resina reticolato con Bis (Sulfosuccinimidil) suberato (BS3) (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-04-20T14:00:00.000+00:00
Duration: 18 min 27 s
Description: Scopri la purificazione one-step di proteine Twin-Strep-taggate e complessi su resina Strep-Tactin reticolata con BS3. Questo metodo rapido garantisce elevata purezza e compatibilità con la spettrometria di massa per l'analisi biochimica.

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Noi riconosciamo con gratitudine il supporto tecnico di Sini Miettinen, Minna Pollanen e Taru Rautavesi. Ringraziamo Helka Nurkkala per la fornitura di cellule HEK 293 esprimenti twin-Strep-tag GFP e Pekka Evijärvi per la fornitura di apparecchi registrazione suono. Questo lavoro è stato finanziato dall&#39;Accademia di Finlandia, concedere numeri 138.329, 134.684 e 258.978.

1. Cross-linking di Strep-Tactin Polimetacrilato resina con Bis (Sulfosuccinimidil) suberato (BS3) <ol><li> Equilibrare una provetta sigillata contenente 2 mg di BS3 reticolante a temperatura ambiente. ATTENZIONE: BS3 è una sostanza pericolosa. Indossare guanti e occhiali protettivi. </li><li> Risospendere Strep-Tactin resina di polimetacrilato (sospensione al 50% in 100 mM Tris-HCl, pH 8,0, 1 mM EDTA, 150 mM NaCl) di breve vigorosa agitazione e trasferire immediatamente 600 ml di sospensione ad una colonna di spin con un puntale con l&#39; end tagliata. </li><li> Centrifugare a 1500 xg per 30 secondi a temperatura ambiente. Scartare il flow-through e aggiungere 450 ml di tampone fosfato salino (PBS) alla colonna. </li><li> Ripetere il passaggio precedente 2 più volte per sostituire completamente tampone Tris con PBS e lasciare la resina in 430 ml di PBS a pH 8,0 dopo l&#39;ultima centrifugazione. </li><li> Forare il foglio della provetta con BS3 con un puntale contenente 1001; l di acqua ultrapura. Sciogliere la polvere BS3 in acqua pipettando gentilmente su e giù e immediatamente aggiungere 20 ml di soluzione alla colonna di spin. La concentrazione finale di BS3 nella reazione di reticolazione è ~ 1,2 mM. </li><li> Ruotare la colonna per 30 minuti a temperatura ambiente. Verificare che la resina viene miscelata correttamente con la soluzione BS3. </li><li> Per spegnere la reazione, aggiungere 6 ml di 3M Tris-HCl, pH 7.5 e ruotare la colonna per altri 15 minuti a temperatura ambiente. </li><li> Centrifugare a 1500 xg per 30 secondi a temperatura ambiente. Gettare il flow-through e risospendere la resina reticolata in 450 ml di soluzione salina tamponata Tris con Tween 20 (TBST). Ripetere la centrifugazione e lavare i passaggi altre due volte. Nell&#39;ultima fase, risospendere la resina in 450 ml di TBS. </li><li> Trasferire la sospensione di resina in una nuova provetta utilizzando una punta di pipetta con l&#39;estremità tagliata. Risospendere la resina nella colonna a sinistra con altri 450 ml di TBS e trasferimento al tubo stesso. Ripetere the ultimo passo nuovamente al massimo il trasferimento della resina dalla colonna al tubo. </li><li> Lasciare riposare la provetta per 10 minuti a temperatura ambiente e regolare il volume a 600 ml rimuovendo l&#39;eccesso di TBS. La resina è pronta per l&#39;uso immediato (raccomandato) o può essere conservato a 4 ° C, senza congelare. </li></ol> 2. Legame della proteina Bait Twin-Strep-tag e associate Complessi al Cross-linked Strep-Tactin Polimetacrilato Resina <ol><li> Centrifugare 1 ml del campione proteina esca in tampone di legame a 17.000 xg per 10 min a 4 ° C e trasferire il surnatante in una nuova provetta. </li><li> Per minimizzare legame di proteine ​​endogene biotinilati alla resina Strep-Tactin, aggiungere avidina ad una concentrazione finale di 100 pg / ml e ruotare per 15 min a 4 ° C. <ol><li> Se la resina reticolata dal punto 1.10 è stato conservato per un periodo di tempo prolungato a 4 ° C, raccogliere la resina mediante centrifugazione a 400 xg for 1 min a 4 ° C, scartare il surnatante e lavare la resina con 1 ml di TBST. Ripetere la centrifugazione e lavaggio passaggi altre due volte, prima con TBST e poi con TBS. Centrifugare la provetta a 400 xg per 1 min a 4 ° C e regolare al volume originale rimuovendo l&#39;eccesso di TBS. </li></ol></li><li> Risospendere il reticolato resina Strep-Tactin nel vortex. Immediatamente aggiungere 50 microlitri della sospensione resina per il tubo contenente il campione di proteina esca con una punta di pipetta taglio e ruotare per altri 30 min a 4 ° C. </li><li> Durante l&#39;attesa, impostare thermomixer a 55 ° C e preriscaldare 500 microlitri di tampone di eluizione per uso nel passaggio 3.1. </li><li> Centrifugare a 400 xg per 1 min a 4 ° C. Eliminare il supernatante e lavare la resina su un rotatore per 5 minuti a 4 ° C con 1 ml di pre-raffreddata tampone di lavaggio # 1. Ripetere la centrifugazione e lavare passi tre volte. Nell&#39;ultima fase, risospendere la resina in 250 ml di tampone di lavaggio # 2. </li><li> Tr<html> ansfer la sospensione resina per una colonna di spin fresco. Risospendere la resina rimanente nel tubo in altri 250 ml di tampone di lavaggio # 2 e trasferire alla stessa colonna. </li><li> Centrifugare a 400 xg per 3 min a 4 ° C, scartare il flow-through e trasferire la colonna di una fiala delfini naso 2 ml. Procedere immediatamente alla fase di eluizione sotto. </li></ol> 3. Eluizione di specifici complessi proteici <ol><li> Aggiungere 150 ml di tampone di eluizione preriscaldato dal punto 2.4 alla colonna di spin. </li><li> Incubare in thermomixer per 5 minuti a 55 ° C, agitando a 1.400 rpm. </li><li> Centrifugare a 1500 xg per 1 minuto a temperatura ambiente. </li><li> Eliminare la colonna e memorizzare le proteine ​​bersaglio purificate a ≤ -20 ° C. </li></ol><table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="598"><tbody><tr height="20"><td colspan="2" height="20" style="height:20px;width:597px;"> Tampone fosfato salino (PBS) </td></tr>0 &quot;&gt; <td height="20" style="height:20px;width:299px;"> Na 2 HPO 4 </td><td style="width:299px;"> 10 mM </td></tr><tr height="20"><td height="20" style="height:20px;width:299px;"> KH 2 PO 4 </td><td style="width:299px;"> 2mM </td></tr><tr height="20"><td height="20" style="height:20px;width:299px;"> NaCl </td><td style="width:299px;"> 137 mm </td></tr><tr height="20"><td height="20" style="height:20px;width:299px;"> KCl </td><td style="width:299px;"> 2.7 mM </td></tr><tr height="20"><td colspan="2" height="20" style="height:20px;width:597px;"> pH regolato a 7,4 se non diversamente specificato (pH 8.0 nella sezione 1.4) </td></tr><tr height="20"><td colspan="2" height="20" style="height:20px;width:597px;"> Tris soluzione salina tamponata (TBS) </td></tr><tr height="20"><td height="20" style="height:20px;width:299px;"> Tris-HCl, pH 7.4 </td><td style="width:299px;"> 50 mM </td></tr><tr height="20"><td hei<html> ght = stile &quot;20&quot; = &quot;height: 20px; width: 299px;&quot;&gt; NaCl </td><td style="width:299px;"> 150 mm </td></tr><tr height="20"><td colspan="2" height="20" style="height:20px;width:597px;"> Tris tamponata salina con Tween 20 (TBST) </td></tr><tr height="20"><td height="20" style="height:20px;width:299px;"> Tris-HCl, pH 7.4 </td><td style="width:299px;"> 50 mM </td></tr><tr height="20"><td height="20" style="height:20px;width:299px;"> NaCl </td><td style="width:299px;"> 150 mm </td></tr><tr height="20"><td height="20" style="height:20px;width:299px;"> Tween 20 </td><td style="width:299px;"> 0,1% (v / v) </td></tr><tr height="20"><td colspan="2" height="20" style="height:20px;width:597px;"> Tampone di legame </td></tr><tr height="20"><td height="20" style="height:20px;width:299px;"> Tris-HCl, pH 8.0 </td><td style="width:299px;"> 25 mm </td></tr><tr height="20"><td height="20" style="height:20px;width:299px;"> NaCl </td>x &quot;&gt; 550 mm </td></tr><tr height="20"><td height="20" style="height:20px;width:299px;"> NaF </td><td style="width:299px;"> 5 mM </td></tr><tr height="20"><td height="20" style="height:20px;width:299px;"> EDTA </td><td style="width:299px;"> 0,5 mm </td></tr><tr height="20"><td height="20" style="height:20px;width:299px;"> Glicerina </td><td style="width:299px;"> 10% (v / v) </td></tr><tr height="20"><td height="20" style="height:20px;width:299px;"> PMSF </td><td style="width:299px;"> 0,1 mm </td></tr><tr height="20"><td colspan="2" height="20" style="height:20px;width:597px;"> Lavare tampone # 1 </td></tr><tr height="20"><td height="20" style="height:20px;width:299px;"> Tris-HCl, pH 8.0 </td><td style="width:299px;"> 25 mm </td></tr><tr height="20"><td height="20" style="height:20px;width:299px;"> NaCl </td><td style="width:299px;"> 500 mm </td></tr><tr height="20"><td height="20" style="height:20px;width:299px;"> NaF </<html> td&gt; <td style="width:299px;"> 5 mM </td></tr><tr height="20"><td height="20" style="height:20px;width:299px;"> EDTA </td><td style="width:299px;"> 0,4 mm </td></tr><tr height="20"><td height="20" style="height:20px;width:299px;"> Igepal CA-630 </td><td style="width:299px;"> 0,2% (v / v) </td></tr><tr height="20"><td height="20" style="height:20px;width:299px;"> Glicerina </td><td style="width:299px;"> 5% (v / v) </td></tr><tr height="20"><td height="20" style="height:20px;width:299px;"> PMSF </td><td style="width:299px;"> 0,1 mm </td></tr><tr height="20"><td colspan="2" height="20" style="height:20px;width:597px;"> Lavare tampone # 2 </td></tr><tr height="20"><td height="20" style="height:20px;width:299px;"> Tris-HCl, pH 8.0 </td><td style="width:299px;"> 25 mm </td></tr><tr height="20"><td height="20" style="height:20px;width:299px;"> NaCl </td><td style="width:299px;"> 150 mm </td></tr><tr height="20">2 &quot;height =&quot; &quot;style =&quot; 20 height: 20px; width: 597px; &quot;&gt; tampone di eluizione </td></tr><tr height="20"><td height="20" style="height:20px;width:299px;"> Tris-HCl, pH 8.0 </td><td style="width:299px;"> 25 mm </td></tr><tr height="22"><td height="22" style="height:22px;width:299px;"> SDS </td><td style="width:299px;"> 1% (w / v) </td></tr></tbody></table> Tabella 1. Buffer utilizzati nel presente studio.

<ol><li>Voss, S., Skerra, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutagenesis+of+a+flexible+loop+in+streptavidin+leads+to+higher+affinity+for+the+Strep-tag+II+peptide+and+improved+performance+in+recombinant+protein+purification%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Eng%22%5BJournal%5D)">Mutagenesis of a flexible loop in streptavidin leads to higher affinity for the Strep-tag II peptide and improved performance in recombinant protein purification.</a> Protein Eng. 10 (8), 975-982 (1997).</li>
<li>Schmidt, T. G., Skerra, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Strep-tag+system+for+one-step+purification+and+high-affinity+detection+or+capturing+of+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">The Strep-tag system for one-step purification and high-affinity detection or capturing of proteins.</a> Nat. Protoc. 2 (6), 1528-1535 (2007).</li>
<li>Junttila, M. R., Saarinen, S., Schmidt, T., Kast, J., Westermarck, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-step+Strep-tag+purification+for+the+isolation+and+identification+of+protein+complexes+from+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Single-step Strep-tag purification for the isolation and identification of protein complexes from mammalian cells.</a> Proteomics. 5 (5), 1199-1203 (2005).</li>
<li>Hafren, A., Hofius, D., Ronnholm, G., Sonnewald, U., Makinen, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HSP70+and+its+cochaperone+CPIP+promote+potyvirus+infection+in+Nicotiana+benthamiana+by+regulating+viral+coat+protein+functions%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">HSP70 and its cochaperone CPIP promote potyvirus infection in Nicotiana benthamiana by regulating viral coat protein functions.</a> Plant Cell. 22 (2), 523-535 (2010).</li>
<li>Jaskiewicz, M., Peterhansel, C., Conrath, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+histone+modifications+in+plant+leaves%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Detection of histone modifications in plant leaves.</a> J. Vis. Exp. (55), (2011).</li>
<li>Witte, C. P., Noel, L. D., Gielbert, J., Parker, J. E., Romeis, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+one-step+protein+purification+from+plant+material+using+the+eight-amino+acid+StrepII+epitope%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Rapid one-step protein purification from plant material using the eight-amino acid StrepII epitope.</a> Plant Mol. Biol. 55 (1), 135-147 (2004).</li>
<li>Werner, A. K., Sparkes, I. A., Romeis, T., Witte, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification%2C+biochemical+characterization%2C+and+subcellular+localization+of+allantoate+amidohydrolases+from+Arabidopsis+and+soybean%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">Identification, biochemical characterization, and subcellular localization of allantoate amidohydrolases from Arabidopsis and soybean.</a> Plant Physiol. 146 (2), 418-430 (2008).</li>
<li>Panwar, P., Deniaud, A., Pebay-Peyroula, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contamination+from+an+affinity+column%3A+an+encounter+with+a+new+villain+in+the+world+of+membrane-protein+crystallization%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallogr.+D.+Biol.+Crystallogr%22%5BJournal%5D)">Contamination from an affinity column: an encounter with a new villain in the world of membrane-protein crystallization.</a> Acta Crystallogr. D. Biol. Crystallogr. 68 (10), 1272-1277 (2012).</li>
<li>Hendrickson, W. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystal+structure+of+core+streptavidin+determined+from+multiwavelength+anomalous+diffraction+of+synchrotron+radiation%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Crystal structure of core streptavidin determined from multiwavelength anomalous diffraction of synchrotron radiation.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 86 (7), 2190-2194 (1989).</li>
<li>Bernot, K. M., Lee, C. H., Coulombe, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+small+surface+hydrophobic+stripe+in+the+coiled-coil+domain+of+type+I+keratins+mediates+tetramer+stability%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">A small surface hydrophobic stripe in the coiled-coil domain of type I keratins mediates tetramer stability.</a> J. Cell Biol. 168 (6), 965-974 (2005).</li>
<li>Singh, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Solution+structure+of+human+von+Willebrand+factor+studied+using+small+angle+neutron+scattering%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Solution structure of human von Willebrand factor studied using small angle neutron scattering.</a> J. Biol. Chem. 281 (50), 38266-38275 (2006).</li>
<li>Weldon, W. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+immunogenicity+of+stabilized+trimeric+soluble+influenza+hemagglutinin%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Enhanced immunogenicity of stabilized trimeric soluble influenza hemagglutinin.</a> PLoS One. 5 (9), (2010).</li>
<li>Wang, W., Barger, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Roles+of+quaternary+structure+and+cysteine+residues+in+the+activity+of+human+serine+racemase%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biochem%22%5BJournal%5D)">Roles of quaternary structure and cysteine residues in the activity of human serine racemase.</a> BMC Biochem. 12, 63(2011).</li>
<li>Rappsilber, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+beginning+of+a+beautiful+friendship%3A+cross-linking%2Fmass+spectrometry+and+modelling+of+proteins+and+multi-protein+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Struct.+Biol%22%5BJournal%5D)">The beginning of a beautiful friendship: cross-linking/mass spectrometry and modelling of proteins and multi-protein complexes.</a> J. Struct. Biol. 173 (3), 530-540 (2011).</li>
<li>Sousa, M. M., Steen, K. W., Hagen, L., Slupphaug, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibody+cross-linking+and+target+elution+protocols+used+for+immunoprecipitation+significantly+modulate+signal-to+noise+ratio+in+downstream+2D-PAGE+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Proteome+Sci%22%5BJournal%5D)">Antibody cross-linking and target elution protocols used for immunoprecipitation significantly modulate signal-to noise ratio in downstream 2D-PAGE analysis.</a> Proteome Sci. 9, 45(2011).</li>
</ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Il protocollo di cui sopra può essere usato per purificare qualsiasi proteina esca twin-Strep-tag di interesse e suoi complessi associati in qualsiasi tampone adatto che non contiene biotina o denaturanti forti. Nella versione attuale del protocollo, vincolante e lavaggio vengono eseguiti in condizioni relativamente restrittive in presenza di elevata sale e detergente non ionico. Anche se questo si traduce in meno sfondo, complessi proteici fragili possono dissociare in queste condizioni. Per conservare tali complessi m...

Negli ultimi anni, la tecnologia Strep-tag è stato ampiamente utilizzato in molti settori della ricerca biomedica, tra cui la proteomica e la biologia strutturale. Questa tecnologia purificazione della proteina, che si basa sulla fusione di proteine ​​ricombinanti ad una breve Strep-tag peptide, è maturata con l&#39;avvento di matrici di affinità che trasportano Strep-Tactin, una variante geneticamente di streptavidina con una migliore capacità di legame peptidico. 1, 2 proteine ​​di fusione contenenti due copie di Strep-tag II, designate twin-Strep-tag o SIII-tag, mostrano una maggiore affinità per le matrici Strep-Tactin di quelli contenenti un solo Strep-tag, garantendo la depurazione più efficiente delle proteine ​​ricombinanti e i loro partner di legame associate. Tuttavia, la maggiore affinità delle proteine ​​twin-Strep-tagged per Strep-Tactin ha anche il suo rovescio della medaglia. Eluizione concorrenziale di tali proteine ​​con eccesso di biotina può essere incompleta, con conseguente riduzione della resa di proteine ​​bersaglio. A mminerale efficiente alternativa è eluizione con SDS, ma porta alla contaminazione del campione indesiderato con Strep-Tactin rilasciato dalla resina, rendendo il test incompatibile con l&#39;analisi proteomica. Questo articolo presenta una tecnica per superare questa limitazione prima stabilizzazione del tetramero resina accoppiata di Strep-Tactin dal chimico cross-linking e quindi utilizzando SDS per eluire le proteine ​​twin-Strep-taggate e dei loro complessi associati dalla risultante resina reticolata. Così, sufficiente resa di proteine ​​può essere realizzata senza contaminazione del campione con Strep-Tactin, consentendo così un&#39;ulteriore analisi mediante spettrometria di massa. Il metodo è adatto per la purificazione di una proteina di fusione ricombinante con un SIII-tag-superficie esposta 3 o twin-Strep-tag (WSHPQFEK sequenza aminoacidica (GGGS) 3 WSHPQFEK e SAWSHPQFEK (GGGS) 2 GGSAWSHPQFEK, rispettivamente). La proteina può essere di origine animale, vegetale o batterica e può essere isolato da entrambi cellulare totalelisato o frazione organello arricchito. Come esempio, si descrive qui la purificazione di una proteina SIII-tag VPG-Pro di Potato virus A (PVA) 4 dalla frazione nucleare di PVA-infettati Nicotiana benthamiana. La frazione nucleare è stato isolato come descritto in precedenza 5, con le seguenti modifiche: cellule non sono state trattate con formaldeide, butirrato di sodio è stato sostituito in tutti i buffer con fluoruro di sodio 5 mM, inibitore della proteasi completo è stato sostituito con PMSF, Triton X-100 in concentrazione estrazione tampone # 2 è stato ridotto al 0,3% (v / v) e il pellet nucleare ottenuto mediante centrifugazione attraverso cuscino di saccarosio (tampone di estrazione # 3) è stato risospeso in 1,45 ml di tampone di legame pre-raffreddata e ruotata per 1,5 ore a 4 ° C. L&#39;estratto nucleare risultante contiene la proteina esca SIII-tag e complessi associati (campione proteina esca) è stato elaborato secondo il protocollo descritto di seguito (vedere paragrafo 2).

<table><tbody><tr><td>Bis(sulfosuccinimidyl) suberato (BS3), formato No-Weigh, 8 x 2 mg</td><td>Pierce/Thermo Scientific</td><td>21585</td><td><a href="http://www.fishersci.com">www.fishersci.com ATTENZIONE: Sostanza pericolosa. Provoca gravi irritazioni respiratorie, cutanee e oculari. Indossare guanti protettivi e protezione per gli occhi.</a></td></tr><tr><td>Resina Strep-Tactin MacroPrep (50% sospensione)</td><td>IBA</td><td>2-1505</td><td><a href="http://www.iba-lifesciences.com/">www.iba-lifesciences.com</a></td></tr><tr><td>Filtro per provette da centrifuga Spin-X, membrana in acetato di cellulosa, dimensione dei pori 0,45 &mu; m, non sterile</td><td>Costar (Corning)</td><td>8163</td><td><a href="http://www.corning.com/lifesciences/">www.corning.com/lifesciences/</a></td></tr><tr><td>Tubi a delfino</td><td>Costar (Corning)</td><td>3213</td><td><a href="http://www.corning.com/lifesciences/">www.corning.com/lifesciences/</a></td></tr><tr><td>Avidin&nbsp;</td><td>IBA</td><td>2-0204</td><td><a href="http://www.iba-lifesciences.com/">www.iba-lifesciences.com</a></td></tr></tbody></table>

one-step purificazione di proteine ​​twin-strep-taggate e dei loro complessi su strep-tactin resina reticolato con bis (sulfosuccinimidil) suberato (bs3)

One-step Purification of Twin-Strep-tagged Proteins and Their Complexes on Strep-Tactin Resin Cross-linked With Bis(sulfosuccinimidyl) Suberate (BS3)

Purificazione per affinità di proteine ​​di fusione Strep-targhetta di resine che trasportano una streptavidina allestita (Strep-Tactin) è diventato un metodo ampiamente utilizzato per l&#39;isolamento di complessi proteici in condizioni fisiologiche. Proteine ​​di fusione contenenti due copie di Strep-tag II, designate twin-Strep-tag o SIII-tag, hanno il vantaggio di una maggiore affinità per Strep-Tactin rispetto a quelli che contengono un solo Strep-tag, permettendo così più efficiente purificazione di proteine. Tuttavia, questo vantaggio è compensato dal fatto che eluizione delle proteine ​​twin-Strep-taggate con biotina può essere incompleta, portando a basso recupero di proteine. Il recupero può essere notevolmente migliorata utilizzando denaturazione eluizione con sodio dodecil solfato (SDS), ma questo porta a campionare contaminazione con Strep-Tactin rilasciato dalla resina, rendendo il saggio incompatibile con analisi proteomica valle. Per superare questa limitazione, abbiamo sviluppato un metodo in base al quale tetramero resina accoppiata di Strep-Tactinè prima stabilizzato da covalente reticolazione con Bis (Sulfosuccinimidil) suberato (BS3) e la resina reticolata risultante viene poi utilizzato per purificare bersaglio complessi proteici in un singolo passaggio di purificazione batch. Eluizione efficiente con SDS assicura buon recupero proteina, mentre l&#39;assenza di contaminazione Strep-Tactin permette valle proteina analisi mediante spettrometria di massa. Come un proof of concept, descriviamo qui un protocollo per la purificazione della proteina virale SIII-tagged VPG-Pro da nuclei di N. infettato da virus piante benthamiana utilizzando la resina di polimetacrilato Strep-Tactin reticolato con BS3. Lo stesso protocollo può essere utilizzato per purificare qualsiasi proteina twin-Strep-tag di interesse e caratterizzare suoi partner di legame fisiologiche.

La procedura di purificazione è schematicamente illustrato in Figura 1, con una rappresentazione di problemi associati con altri metodi di purificazione esistenti. <img alt="Figura 1" fo:content-width="5.5in" src="/files/ftp_upload/51536/51536fig1highres.jpg" width="650" /> Figura 1. Rappresentazione schematica della procedura di purificazione. Il flusso di lavoro comprende stabilizzazione della Strep-Tactin tetrame...

Un metodo è descritto per la purificazione efficiente di proteine ​​di fusione twin-Strep-tag e dei loro complessi specifiche in materia di streptavidina modificato (Strep-Tactin) resina covalentemente reticolato con Bis (Sulfosuccinimidil) suberato (BS3). Il metodo ha i vantaggi di velocità veloce, buon recupero proteina bersaglio ed elevata purezza, ed è compatibile con la successiva analisi mediante spettrometria di massa.

One-step purificazione di proteine ​​Twin-Strep-taggate e dei loro complessi su Strep-Tactin resina reticolato con Bis (Sulfosuccinimidil) suberato (BS3)

Affinity purification of Strep-tagged fusion proteins on resins carrying an engineered streptavidin (Strep-Tactin) has become a widely used method for ...

Ciao, sono Christina McKennan dell'Università di Helsinki, in Finlandia. Una delle sfide nella caratterizzazione di un particolare complesso proteico è determinarne la composizione molecolare. Ciò richiede lo sviluppo di metodi per isolare e purificare il complesso dal suo ambiente cellulare.L'area di ricerca sui microrganismi riguarda le interazioni tra virus vegetali e ospiti, e pertanto siamo interessati ai diversi complessi proteici nucleari virali formati durante l'infezione. In passato, abbiamo studiato con successo questi complessi utilizzando una purificazione basata su affinità con biotina, da noi condotta. La doppia biotina si è rivelata una delle migliori opzioni.Tuttavia, abbiamo osservato alcune limitazioni nel suo utilizzo, una delle quali è il basso rendimento, e pertanto abbiamo voluto migliorare questo metodo. Ciao, mi chiamo Mata e ti guiderò attraverso il protocollo sperimentale. Ma prima, lascia che ti fornisca una panoramica del metodo.Utilizziamo perle Strep-Tactin Macro Prep per purificare complessi specifici tra proteine doppio marcate con il tag Strep e i loro partner di legame fisiologici. Il tetramero marcati con il tag Strep è mostrato in verde, la prote

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Qui si descrive una nuova tecnica di proteomica quantitativa per identificare i complessi proteici in Saccharomyces cerevisiae. In questo studio, abbiamo utilizzato il metodo SILAC insieme purificazione di affinità seguita dalla spettrometria di massa tandem per identificare con elevata specificità dei partner legame di una proteina ER, Scs2p.

L&#39;identificazione di complessi proteici con la proteomica quantitativa in S. cerevisiae

Un romanzo e altamente efficiente in due fasi cromatografia di affinità protocollo è stato sviluppato ed è descritto in dettaglio. Il metodo si basa su un tag purificazione con due affinità intrinseca ed è applicabile ad una vasta gamma di proteine ​​bersaglio con proprietà diverse.

Purificazione delle proteine ​​ortogonali Facilitato da una piastrina Affinity Bispecific

Tandem purificazione per affinità è un valido approccio per l'individuazione di partner di legame proteico. Come prova di concetto, questa metodologia è stata applicata al ben caratterizzato eIF4E fattore di inizio traduzione di co-precipitato i fattori coinvolti in cellule ospiti di inizio di traduzione. Questo metodo è facilmente adattabile a qualsiasi proteina cellulare o virale.

Individuazione di partner proteine ​​interagenti mediante Tandem Affinity Purification

Purificazione di affinità di proteine ​​marcate, in combinazione con la spettrometria di massa (APMS) è un potente metodo per la mappatura sistematica delle reti di interazione di proteine ​​e per indagare la base meccanicistica dei processi biologici. Qui, descriviamo un ottimizzato sequenziale peptide affinità (SPA) APMS procedura sviluppata per il...

Identificazione di complessi proteici in<em&gt; Escherichia coli</em&gt; Con sequenziale purificazione per affinità Peptide in combinazione con Tandem Mass Spectrometry

Fonte: Murata, T., et al. Purificazione di una proteina ad alta massa molecolare in Streptococcus mutans. J. Vis. Exp. (2019)Questo video mostra una procedura passo-passo per la purificazione di una proteina marcata con poliistidina secreta da Streptococcus mutans.

Una procedura per la purificazione di una proteina marcata con poliistidina da Streptococcus mutans

Questo video dimostra la purificazione di affinità tandem, una tecnica per purificare complessi proteici da cellule eucariotiche per studiare l'interazione proteina-proteina. Il complesso contiene due proteine marcate con diversi tag epitopici. Dopo la purificazione del complesso utilizzando due resine con un'affinità per i due diversi tag in modo sequenziale, la presenza di entrambe le proteine nell'eluito conferma l'interazione tra le due.

Saggio di purificazione di affinità tandem per studiare le interazioni proteina-proteina

Il metodo di purificazione per affinità tandem (TAP) è stato ampiamente utilizzato per isolare complessi nativi da estratti cellulari, principalmente eucariotici, per la proteomica. Qui, presentiamo un protocollo del metodo TAP ottimizzato per la purificazione di complessi nativi per studi strutturali.

Purificazione di Native Complessi di studio strutturale utilizzando un metodo Tag Tandem Affinity

Qui si descrivono i protocolli di perturbare le cellule di mammifero mediante fresatura a stato solido ad una temperatura criogenica, la produzione di un estratto cellulare dalla polvere di cellule risultante, e isolare complessi proteici di interesse per cattura affinità su perline paramagnetici micron scala anticorpi accoppiati.

Proteine ​​Complesso affinità Acquisizione da cellule di mammifero Cryomilled

Descriviamo qui un nuovo, robusto ed efficiente metodo di purificazione di affinità tandem (TAP) per l'espressione, l'isolamento e la caratterizzazione di complessi proteici da cellule eucariotiche. Questo protocollo potrebbe essere utilizzato per la caratterizzazione biochimica di complessi discreti e per l'identificazione di nuovi interattori e modificazioni post-traduzionali che ne regolano la funzione.

Tandem Affinity Purification di complessi proteici da cellule eucariotiche

Descritto qui è un metodo semplice per la purificazione di un prodotto genetico in Streptococcus mutans. Questa tecnica può essere vantaggiosa nella purificazione delle proteine, in particolare le proteine della membrana e le proteine ad alta massa molecolare, e può essere utilizzata con varie altre specie batteriche.

Purificazione di una proteina di massa molecolare elevata in Streptococcus mutans

La ricostituzione in vitro delle proteine citoscheletriche è uno strumento vitale per comprendere le proprietà funzionali di base di queste proteine. Il presente articolo descrive un protocollo per purificare e valutare la qualità dei complessi di settina ricombinanti, che svolgono un ruolo centrale nella divisione e migrazione cellulare.

Purificazione e controllo qualità di complessi di septina ricombinanti per la ricostituzione cellula-free

Scopri la purificazione one-step di proteine Twin-Strep-taggate e complessi su resina Strep-Tactin reticolata con BS3. Questo metodo rapido garantisce elevata purezza e compatibilità con la spettrometria di massa per l'analisi biochimica.

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One-step purificazione di proteine ​​Twin-Strep-taggate e dei loro complessi su Strep-Tactin resina reticolato con Bis (Sulfosuccinimidil) suberato (BS3)

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