In Vitro aggregazione Assays Utilizzando iperfosforilata Tau Protein
2 gennaio 2015
Proteine tau non modificate e iperfosforilata sono stati utilizzati in due metodiche di aggregazione in vitro per rivelare la cinetica di aggregazione veloce iperfosforilazione-dipendente. Questi test aprono la strada per schermi future per i composti che possono modulare la propensione di tau iperfosforilata a formare fibrille che sono alla base della progressione della malattia di Alzheimer.
L'obiettivo generale di questa procedura è quello di monitorare e confrontare la cinetica di aggregazione di specie proteiche tau non modificate e iperfosforilate. Ciò si ottiene generando prima la proteina tau non modificata e iperfosforilata dal sistema catalizzatore assistito da cerniere. Il secondo passo consiste nell'impostare i saggi di aggregazione in modo che siano adatti a uno dei due diversi strumenti.
Il processo di aggregazione della tau è monitorato dalla fluorescenza di due diversi tio. La flavina muore, la flavina S e la flavina T. Il passo finale consiste nel tracciare e confrontare le curve di aggregazione. In definitiva, i cambiamenti cinetici della fluorescenza della tioflavina da specie di legame a specie TA aggregate sono utilizzati per mostrare l'aumento dipendente dall'iperfosforilazione della fibrillazione tau in vitro.
Ciao.Benvenuti nel nostro articolo JOV. Saggi di aggregazione in vitro utilizzando la proteina iper fosfo-tau. Mi chiamo Minko e gli esperimenti saranno condotti e dimostrati in modo indipendente.
E per questo protocollo, un buffer di aggregazione ragionevolmente fresco realizzato nell'ultimo mese. Poco prima del suo utilizzo aggiungere DIO tre etolo a un millimolare è necessario anche un tè Theo Flavin filtrato o una soluzione brodo S. Soluzione stock Hein, entrambe conservabili a meno 20 gradi Celsius e proteine dell'asciugamano conservate a meno 80 gradi Celsius.
Tirare l'asciugamano sul ghiaccio, quindi regolarne la concentrazione utilizzando il tampone di aggregazione secondo necessità per coerenza. Abbassare l'asciugamano con il tampone di aggregazione e 20, 800 g per 10 minuti a quattro gradi Celsius. Ora trasferisci il supinato in un'altra provetta e tienilo in ghiaccio fino al momento di assemblare la reazione di aggregazione.
Preparare la miscela di aggregazione in provette micro centri da 1,5 millilitri. Secondo la tabella, 100 microlitri sono sufficienti per un'aliquota di reagenti. Calcolare il volume totale in base al numero di reazioni e aumentarlo del 10% per tenere conto degli errori di pipettaggio.
Se necessario, il pepe può essere sostituito da acido raonico o da un tampone di aggregazione. Mescolare le reazioni per inversione e trasferirle a 37 gradi Celsius senza vegetazione. Dopo ogni 24 ore, reintegrare le reazioni con un millimolare supplementare di DTT per garantire un ambiente riducente per misurare la fluorescenza.
Riscaldare il fluorimetro spettrale per circa 10 minuti. Ciò migliorerà la coerenza delle misurazioni nel software del computer. Selezionare la modalità di visualizzazione in tempo reale che si trova nel centro di controllo dello strumento.
Impostare la lunghezza d'onda di eccitazione a 450 nanometri con la fessura a due nanometri e impostare la lunghezza d'onda di emissione a 510 nanometri con la fessura di cinque nanometri. Quindi torna al centro di controllo dello strumento e scegli l'analisi a lunghezza d'onda costante. Premere il tasto Aggiungi nel fotogramma superiore per aggiungere una serie di lunghezze d'onda.
Impostare i parametri di acquisizione dell'errore standard su uno e le prove massime su tre. Quindi fare clic su Aggiungi. Quindi fare clic su vai per aprire la finestra di visualizzazione dei dati.
Ora nella finestra di visualizzazione dei dati, fare clic su avvia azione per aprire la nuova finestra di dialogo del campione e scegliere sconosciuto per il tipo di campione. Quindi preparare le reazioni per effettuare misurazioni ogni 100 microlitri a 98. Microlitri di tampone di aggregazione e due microlitri di tre millimolari di flavina S o T pipettare la miscela più volte per garantire una buona miscelazione.
Trasferire tutti i 200 microlitri di una miscela in un FA tre qve e caricarlo in posizione. Quindi leccare correre per raccogliere i dati sulla fluorescenza Dopo aver rimosso la soluzione dal vete, sciacquarla tre volte con acqua distillata e asciugarla in un flusso d'aria. Questo test include il colorante fluorescente nella reazione di aion, che consente misurazioni continue ed è meglio farlo con un lettore automatico di piastre a pozzetti per tappeti.
Un normale funzionamento del parametro for è limitato anche dalla velocità di funzionamento manuale. Impostare la miscela di aggregazione in una piastra nera opaca a 96 pozzetti. Con un volume di 360 microlitri un pozzo di 200 microlitri è sufficiente per ogni misurazione del punto temporale.
Miscelare bene ogni reazione con il pipettaggio. Incubare la piastra a 96 pozzetti a 37 gradi Celsius e ogni 24 ore aggiungere un millimolare supplementare di DTT per garantire un ambiente riducente in ogni momento. Per una misurazione, accendere il lettore di micropiastre multimodale e il computer con almeno 10 minuti di anticipo nel software del computer.
Impostare la temperatura a 37 gradi Celsius e selezionare la modalità di intensità della fluorescenza. Quindi impostare la lunghezza d'onda di eccitazione a 450 nanometri e la lunghezza d'onda di emissione a cinque e 10 nanometri. Inserire la piastra a 96 pozzetti nel cassetto e premere il tasto di lettura.
Dopo aver effettuato le misurazioni, rimettere immediatamente la piastra nell'incubatore prima di analizzare i dati, il test in modalità continua può essere eseguito utilizzando uno spettrofotometro compatto per questo test. Preparare la miscela di aggregazione in provette da microcentrifuga da 1,5 millilitri. 200 microlitri di reazioni sono sufficienti per misurare un punto temporale.
Capovolgere i tubi per mescolare. Imposta le reazioni a 37 gradi Celsius o a temperatura ambiente e aggiungi un millimolare supplementare di DTT ogni 24 ore per effettuare le misurazioni. Impostare l'urometro e il software come fatto per il test senza die terminale.
Trasferire l'intera miscela a un veterinario e posizionarla nel portacampioni nello scomparto del campione e chiudere il coperchio. Fare clic su Esegui per raccogliere i dati di fluorescenza agli intervalli di tempo appropriati. Se questo intervallo è breve, ad esempio 30 o 60 secondi, è possibile lasciare il Q vet nella macchina tra una misurazione e l'altra fino al raggiungimento dell'ultimo punto temporale.
Al termine, rimettere la reazione dal veterinario alla provetta del campione e rimettere la provetta nell'incubatrice. Appoggiare il vete come precedentemente indicato utilizzando tau ricombinante e P tal. Sono stati messi a punto due diversi protocolli per confrontare la cinetica di aggregazione di tau e ptal, sfruttando la forte emissione fluorescente della flavina t e s in seguito al legame con aggregati proteici amiloidi, tra cui tau e p tal, con o senza il colorante fluorescente.
Nella reazione di aggregazione, c'è stato un aumento consistente dell'aggregazione tau mediante iperfosforilazione. Tipicamente, T e p tal liga aumentano rapidamente entro i primi 30 minuti prima di un rallentamento significativo, tra cui la flavina. T nelle reazioni di aggregazione causano un ritardo significativo nel tasso di aggregazione.
Sia Theof Flavian s che t si sono avvicinati a un altopiano dopo aver reagito per 160 minuti. La bioflavina, d'altra parte, non ha causato un apprezzabile rallentamento dell'aggregazione. Seguendo questa procedura, il sistema nervoso centrale aggiuntivo alle isoforme o ad altre proteine inclini all'aggregazione nella neurodegenerazione, likein, può essere eseguito utilizzando il test al fine di comprendere il contributo della proteinizzazione nella patogenesi dopo il suo sviluppo.
Questa tecnica di preparazione di un modo PA per la ricerca sul campo, numerose malattie per esplorare le nostre terapie e lo sviluppo di farmaci.
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Panoramica
Questo studio indaga la cinetica di aggregazione delle proteine tau non modificate e iperfosforilate utilizzando saggi in vitro. I risultati evidenziano il miglioramento dell'aggregazione di tau dipendente dall'iperfosforilazione, che è significativo per comprendere la progressione della malattia di Alzheimer.
Componenti Principali dello Studio
Area di Scienza
- Neuroscienza
- Biochimica
- Ricerca sulla Malattia di Alzheimer
Sfondo
- Le proteine tau sono fondamentali per la stabilizzazione dei microtubuli nei neuroni.
- L'iperfosforilazione della tau è associata a malattie neurodegenerative.
- Comprendere l'aggregazione della tau è essenziale per sviluppare strategie terapeutiche.
- Gli saggi in vitro possono fornire informazioni sulla cinetica dell'aggregazione della tau.
Obiettivo dello Studio
- Confrontare la cinetica di aggregazione delle proteine tau non modificate e iperfosforilate.
- Stabilire un metodo per lo screening di composti che possono influenzare l'aggregazione della tau.
- Chiarire il ruolo dell'iperfosforilazione nell'aggregazione della tau.
Metodi Utilizzati
- Generazione di proteine tau non modificate e iperfosforilate utilizzando un sistema catalitico assistito da zip.
- Impostazione di saggi di aggregazione adatti a diversi strumenti.
- Monitoraggio dell'aggregazione della tau utilizzando la fluorescenza dei coloranti tioflavin.
- Tracciamento e confronto delle curve di aggregazione per valutare i cambiamenti cinetici.
Risultati Principali
- La tau iperfosforilata mostra una cinetica di aggregazione più rapida rispetto alla tau non modificata.
- Le misurazioni della fluorescenza correlano con i tassi di aggregazione della tau.
- Lo studio fornisce una base per il futuro screening di composti modulatori della tau.
- I risultati contribuiscono alla comprensione dei meccanismi molecolari alla base della malattia di Alzheimer.
Conclusioni
- L'iperfosforilazione migliora significativamente la cinetica di aggregazione della tau.
- Gli saggi in vitro sono efficaci per studiare il comportamento della proteina tau.
- La ricerca futura può basarsi su questi risultati per esplorare interventi terapeutici.
Domande Frequenti
Executive Industry Relevance
This assay enables direct evaluation of hyperphosphorylated tau aggregation kinetics, a key pathological driver in Alzheimer's disease and related tauopathies. By using disease-relevant, post-translationally modified tau, the method improves target validation confidence and supports early de-risking of therapeutic hypotheses. It provides a scalable, quantitative platform for screening compounds that modulate tau fibrillation, aligning with preclinical target engagement and lead identification workflows.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates the therapeutic hypothesis that hyperphosphorylation drives pathogenic tau aggregation.
- Operational Value: Enables side-by-side comparison of modified and unmodified tau to isolate phosphorylation-dependent effects.
- Predictive Value: Supports target confidence by linking a defined molecular modification to measurable fibrillogenesis.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Uses thioflavin S and T fluorescence to quantitatively monitor aggregation kinetics in real time.
- Operational Value: Compatible with microplate readers and spectrophotometers, enabling scalable, reproducible measurements.
- Assay Readiness: Supports high-throughput adaptation for compound library screening against hyperphosphorylated tau.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Uses recombinant hyperphosphorylated tau to model disease-relevant protein conformation.
- Preclinical Relevance: Provides a mechanistic readout for target engagement in neurodegeneration programs.
- Risk Mitigation: Enables early assessment of compound effects on tau aggregation before cellular or in vivo testing.
Pipeline & Workflow Integration
The assay fits within the early discovery continuum, supporting target validation through mechanistic de-risking and enabling hit identification in screening cascades. Its quantitative output supports go/no-go decisions based on target-specific biochemical activity.
- Discovery Biology: Tests the hypothesis that hyperphosphorylation enhances tau fibrillation, a core mechanism in tauopathy pathogenesis.
- Screening: Generates dose-responsive, kinetic data suitable for evaluating compound effects on aggregation rates.
- Analytics: Produces fluorescence-based aggregation curves that allow comparison of lag time, growth rate, and plateau values.
- Translational Research: Connects biochemical target modulation to disease-relevant protein pathology.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable biochemical assay platform for tau-targeted programs across multiple targets and modalities.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity by isolating the impact of tau hyperphosphorylation on aggregation.
- Operational Value: Standardized reagent preparation and instrument settings ensure reproducibility across labs and timepoints.
- Strategic Value: Improves prediction of target modulation efficacy, reducing failure risk in later preclinical stages.
- Portfolio Impact: Enables data-driven prioritization of compounds based on target-specific biochemical activity.
Implementation Considerations
- Requires expertise in protein handling, fluorescence spectroscopy, and aggregation assay design.
- Dependent on access to fluorimeters or microplate readers with configurable excitation/emission settings.
- Necessitates standardized reagent preparation, including fresh aggregation buffer and DTT supplementation.
- Must account for variability in protein aggregation behavior across batches and storage conditions.
- Limited to in vitro systems; does not capture cellular clearance, seeding, or neurotoxicity mechanisms.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
1:19
Preparations
2:14
Terminal Assay with No Dye
4:44
Continual Mode Assay Using a Plate Reader With Dye
6:14
Continual Mode Assay Using a Compact Spectrofluorometer With Dye
7:33
Results: Tau Aggregation Assayed by Different Modes and Instruments
8:34
Conclusion
