A Step Beyond BRET: Fluorescenza da Unbound eccitazione di luminescenza (FUEL)
23 maggio 2014
Ampliare la fondazione e l'applicabilità di fluorescenza da Unbound eccitazione da luminescenza (FUEL) attraverso la rilevazione dei principi rilevanti e dimostrando la sua compatibilità con un gran numero di fluorofori e condizioni di anticorpi mirati.
L'obiettivo generale del seguente esperimento è dimostrare la semplicità del combustibile e osservare la generazione di fotoni rossi dovuta a eventi di emissione da eccitazione radiativa. Ciò si ottiene combinando batteri bioluminescenti e nanoparticelle luminescenti per la produzione di combustibile. Successivamente, un lettore a piastre per bioluminescenza viene utilizzato per osservare i fotoni rossi risultanti; i risultati ottenuti mostrano che una quantità considerevole di fotoni rossi può essere prodotta quando i batteri bioluminescenti e i punti quantici sono mantenuti nella stessa soluzione.
In base all'aumento osservato nel flusso di fotoni rossi, le implicazioni di questa tecnica si estendono fino a mettere in discussione il paradigma del trasferimento di ingresso residenziale NCE o di Brett. Ciò è spesso riportato in letteratura a partire da colonie singole. Su piastre di coltura standard, avviare colture notturne di batteri luminescenti.
Qui, Vibrio Fisher Eye sono stati utilizzati nel giorno dell'esperimento. Avviare colture secondarie fresche e lasciarle crescere fino al raggiungimento di una densità ottica (OD) a 600 nanometri compresa tra 1 e 1,5. Utilizzare batteri in fasi di crescita simili, in cui producono segnali intensi, per ottenere risultati confrontabili.
Unire aliquote di 100 microlitri da ciascuna soluzione con cinque microlitri del marcatore fluorescente, QD 7 0 5 o soluzione salina fisiologica. Successivamente, aggiungere la miscela a 895 microlitri di soluzione salina fisiologica in cuvette spettroscopiche standard. Posizionare le cuvette riempite in un'apparecchiatura di imaging bioluminescente per animali interi ed effettuare le misurazioni con i relativi set di filtri appropriati.
Qui è stato utilizzato il filtro di emissione da 710 a 730 nanometri per eseguire il carburante a diverse distanze. Riempire due cuvette fotometriche in plastica a volume ridotto con 50 microlitri di QD 7 0 5 oppure con 97,2 microlitri di microsfere di polistirene non fluorescenti da 48 nanometri, in un volume totale di un millilitro di soluzione salina fisiologica. Ciò garantisce un’area superficiale solida simile per volume totale tra le due entità.
Preparare una provetta fonte luminosa avvolgendo una terza provetta con nastro adesivo nero standard o un altro materiale opaco in grado di bloccare la luce. Preparare con attenzione due finestre ottiche identiche su lati opposti della provetta. Aggiungere un’aliquota di un millilitro di Vibrio fii o di un’altra coltura proveniente da un’abbondante sotto-colture nella provetta fonte luminosa e coprirla con un materiale opaco come carta nera per ridurre al minimo qualsiasi contaminazione luminosa.
Successivamente, posizionare direttamente le cuvette precedentemente riempite su entrambi i lati della sorgente luminosa vete nell'imager. Visualizzare i tre Q vets attraverso i filtri di emissione appropriati, come il filtro per la luce totale e i filtri di emissione da 710 a 730 nanometri, con tempi di esposizione rispettivamente di 10, 30 e 30 secondi. Acquisire un'immagine di fluorescenza con eccitazione da 450 a 480 nanometri e emissione da 710 a 730 nanometri per confermare la posizione del QD 7 0 5.
Riposizionare entrambe le provette esterne Q a distanze ulteriori equivalenti rispetto alla provetta centrale Q. Quindi visualizzare ed acquisire un'immagine di fluorescenza prima di ripetere nuovamente questo procedimento fino a raggiungere una distanza finale fronte a fronte di tre centimetri. Riempire due cuvette a volume ridotto con soluzioni di un millilitro contenenti, in una, un fluoroforo quattro o una nanoparticella fluorescente di interesse e, nell'altra, soluzione salina fisiologica con nanoparticelle non fluorescenti come controllo negativo.
Aggiungere un’aliquota di un millilitro di Vibrio FII fresco o di altri batteri luminescenti a una terza provetta oscurata contenente due finestre ottiche fisicamente uguali situate su lati opposti; coprire la provetta con una sostanza opaca come un pezzo di carta nera a una distanza breve ma uguale. Posizionare le due provette a volume ridotto su entrambi i lati della provetta Q oscurata e osservare attraverso i filtri appropriati; in questo caso è stata utilizzata una distanza di 0,7 centimetri. Ripetere con l’altra coppia di forze del qd 7 0 5 sui batteri.
Si osserva un aumento sostanziale del numero di fotoni rossi rispetto ai soli batteri. Il trasferimento di energia può avvenire a grandi distanze in assenza di qualsiasi assorbitore. Questa dipendenza dalla distanza può essere caratterizzata dalla legge dell'inverso del quadrato.
Per sorgenti puntiformi. L'indirizzamento della flora fours alla membrana batterica sembra avere un effetto minimo o nullo sulla quantità complessiva di segnale del carburante generato. In questo contesto, il carburante indirizzato viene mantenuto anche dopo diverse fasi di lavaggio.
Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere un'idea chiara su come ricostituire il combustibile in base a diverse modalità al fine di generare fotoni rossi mediante eventi di emissione da eccitazione radiativa.
Panoramica
Questo studio esplora la tecnica FUEL (Fluorescenza mediante Eccitazione non Legata da Luminescenza), dimostrandone la compatibilità con diversi fluorofori e condizioni con anticorpi mirati. L'esperimento illustra la generazione di fotoni rossi attraverso l'interazione tra batteri bioluminescenti e nanoparticelle luminescenti.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Tecniche di fluorescenza
- Bioluminescenza
- Interazioni delle nanoparticelle
Sfondo
- FUEL è una nuova tecnica fluorescente.
- Utilizza batteri bioluminescenti per la generazione di fotoni.
- La compatibilità con vari fluorocromi è fondamentale per la sua applicazione.
- Comprendere la generazione di fotoni può influenzare la ricerca sulla fluorescenza.
Scopo dello studio
- Dimostrare la semplicità della tecnica FUEL.
- Osservare la generazione di fotoni rossi da interazioni bioluminescenti.
- Valutare le implicazioni della FUEL sui paradigmi di fluorescenza esistenti.
Metodi Utilizzati
- Combinazione di batteri bioluminescenti e nanoparticelle luminiscenti.
- Utilizzo di un lettore a piastre per bioluminescenza per la misurazione dei fotoni.
- Preparazione di soluzioni con diverse distanze per l'osservazione dei fotoni.
- Visualizzazione mediante filtri di emissione specifici per convalidare i risultati.
Risultati principali
- È stata osservata una produzione sostanziale di fotoni rossi.
- È stata caratterizzata la dipendenza della generazione di fotoni dalla distanza.
- Il targeting dei fluorocromi sulle membrane batteriche ha mostrato un effetto minimo sul segnale.
- FUEL può funzionare efficacemente a lunghe distanze senza assorbitori.
Conclusioni
- FUEL è una tecnica promettente per le applicazioni di fluorescenza.
- Mette in discussione i paradigmi esistenti nella ricerca sulla fluorescenza.
- Un'ulteriore esplorazione di FUEL può migliorare gli studi sulla bioluminescenza.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
FUEL estende la distanza operativa dell'eccitazione basata sulla luminescenza oltre i limiti nanometrici della BRET, permettendo la generazione di segnali su scale da micrometri a centimetri senza l'uso di assorbitori. Questa capacità colma un'importante lacuna spaziale nell'imaging molecolare, sostenendo applicazioni in cui i metodi tradizionali di trasferimento di energia risultano inefficaci. Per la ricerca e sviluppo nel settore biofarmaceutico, FUEL offre un approccio scalabile e compatibile con etichette per esplorare interazioni biologiche all'interno di architetture cellulari o tissutali più estese, migliorando la validazione degli obiettivi in sistemi complessi.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Target
- Valore scientifico: Consente l'analisi di interazioni molecolari a distanze inaccessibili alla BRET, supportando la validazione degli obiettivi in contesti di biomarcatori sparsi o diffusi.
- Valore operativo: Utilizza una semplice miscelazione di fonti bioluminescenti e fluorofori, riducendo la complessità del saggio e permettendo la compatibilità con schermate ad alto rendimento.
- Valore predittivo: Fornisce letture quantitative di fotoni rossi correlate alla vicinanza delle sonde, facilitando l'identificazione di composti promettenti e la riduzione dei rischi meccanicistici.
Sviluppo di screening e saggi
- Valore scientifico: Compatibile con diversi fluorofori e nanoparticelle, consente una progettazione flessibile del saggio per varie classi di bersagli.
- Valore operativo: La generazione del segnale persiste dopo i passaggi di lavaggio, favorendo un rilevamento riproducibile in campioni eterogenei.
- Prontezza del saggio: Funziona in soluzione salina fisiologica standard senza l'uso di tamponi personalizzati, facilitando l'integrazione in piattaforme di screening esistenti.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Continuità traslazionale: Consente l'acquisizione di immagini su campioni interi a distanze estese, supportando l'estrapolazione da modelli in vitro a modelli in vivo.
- Allineamento del biomarcatore: FUEL mirato ad anticorpi mantiene il segnale dopo il legame, permettendo di monitorare l'interazione specifica con la proteina bersaglio su scale spaziali più ampie.
- Limitazione del rischio: Il segnale dipendente dalla distanza segue la legge dell'inverso del quadrato, fornendo un quadro quantitativo prevedibile per il confronto tra studi diversi.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
FUEL si inserisce nel percorso di scoperta che va dallo screening iniziale dell'interazione con il bersaglio fino alla validazione preclinica, in particolare nei casi in cui è necessaria una risoluzione spaziale superiore alla semplice prossimità molecolare.
- Biologia della scoperta: Supporta la verifica di ipotesi sulla localizzazione del bersaglio e sulla formazione di complessi in ambienti cellulari in cui i sonde potrebbero non essere a contatto diretto.
- Screening: Permette la standardizzazione dei saggi attraverso un segnale regolabile in base alla distanza, migliorando la riproducibilità tra diversi laboratori.
- Analisi: Genera un flusso quantificabile di fotoni rossi misurabile mediante comuni sistemi di imaging bioluminescente, consentendo l'analisi comparativa tra diverse condizioni.
- Ricerca traslazionale: Collega eventi di legame in vitro al rilevamento del segnale a livello tissutale, supportando la validazione di biomarcatori in modelli preclinici.
- Riutilizzo aziendale: Richiede soltanto una sorgente bioluminescente e un fluoroforo, rendendolo una tecnologia portatile e a basso costo applicabile in numerosi progetti.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Estende il campo spaziale dei saggi basati sulla luminescenza, riducendo i falsi negativi nei bersagli a bassa abbondanza o distribuiti in modo diffuso.
- Valore operativo: Elimina la necessità di coniugazione molecolare precisa o di stretta vicinanza, semplificando la preparazione dei reagenti e riducendo la variabilità.
- Valore strategico: Migliora la sicurezza nelle decisioni di avanzamento o interruzione consentendo il rilevamento di bersagli che sfuggono ai saggi basati su BRET a causa di vincoli di distanza.
- Impatto sul portafoglio: Supporta la priorizzazione basata sulla gestione del rischio fornendo una validazione ortogonale dell'interazione con il bersaglio in matrici biologiche complesse.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede l'accesso a colture batteriche bioluminescenti o a sistemi luminiscenti ingegnerizzati.
- Dipende da un'attrezzatura standard per l'imaging della bioluminescenza dotata di filtri adeguati per emissioni spostate verso il rosso (ad esempio, 710–730 nm).
- Necessita dell'ottimizzazione della concentrazione della sonda e dell'intensità della sorgente per evitare la saturazione del segnale a brevi distanze.
- Deve tenere conto del decadimento secondo la legge dell'inverso del quadrato nell'interpretazione dell'intensità del segnale a diverse distanze.
- È limitato dalla luminescenza di fondo in campioni autofluorescenti o dispersivi alla luce, richiedendo controlli appropriati.
