Name: Aip1p Dynamics sono alterati dalla R256H mutazione in actina (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-07-30T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 57 s
Description: Esplora la dinamica di Aip1p nel lievito con actina mutante R256H mediante microscopia a fluorescenza TIRF. Questo metodo permette di visualizzare e quantificare i movimenti delle proteine leganti l'actina in vivo.

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Gli autori ringraziano Peter Rubenstein per una discussione utile e consulenza tecnica e David Pellman per il clone PB1996 originale. Questo lavoro è stato sostenuto da un finanziamento della March of Dimes e finanziamenti dal Ride for Kids.

1. Clonazione nella PB1996 plasmidi <ol><li> Progettazione e ordinare primer di DNA da un oligonucleotide società di produzione che fiancheggiano la sequenza bersaglio e contenere siti di restrizione unici nel plasmide principale selezionato. NOTA: In questo caso, i primer sono stati progettati per amplificare le 400 coppie di basi all&#39;estremità 5 &#39;della sequenza Aip1. Il sito di restrizione XhoI è stato incorporato nel fondo circa 20 bp prima sequenza Aip1, e XmaI era inclusa circa 20 bp dopo la sequenza bersaglio Aip1. Il plasmide usato per la clonazione era PB1996, che contiene un tag 3XGFP per fluorescenza, un gene URA per la selezione ceppo di lievito, e un gene di resistenza all&#39;ampicillina per la selezione batterica. </li><li> Purificare il DNA genomico da un Ura-ceppo di lievito aploidi. Nota: Fare riferimento alla Figura 1 per un diagramma di processo di clonazione. </li><li> Eseguire una reazione di PCR standard utilizzando due primer e il DNA genomico di lievito per amplificare il gene Aip1p con i siti di restrizione su entrambi end. Digerire il prodotto PCR e il plasmide PB1996 con gli enzimi di restrizione in reazioni separate per fabbricante protocolli negativa. In questo caso XmaI e XhoI sono stati usati con il buffer di accompagnamento a 37 ° C per 1 ora. </li><li> Eseguire un gel elettroforesi di agarosio 0,8% per separare i frammenti di DNA digeriti. In un pozzetto, caricare un DNA bassa scala di massa e, in pozzetti separati, caricare l&#39;intera reazione da ciascuna digestione. Attivare il gel a 100 volt per circa 1 ora, finché il fronte del colorante è vicino alla fine del gel. Visualizzare il gel sotto una luce UV e purificare il segmento corrispondente al segmento proteina e il plasmide taglio. </li><li> Legare il segmento Aip1 digeriti e PB1996 plasmide. Trasformare il prodotto in cellule DH5a utilizzando protocolli fabbricante (10 microlitri di DNA con 100 cellule microlitri per 30 min in ghiaccio, shock termico a 42 ° C per 2 min, crescere in mezzi SOC per 2 ore a 37 ° C) e la piastra su piastre di coltura che comprendono l&#39;antibiotico per la selezione, in questo caso LB +Piatti Amp. Selezionare e crescere una colonia in coltura liquida. Purificare il plasmide di nuova concezione. </li></ol> 2. Mutant ceppo di lievito Generation <ol><li> Utilizzare un ceppo di lievito aploide in cui l&#39;allele actina è stata soppressa per costruire un ceppo mutante di lievito. Nota: In questo caso, il ceppo è stato un dono generoso da Dr. Peter Rubenstein (University of Iowa) e la costruzione è stato descritto da Cook et al 20 Questo ceppo manca il gene cromosomico actina e contiene un plasmide che codifica tipo selvatico lievito. actina e uracile. </li><li> Utilizzare il plasmide codificante PRS wild type lievito actina con una Trp + selezione come il plasmide base per mutagenesi 21. </li><li> Eseguire mutagenesi sito-diretta sul plasmide PRS per progettare la mutazione missense in actina. <ol><li> Per la mutazione R256H in actina, rendere il primer 5 &#39;ggtaacgaaagattccatgccccagaagc 3&#39; per cambiare il Arg 256 alla sua 256. Eseguire un mutagenesi standard diReazione di PCR con il plasmide dal punto 2.2. </li><li> Trasformare l&#39;actina plasmide mutante dalla PCR in cellule DH5a. Isolare il DNA plasmidico e sequenziare il gene actina per verificare la mutazione. </li></ol></li><li> Trasforma il plasmide codificante mutante lievito actina nel ceppo di lievito aploidi dal punto 2.1. </li><li> Cultura cellule trasformate su Trp piastre per selezionare il lievito contenente il Trp + contenente mutante di lievito actina plasmide. </li><li> Selezionare per le celle manca il plasmide originale che codifica wild type actina e uracile (descritto in 2.1) da parte delle cellule sub-coltura di dei Trp-piastre su piastre contenenti 5-Fluoroorotic Acid (5-FOA). 5-FOA viene convertito nella forma tossica, 5-fluorouracile, in yeas ceppi che esprime il gene URA3 funzionale. Le cellule che crescono dopo la selezione stepwise conterranno solo l&#39;actina plasmide mutante. </li><li> Purificare il DNA plasmidico dal nuovo ceppo di lievito. Sequenziare il plasmide per garantire il gene mutante actina è presente. Utilizzare questo sallenarsi in ulteriori studi. Questo processo è schematizzata in figura 2. </li></ol> 3. Trasformare il plasmide in cellule di lievito <ol><li> Digerire il plasmide Aip1p-GFP con un enzima di restrizione per consentire l&#39;integrazione nel cromosoma di lievito. NOTA: Il sito di restrizione deve essere al di fuori del blocco sequenza che contiene l&#39;etichetta fluorescente, gene di interesse, e marcatore di selezione. In questo caso, utilizzare 1 ml di HpaI enzima di restrizione con 8 microlitri DNA e 1 ml di 10x buffer di accompagnamento per 1 ora a 37 ° C. </li><li> Cultura S. cellule cerevisiae (dal punto 2.5) che sono in grado di sintetizzare uracile (Ura-deformazione) durante la notte in 5 ml in mezzi YPD (estratto di lievito 1%, 2% peptone, e 2% destrosio) su una ruota a 30 ° C. Centrifugare 1 ml delle cellule per 5 minuti a 1000 x g. </li><li> Fai la miscela PLATE. Effettuare 10XTE aggiungendo 5 ml di 1 M Tris pH 7,5 e 2 ml di 250 mM di acido etilendiamminotetraacetico (EDTA) a 43 ml di DDH 2 O. Aggiungi 00,204 g di acetato di litio a 20 ml di 1XTE, poi 8 g di polietilene glicole (PEG) (MW ~ 3.300) e filtro sterilizzare. </li><li> Decantare il supernatante dalle cellule filate al passo 3.2 e risospendere le cellule nel liquido rimanente. Per le cellule sospese, aggiungere 2 ml di 10 mg / ml testicoli salmone vettore DNA. Aggiungere 10 ml di DNA plasmidico digerito dal punto 3.1 e vortice. Aggiungere 0,5 ml della piastra e vortex. Aggiungere 20 ml di 1 M DTT e vortex. </li><li> Incubare la miscela per 6-8 ore a 25 ° C. Heat Shock le cellule in un bagno d&#39;acqua a 42 ° C per 10 min. Piastre 100 microlitri di cellule dal fondo della provetta cui si sono stabiliti su un-Ura piastra. Incubare a 30 ° C per 2-3 giorni o fino a formare colonie. </li><li> Selezionare singole colonie e realizzato su un-Ura piatto. NOTA: Queste cellule contengono il plasmide con il gene Aip1-GFP e Ura integrato nel cromosoma, consentendo la crescita. Queste cellule saranno poi utilizzati in microscopy. </li></ol> 4. Visualizzazione della proteina Movimento Aip1p Uso Total Internal Reflection microscopia a fluorescenza <ol><li> Coltivare una coltura delle cellule di lievito con il incorporato Aip1p-GFP in YPD durante la notte su una ruota a 30 ° C. Subculture 1 ml della cultura durante la notte in 9 ml di Ura-media. Crescere le cellule per un ulteriore 3-4 ore su un agitatore a 30 ° C per assicurare che siano in fase di crescita logaritmica. </li><li> Aggiungere 3 ml di cellule di un vetrino da microscopio in vetro e aggiungere un vetrino. Permettono alle cellule di stabilirsi sul vetrino per 5 min. Porre il vetrino nella staffa del piattello. </li><li> Osservare la proteina Aip1p-GFP con un totale fluorescenza a riflessione interna (TIRF) microscopio (488 nm) usando una immersione in olio 100X TIRF obiettivo e una camera CCD digitale. Utilizzando il software SlideBook 5.0, di ottenere immagini per 20 secondi ad una velocità di 5 fotogrammi / sec (frames individuali di immagini acquisite sono presentati nella Figura 2A). <ol><li> Per mettere a fuoco il cells, aperto software SlideBook 5.0 e fare clic sul pulsante Finestra di messa a fuoco nella barra degli strumenti per accedere ai controlli di messa a fuoco. Selezionare la scheda Ambito e selezionare l&#39;obiettivo 100X-TIRF. Accendere la lampada e far scorrere la barra della lampada al 15%. Modificare l&#39;impostazione Bin 2 x 2. Cambiare il filtro a campo chiaro. </li><li> Al microscopio, usare il selettore di messa a fuoco fine per portare le cellule a fuoco come si è visto sullo schermo del computer. </li><li> Utilizzando i controlli all&#39;interno della finestra di messa a fuoco, spegnere la lampada, sostituire il filtro per vivere, e fare clic sul pulsante TIRFM. </li><li> L&#39;illuminatore TIRFM collegato alla porta lato destro del microscopio, ruotare l&#39;emissione laser On. </li><li> Selezionare la scheda flusso all&#39;interno della finestra di messa a fuoco, selezionare la casella accanto per avviare la registrazione e quindi fare clic su pulsante di campo luminoso. </li><li> L&#39;illuminatore TIRFM, ruotare il micrometro per regolare l&#39;angolo di incidenza del laser. Questo viene utilizzato per ottimizzare l&#39;emissione di fluorescenza dai fuochi Aip1-GFP e minimizzare la fluorescenza di fondo dalcellule e scivolo. </li><li> Quando viene visualizzata l&#39;immagine desiderata, premere Start. Dopo 20 secondi, premere Stop. Salvare le immagini. Nella scheda File nella barra del menu principale, selezionare Salva presentazione come e inserire il percorso del file e il nome. </li></ol></li><li> Utilizzare il software ImageJ per analizzare le immagini. Utilizzare il plugin macro &quot;Tracker manuale&quot; per tracciare il movimento e la velocità del Aip1p foci fluorescente. Modificare il parametro intervallo di tempo di 0,2 sec. <ol><li> Utilizzando la selezione delle tracce add, selezionare e tenere traccia di una proteina fluorescente individuo attraverso 4-8 fotogrammi connettivi. Utilizzare il comando traccia finale e la velocità di movimento proteine ​​tra ogni fotogramma viene visualizzata in una finestra dei risultati. </li><li> Determinare il tasso medio tra ogni frame utilizzando un foglio di calcolo di Microsoft Excel. Utilizzare i valori per calcolare la velocità media di movimento Aip1p per ogni ceppo cellulare di interesse. NOTA: Un grafico a dispersione della velocità di movimento Aip1p e la velocità media non lineare è mostrato in Figuri 2B. </li></ol></li></ol>

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</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Una strategia efficace per visualizzare la dinamica del citoscheletro e l&#39;utilità nelle indagini sulle mutazioni patogene è stato descritto qui. Modalità di imaging avanzate hanno creato nuove opportunità per comprendere il movimento intracellulare di proteine ​​nei pressi della membrana cellulare. Totale microscopia a fluorescenza di riflessione interna (TIRF) è una tecnica sensibile per studi funzionali in cellule viventi. TIRF utilizza un laser di eccitazione angolato che crea un campo evanescente a causa della d...

Actina è la proteina dominante comprendente il citoscheletro e partecipa ai processi cellulari critici compresi divisione cellulare, movimento organello, la motilità cellulare, la contrazione e segnalazione. Negli ultimi dieci anni, le mutazioni che causano la malattia di actina sono stati scoperti in ciascuna delle sei isoforme di actina umani che portano a una serie di disturbi, da miopatie a malattia coronarica 1-7. I processi attraverso i quali le mutazioni di actina portano alla malattia continuano ad essere chiariti. Il modello di lievito resta il gold standard per studiare gli effetti biochimici di mutazioni sulla funzione actina causa dei vantaggi della singola isoforma actina essenziale, trattabilità genetica ed elevata conservazione di sequenza e funzione di actina. Gli studi dimostrano che le singole mutazioni di actina portano a specifiche disfunzioni molecolari con effetti negativi dominanti 8. Ad esempio, mutazioni che causano sordità in actina γ-non-muscolare che influenzano il residuo Lys-118 alterano regolamentazione da partela proteina di legame actina Arp2 / 3 9. Studi frequentemente utilizzano in vitro analisi di proteine: interazioni proteina. Indagini l&#39;effetto di actina mutazioni in biologia cellulare e, in particolare, actina localizzazione delle proteine ​​di legame nella cella sono limitati. Studi del citoscheletro lievito in vivo convenzionalmente basano su immagini di cellule fissate da un microscopio invertito a fluorescenza 10. Questi esperimenti hanno fornito dati fondamentali sulla morfologia del citoscheletro actina. Le indagini hanno dato inserito tridimensionale confocale per visualizzare la complessa rete del citoscheletro 11, 12. Questa rappresentazione consente di quantificare l&#39;abbondanza e la posizione relativa di patch di actina e filamenti. Sottile sezione tomografia elettronica è stato usato per l&#39;immagine della morfologia delle reti filamentosi dense relativi alle strutture subcellulari conservate 13. S Crowded cellularipassi con una piccola sezione trasversale possono essere esaminate in dettaglio fine con questa tecnica. Studi di imaging sono stati estesi per le cellule viventi usando la microscopia a fluorescenza time lapse. Quando fotoindotto e fluorescenza di fondo possono essere moderato, imaging lasso di tempo permette indagini alla dinamica delle proteine ​​citoscheletriche e la risposta alle condizioni ambientali 11, 14. Separatamente, la visualizzazione della dinamica dei filamenti di actina in vitro è stata avanzata dall&#39;introduzione di riflessione interna totale fluorescenza (TIRF) microscopia. Rispetto alla microscopia campo ampio, TIRF ha il vantaggio di una ridotta fluorescenza di fondo e maggiore contrasto per monitorare singoli filamenti 15, 16. Con queste qualità, la microscopia TIRF è stato adattato da biologi cellulari per monitorare strutture cellulari a livello della membrana plasmatica 17, 18. Eventi cellulari, inclusi i cambiamenti nel citoscheletro, puòessere visualizzati in tempo reale con un basso fototossicità, contrasto massimo, e lo sfondo minimal fioritura 19. Per comprendere meglio l&#39;effetto di mutazioni actina sul movimento, localizzazione, e turnover di proteine ​​citoscheletriche nella cellula, microscopia TIRF e proteina codifica sono stati utilizzati. Qui, sono descritti metodi per studiare gli effetti di una mutazione clinicamente rilevante sulla dinamica del citoscheletro di actina in Saccharomyces cerevisiae. Specificamente, la localizzazione e il movimento della proteina di legame actina, Aip1p, è stata visualizzata e quantificati in cellule che esprimono la mutazione R256H in actina. Queste tecniche si completano a studi biochimici in vitro e consentono una maggiore comprensione delle interazioni proteiche e funzioni.

<table><tbody><tr><td>Agarosio</td><td>rpi</td><td>9012-36-6</td><td></td></tr><tr><td>Blu di bromofenolo</td><td>Amresco</td><td>115-39-9</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>NEB</td><td>B9001S</td><td></td></tr><tr><td>Change-IT Kit di mutazione multipla diretta al sito USB</td><td>Corporation</td><td>4166059</td><td></td></tr><tr><td>CutSmart Buffer</td><td>NEB</td><td>B7204S</td><td></td></tr><tr><td>DNA, a filamento singolo da testicoli di salmone</td><td>Sigma</td><td>9007-49-2</td><td></td></tr><tr><td>EDTA pH 7.4</td><td>Sigma</td><td>93302</td><td></td></tr><tr><td>Bromuro di etidio</td><td>Invitrogen</td><td>15585-011</td><td>Attenzione! Irritazione dannosa</td></tr><tr><td>Kit DNA fungino/batterico</td><td>Symo Research</td><td>D6005</td><td></td></tr><tr><td>HpaI</td><td>NEB</td><td>R0105S</td><td></td></tr><tr><td>Acetato di litio</td><td>AlfaAesar</td><td>6108-17-4</td><td></td></tr><tr><td>Scala a bassa massa di DNA</td><td>Invitrogen</td><td>10068-013</td><td></td></tr><tr><td>NE Buffer #4</td><td>NEB</td><td>B7004S</td><td></td></tr><tr><td>Platinum PCR SuperMix High Fidelity</td><td>Invitrogen</td><td>12532-016</td><td></td></tr><tr><td>Kit Miniprep</td><td>Qiagen</td><td>27106</td><td>Qualsiasi kit funzionerà</td></tr><tr><td>Kit di legatura rapida</td><td>NEB</td><td>M2200S</td><td></td></tr><tr><td>Sodio azide</td><td>Sigma</td><td>26628-22-8</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Invitrogen</td><td>10010-023</td><td></td></tr><tr><td>PEG</td><td>Amresco</td><td>25322-68-3</td><td></td></tr><tr><td>Tris Base Ultrapure</td><td>rpi</td><td>77-86-1</td><td></td></tr><tr><td>Wizard SV Gel e PCR Clean-Up System</td><td>Promega</td><td>1/6/2015</td><td></td></tr><tr><td>XhoI</td><td>NEB</td><td>R0146S</td><td></td></tr><tr><td>XmaI</td><td>NEB</td><td>R0180S</td><td></td></tr><tr><td>YPD media</td><td>LabExpress</td><td>3011-URA</td><td></td></tr> <tr><td>Media</td><td>LabExpress</td><td>3010</td><td></td></tr><tr><td>PCR Machine</td><td>Invitrogen</td><td>4359659</td><td>Qualsiasi macchina PCR funzionerà</td></tr><tr><td>Microscopio TIRF</td><td>Olympus IX81</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hamamatsu ORCA-R fotocamera</td><td>Hamamatsu</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

aip1p dynamics sono alterati dalla r256h mutazione in actina

Aip1p Dynamics Are Altered by the R256H Mutation in Actin

Mutazioni in actina causare una serie di malattie umane dovute a cambiamenti molecolari specifici che spesso alterano la funzione del citoscheletro. In questo studio, l&#39;imaging di fluorescenza tagged proteine ​​mediante fluorescenza interna totale (TIRF) microscopio viene utilizzato per visualizzare e quantificare i cambiamenti nelle dinamiche del citoscheletro. Microscopia TIRF e l&#39;uso di tag fluorescenti consente inoltre per la quantificazione dei cambiamenti nelle dinamiche del citoscheletro causata da mutazioni in actina. Usando questa tecnica, quantificazione della funzione del citoscheletro in cellule vive integra pregevolmente studi in vitro della funzione della proteina. Come esempio, mutazioni di senso influenzano il residuo actina R256 sono stati identificati in tre isoforme di actina umani suggerendo questo aminoacido svolge un ruolo importante nelle interazioni regolamentazione. Gli effetti della actina mutazione R256H sui movimenti del citoscheletro sono stati studiati utilizzando il modello di lievito. La proteina, Aip1, che è noto per assistere cofilin in actina depolimerizzazione, eraetichettati con la proteina fluorescente verde (GFP) al N-terminale e tracciati in vivo mediante microscopia TIRF. La velocità di movimento Aip1p sia wild type e mutanti è stata quantificata. Nelle cellule esprimenti mutante R256H actina, Aip1p movimento è limitata e la velocità di movimento è circa la metà della velocità misurata in cellule di tipo selvatico (0,88 ± 0,30 micron / sec in cellule R256H rispetto a 1,60 ± 0,42 micron / sec in cellule di tipo selvatico, p &lt;0.005).

Un metodo per immagine dinamica di proteine ​​citoscheletriche nella cellula è presentato. La proteina-actina vincolante, Aip1p, è stato taggato con GFP. Il motivo per il plasmide codificante il prodotto etichettato è mostrato in Figura 1. Il plasmide è stato poi trasformato in cellule di lievito. Espressione dei fluorescente etichettato Aip1p permesso visualizzazione del comportamento proteina nella cellula. Aip1p localizza tipicamente a chiazze actina nei siti di endocitosi 22. Per quantifi...

Malattia mutazioni che causano in actina possono alterare la funzione del citoscheletro. Dinamica del citoscheletro vengono quantificati attraverso l&#39;imaging di proteine ​​con targhetta modo fluorescente utilizzando totale microscopia a fluorescenza interna. Come esempio, la proteina del citoscheletro, Aip1p, ha modificato la localizzazione e il movimento in cellule esprimenti l&#39;isoforma actina mutante, R256H.

Aip1p Dynamics sono alterati dalla R256H mutazione in actina

Mutations in actin cause a range of human diseases due to specific molecular changes that often alter cytoskeletal function. In this study, imaging of ...

L'obiettivo generale di questa procedura è visualizzare il movimento della proteina legante l'actina nel lievito che esprime un'isoforma mutante dell'actina. Questo viene ottenuto innanzitutto creando un plasmide e clonando il gene della proteina interagente con l'actina uno o A IP uno P, marcato con una proteina fluorescente verde tre volte Fluor quattro. Il secondo passaggio consiste nel generare una ceppa di lievito che esprime esclusivamente actina di tipo selvaggio o mutante.Successivamente, il plasmide A IP one P marcato con GFP viene trasformato nel ceppo di lievito di tipo selvaggio o mutante. L'ultimo passaggio consiste nell'acquisire immagini e analizzare il movimento dell'A IP one P marcato nelle cellule di lievito di tipo selvaggio e mutante. Infine, riflessione totale interna.La microscopia a fluorescenza o a prato viene utilizzata per dimostrare che l'A IP one P si muove più lentamente nei lieviti che esprimono l'actina mutante R 2 56 H rispetto all'actina di tipo selvaggio. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nel campo del citoscheletro, come i movimenti temporali relativi dei partner di legame. Abbiamo avuto per la prima volta l'idea di questo metodo quando ho scoperto che, a differenza del ceppo di tipo selvaggio, l'eliminazione dell'A IP one P dal ceppo mutante di lievito era letale.Il principale vantaggio di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti, come la microscopia confocale, è il contrasto migliorato e la velocità di acquisizione delle immagini. In generale, chi si approccia per la prima volta a questo metodo potrebbe incontrare difficoltà nell'ottimizzare le impostazioni del microscopio per il proprio esperimento specifico, a causa del gran numero di regolazioni possibili e della natura soggettiva della qualità dell'immagine. Iniziare questo protocollo generando il plasmide A IP one PGFP e la ceppa di lievito mutante seguendo le istruzioni riportate nel protocollo testuale, quindi digerire il plasmide con un enzima di restrizione per consentirne l'integrazione nel cromosoma del lievito.Le cellule S-C-V-C-A preparate, che non sono in grado di sintetizzare l'uracile, vengono coltivate per tutta la notte in cinque millilitri di terreno YPD su una ruota a 30 gradi Celsius. Centrifugare un millilitro delle cellule per cinque minuti a 1000 ×g. Successivamente, preparare la miscela per la piastra come indicato nel protocollo testuale, filtrare il soprannatante delle cellule per sterilizzarlo, decantare il soprannatante e risospendere le cellule nel liquido rimanente fino a ottenere una sospensione omogenea delle cellule.Aggiungere due microlitri di DNA di testicolo di salmone a 10 milligrammi per millilitro come carrier. Quindi aggiungere 10 microlitri del plasmide digerito, il DNA e vortexare prima di aggiungere 0,5 millilitri di piastra e vortexare nuovamente. Infine, aggiungere 20 microlitri di DI tre etolo uno molare e vortexare.Dopo aver incubato la miscela per sei-otto ore a 25 gradi Celsius, sottoporre le cellule a shock termico in un bagno termico a 42 gradi Celsius per 10 minuti. Piastrare 100 microlitri delle cellule prelevati dal fondo del tubo da microcentrifuga, dove si sono sedimentate, su una piastra senza uracile.Incubare a 30 gradi Celsius per due o tre giorni o fino alla formazione di colonie. Selezionare colonie singole e seminare su un terreno privo di ATE. Per preparare le cellule alla microscopia, queste devono contenere il plasmide con A IP uno GFP e Urogen integrato nel cromosoma.Coltivare una coltura di cellule di lievito con A IP one PGFP incorporato in YPD per tutta la notte su un rotatore a 30 gradi Celsius. Passare un millilitro della coltura notturna in nove millilitri di mezzo meno Euro. Far crescere le cellule per ulteriori tre-quattro ore in agitazione a 30 gradi Celsius per assicurarsi che si trovino in fase logaritmica di crescita.Successivamente, aggiungere tre microlitri di cellule su un vetrino da microscopia e posizionare un coprioggetto. Lasciare sedimentare le cellule sul vetrino per cinque minuti. Prima di posizionare il vetrino nel supporto della piastra portacampioni, osservare la proteina A IP one PGFP mediante un microscopio a fluorescenza con riflessione totale interna o microscopio TIRF, utilizzando un obiettivo ad immersione in olio da 100x TIRF e una telecamera CCD digitale.Per mettere a fuoco le cellule, aprire il software Slide Book 5.0 e fare clic sul pulsante della finestra di messa a fuoco nella barra degli strumenti. Per accedere ai controlli di messa a fuoco, selezionare la scheda scope e scegliere l'obiettivo 100x turf. Accendere la lampada e spostare la barra della lampada al 15%. Impostare il binning su due per due e selezionare il filtro in campo chiaro sul microscopio.Utilizzare lo stile di messa a fuoco fine per mettere a fuoco le cellule come visualizzato sullo schermo del computer. Utilizzando i controlli all'interno della finestra di messa a fuoco, spegnere la lampada, cambiare il filtro su "live" e fare clic sul pulsante T-I-R-F-M sull'illuminatore T-I-R-F-M collegato alla porta laterale destra del microscopio. Attivare l'emissione del laser e selezionare la scheda "stream" all'interno della finestra di messa a fuoco.Selezionare la casella per iniziare la registrazione, quindi fare clic sul pulsante del campo chiaro sull'illuminatore TIR FM. Ruotare il micrometro per regolare l'angolo di incidenza del laser. Questo passaggio serve a ottimizzare l'emissione fluorescente dai foci A IP one GFP e a ridurre al minimo la fluorescenza di fondo proveniente dalle cellule e dal vetrino quando viene visualizzata l'immagine desiderata.Premere start. Acquisire immagini per 20 secondi a una velocità di cinque fotogrammi al secondo. Dopo 20 secondi, premere stop.Salvare le immagini tramite la scheda file sulla barra del menu principale. Selezionare "Salva slide come" e inserire il file, il percorso e il nome. Successivamente, utilizzare il software Image J.Per analizzare le immagini, utilizzare il plugin macro Manuale Tracker per tracciare il movimento e la velocità dei fuochi fluorescenti di A IP one P. Modificare il parametro dell'intervallo temporale a 0,2 secondi. Utilizzando l'opzione Aggiungi traccia, selezionare e seguire una singola proteina fluorescente attraverso quattro a otto fotogrammi consecutivi.Utilizzare il comando N track e la velocità di movimento della proteina tra ogni fotogramma verrà visualizzata in una finestra dei risultati. Determinare la velocità media tra ogni fotogramma utilizzando un foglio di calcolo di Microsoft Excel.Utilizzare i valori per calcolare la velocità media di un movimento di A IP one P, oppure di ogni ceppo cellulare di interesse, al fine di quantificare il movimento di A IP one P. Sono stati seguiti più di 50 fuochi fluorescenti di A IP one P in più di 10 cellule. I risultati rappresentativi del movimento di A IP one P in cellule di tipo selvaggio sono mostrati come previsto.L'a IP one P marcata con fluorescenza si sposta rapidamente all'interno della cellula e poi scompare nelle cellule che esprimono l'actina mutante R 2 56 H. L'a IP one P presenta un movimento ridotto rispetto alle cellule di tipo selvaggio. Il movimento dell'a IP one P viene tracciato utilizzando Image J per mapparne quantitativamente lo spostamento. Un A IP one P si sposta attraverso la cellula nel ceppo di tipo selvaggio, ma si muove solo in una regione ristretta. Nel ceppo mutante di actina, è stata calcolata la velocità media per ciascuna area fluorescente di A IP one P. Nelle cellule di tipo selvaggio, la velocità media del movimento di un A IP one P è di 1,60 ± 0,42 micrometri al secondo. Le cellule che esprimono l'actina mutante R 2 56 H, nota per avere una morfologia anomala del citoscheletro di actina, presentano un fenotipo alterato di A IP one P nel ceppo mutante.Il movimento di A IP one P è limitato e più lento. La velocità media del movimento di A IP one P è di 0,88 ± 0,30 micrometri al secondo. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come ottenere immagini di proteine del citoscheletro utilizzando la microscopia turf.Durante l'utilizzo di questa procedura, è importante ricordare di non far seccare le cellule né sottoporle a sbiancamento fotoindotto.

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Proteine ​​si legano l'actina filamentosa (F-actina) attraverso i moduli di legame actina. In questo video ci dimostra la procedura di actina co-sedimentazione, che è un test in vitro solitamente usata per analizzare le proteine ​​o domini specifici che legano la F-actina.

Actina Co-sedimentazione di analisi, per l&#39;Analisi del Binding Protein a F-Actina

Un metodo per spazio-temporale controllo delle attività di piccola GTPasi dalla luce viene descritta. Questo metodo si basa sulla rapamicina indotta FKBP-FRB eterodimerizzazione e foto-gabbie sistemi. Ottimizzazione di irradiazione di luce permette l'attivazione spazio-temporalmente controllato delle piccole GTPasi a livello subcellulare.

Manipolazione spazio-temporale di attività GTPasi Piccolo a livello subcellulare e su scala temporale di secondi nelle cellule viventi

L'actina filamentosa (F-actina) svolge un ruolo importante nella spinogenesi, nella plasticità sinaptica e nella stabilità sinaptica. La quantificazione dei F-actina puncta è quindi uno strumento utile per studiare l'integrità delle strutture sinaptiche. Questo protocollo descrive le procedure di quantificazione dei punti F-actina marcati con falloidina in colture neuronali corticali primarie a bassa densità.

La quantificazione di filamentosa Actina (F-actina) Puncta nel ratto neuroni corticali

Relazioniamo un saggio semplice, efficiente in termini di tempo e ad alta produttività a base di spettroscopia a fluorescenza per la quantificazione dei filamenti di actina in campioni biologici ex vivo provenienti da tessuti cerebrali di roditori e soggetti umani.

Un saggio a base di spettroscopia a fluorescenza efficiente in termini di tempo per valutare lo stato di polimerizzazione dell'actina nei tessuti cerebrali dei roditori e umani

Presentiamo protocolli per semplici saggi microfluidici di filamenti di actina, in combinazione con la microscopia a fluorescenza, che consentono di monitorare con precisione i singoli filamenti di actina in tempo reale esponendoli sequenzialmente a diverse soluzioni proteiche.

Utilizzo della microscopia a microfluidica e fluorescenza per studiare la dinamica di assemblaggio di singoli filamenti e fasci di actina

Questo protocollo è una guida per la visualizzazione dinamica di actina e microtubuli utilizzando un test di microscopia a fluorescenza interna totale (TIRF) in vitro .

Visualizzazione delle dinamiche di accoppiamento di actina e microtubuli in vitro mediante microscopia a fluorescenza a riflessione interna totale (TIRF)

Questo protocollo descrive come produrre comete di actina sulle superfici delle perle utilizzando ingredienti proteici disponibili in commercio. Tali sistemi imitano le strutture protrusive presenti nelle cellule e possono essere utilizzati per esaminare i meccanismi fisiologici della produzione di forza in modo semplificato.

Ricostituzione della motilità a base di actina con proteine disponibili in commercio

Selezione, microiniezione, e l'imaging di fluorescenza marcata con F-actina tramite microscopia a fluorescenza speckle (FSM).

Imaging cellulare dal vivo di F-actina Dynamics tramite microscopia a fluorescenza Speckle (FSM)

Monitoraggio Dinamica di attecchimento muscolare nei piccoli animali da In Vivo Fluorescente Imaging

Descriviamo metodi photobleaching tra cui Recovery fluorescenza Dopo photobleaching (FRAP) e Perdita Fluorescence In photobleaching (FLIP) per monitorare la dinamica delle proteine ​​della cromatina in staminali embrionali (ES) cellule. Cromatina proteine ​​dinamica, che è considerato uno dei mezzi per studiare la plasticità cromatina, è aumentata in cellule pluripotenti.

Fotodecolorazione saggi (FRAP e FLIP) per misurare la dinamica delle proteine ​​della cromatina in Living cellule staminali embrionali

Esplora la dinamica di Aip1p nel lievito con actina mutante R256H mediante microscopia a fluorescenza TIRF. Questo metodo permette di visualizzare e quantificare i movimenti delle proteine leganti l'actina in vivo.

Aip1p Dynamics sono alterati dalla R256H mutazione in actina

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