Quantificare singolo microvasi Permeabilità in Isolata Blood-perfusione Rat Lung Preparazione
30 giugno 2014
La preparazione isolato polmone sangue perfuso rende possibile visualizzare le reti microvasali sulla superficie polmonare. Qui si descrive un metodo per quantificare permeabilità delle singole microvasi nei polmoni isolati utilizzando l'imaging di fluorescenza in tempo reale.
L'obiettivo generale di questa procedura è quantificare la permeabilità in singoli microvasi di polmoni di ratto isolati utilizzando un metodo basato sulla fluorescenza. Ciò si ottiene isolando prima i polmoni di ratto e perfondendoli con sangue autologo. La seconda fase della procedura consiste nell'inserire un microcatetere atriale sinistro in una piccola regione del polmone per infondere nella flora quattro destrine marcate.
Quindi, mentre la destrina marcata viene infusa, vengono raccolte le immagini dei microvasi polmonari. Il passaggio finale consiste nel quantificare la permeabilità dei singoli microvasi dalle immagini utilizzando il software. In definitiva, i risultati possono mostrare il grado di permeabilità dei microvasi polmonari in diverse condizioni, ad esempio dopo il trattamento con LPS.
A dimostrare questa procedura sarà la dottoressa Kava Kasami, una borsista post-dottorato del mio laboratorio Begin eseguendo una tracheotomia su un ratto maschio in un piano chirurgico di anestesia confermato. Utilizzare una cannula tracheale in PE 90 e fissarla con punti di sutura. Successivamente, infondere il cuore con 100-200 unità di eparina utilizzando un ago a farfalla calibro 21.
Aspetta un minuto e poi dissangua il sangue. Raccogli il sangue e mettilo da parte con la soluzione salina. Riempire due cannule fatte di tubo tigon da tre millimetri lunghe quattro centimetri e svasate su un'estremità.
Ora esegui una toracotomia. Praticare un'incisione abbastanza grande da far entrare la cannula nel ventricolo destro e farla scivolare nella tana svasata di una cannula verso l'arteria polmonare. Fissare la cannula con punti di sutura.
Usa la stessa tecnica per inserire l'altra cannula nell'apice del ventricolo sinistro verso l'atrio sinistro. Fissalo con nastro ombelicale largo due millimetri. Ora rimuovi i tessuti connettivi che ostacolano e rimuovi il lungo e il cuore insieme alle cannule.
Trasferiscili in una capsula di Petri con la superficie diaframmatica del polmone verso l'alto e le tre cannule tutte allineate. Spostare la preparazione sezionata su uno stadio regolabile dotato di tubi tigon numero 18 collegati a trasduttori di pressione che fungono da tubi di ingresso e uscita. Ora mescola la raccolta di sangue con un volume uguale di soluzione di albumina al 5%.
Aggiungere questa miscela al serbatoio di caricamento. Avviare la pompa a 14 millilitri al minuto. Assicurarsi che il tubo non abbia bolle d'aria.
Alla preparazione. Collegare l'arteria polmonare al tubo di ingresso del polmone e la cannula atriale sinistra al tubo di uscita. Ricontrollare che non ci sia aria nel tubo e controllare anche che lo shunt sia aperto.
Collegare la cannula tracheale a un terzo trasduttore di pressione. Gonfiare i polmoni attraverso la cannula tracheale con il 30% di ossigeno. Mantenere i polmoni a cinque centimetri di pressione dell'acqua.
Ora bloccare lo shunt e avviare la pompa a 14 millilitri al minuto. Per iniziare la perfusione polmonare durante la perfusione, regolare la pompa in modo da mantenere la pressione polmonare a circa 10 centimetri di acqua e mantenere la pressione atriale sinistra a tre centimetri di acqua. Inizia con la preparazione del polmone infuso di sangue.
Innanzitutto, costruire un catetere per infusione da un tubo PE 10 di 40 centimetri inserito in un tubo PE 90 di 30 centimetri. Collegare l'altra estremità del tubo PE 10 a un ago calibro 30 collegato a una siringa da un cc. Portare l'estremità del tubo attaccato al polmone sopra la preparazione e collegare il catetere per infusione ad esso.
Guidare il catetere per infusione nell'atrio sinistro e poi nel polmone fino a quando non incontra resistenza. Una forza eccessiva danneggerà il polmone. La corretta incisione del microcatetere è fondamentale in quanto qualsiasi danno al polmone da parte del microcatetere ridurrà il successo del protocollo.
Quindi, riempi la siringa con le suonerie e collegala a una pompa. Infondere lentamente la soluzione a una velocità di 10 microlitri al minuto. Gradualmente, il sito di infusione diventerà pallido rispetto al resto del polmone per mantenere la superficie polmonare umida e rapida nella plastica, ad eccezione del sito di infusione.
Ora per visualizzare il polmone, crea una finestra di visualizzazione attaccando un O-ring a un vetrino coprioggetti da 22 millimetri. Utilizzando grasso per rubinetti, fissare l'O-ring a un supporto per provette. Quindi posizionare la finestra sopra il sito di infusione.
Completa la configurazione facendo oscillare un obiettivo 20 x sopra il vetrino coprioggetti e concentrandoti sul polmone. Non è prevista alcuna distorsione visiva. Ora infondere il polmone con una soluzione a scelta.
In questo esempio, dopo la soluzione salina, un millilitro di destrina coniugata ZI viene infuso nel polmone attraverso la pompa a siringa nel corso di 60 minuti. Utilizzando il software di imaging, registrare un'immagine al minuto per l'infusione di un'ora e continuare la registrazione durante il successivo washout Passaggio per altri 10 minuti Dopo l'infusione della destrina Fitz, lavarla via infondendo la soluzione di suoneria polmonare per almeno altri 10 minuti alla stessa velocità di flusso. Dopo. Quando si analizzano le immagini acquisite, si ottiene l'intensità massima di fluorescenza nella regione di interesse durante l'infusione.
Quindi segnare l'intensità massima di fluorescenza della fluorescenza residua dopo il washout di 10 minuti. Le variazioni della permeabilità vascolare sono state studiate utilizzando l'infusione di destrina fitzy dopo il trattamento con lipopolisaccaride batterico, poiché questo è un modello ampiamente utilizzato di un LI.La fluorescenza residua di fit e era bassa nei microvasi trattati con ringer, ma alta in quelli trattati con LPS. Inoltre, rispetto all'infusione di ringer, l'infusione di LPS ha causato una significativa riduzione dell'indice di permeabilità, suggerendo un aumento globale della permeabilità in tutti i vasi all'interno del campo dell'immagine.
Inoltre, rispetto all'infusione di ringer, l'infusione di LPS ha causato una significativa riduzione dell'indice di permeabilità, suggerendo un aumento globale della permeabilità in tutti i vasi all'interno del campo dell'immagine. Dopo aver visto questo video, dovrebbe avere una buona comprensione di come preparare i polmoni isolati per la profilassi degli uccelli, inserire un microcatetere della coda sinistra e definire la permeabilità nel micro.
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Panoramica
Questo articolo descrive un metodo per quantificare la permeabilità dei singoli microvasi in polmoni di ratti isolati utilizzando l'imaging a fluorescenza in tempo reale. La preparazione del polmone isolato perfuso con sangue permette la visualizzazione delle reti di microvasi sulla superficie del polmone.
Componenti chiave dello studio
Area della scienza
- Neuroscienza
- Biologia vascolare
- Imaging a fluorescenza
Sfondo
- Comprendere la permeabilità dei microvasi è cruciale per studiare la funzione polmonare.
- Le preparazioni di polmone isolato forniscono un ambiente controllato per la sperimentazione.
- L'imaging a fluorescenza permette l'osservazione in tempo reale della dinamica dei microvasi.
- Studi precedenti hanno mostrato l'impatto di vari trattamenti sulla permeabilità vascolare.
Obiettivo dello studio
- Quantificare la permeabilità in singoli microvasi di polmoni di ratti isolati.
- Utilizzare un metodo basato sulla fluorescenza per una misurazione accurata.
- Valutare gli effetti di condizioni come il trattamento con LPS sulla permeabilità dei microvasi.
Metodi utilizzati
- Isolamento dei polmoni di ratti e perfusione con sangue autologo.
- Inserimento di un microcatetere atriale sinistro nel polmone.
- Infusione di destrano marcato con fluoresceina nei microvasi.
- Raccolta di immagini durante il processo di infusione per l'analisi.
Risultati principali
- È stata ottenuta la quantificazione della permeabilità in singoli microvasi.
- I risultati hanno indicato vari gradi di permeabilità in diverse condizioni sperimentali.
- L'imaging a fluorescenza ha fornito una chiara visualizzazione delle reti di microvasi.
- I dati supportano ulteriori indagini sugli effetti dei trattamenti sui microvasi polmonari.
Conclusioni
- Il metodo quantifica efficacemente la permeabilità dei microvasi nei polmoni isolati.
- L'imaging in tempo reale è uno strumento prezioso per la ricerca vascolare.
- I risultati contribuiscono alla comprensione delle risposte vascolari polmonari a vari stimoli.
Domande frequenti
Executive Industry Relevance
This method enables direct quantification of permeability changes in individual pulmonary microvessels under inflammatory conditions, providing mechanistic insight into vascular leak pathways. By combining isolated lung perfusion with real-time fluorescence imaging, it supports target validation in pulmonary inflammation models and facilitates preclinical assessment of barrier-protective candidates. The approach reduces reliance on endpoint tissue processing, accelerating data acquisition for go/no-go decisions in early discovery.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Measures real-time fluid leak across venular and capillary segments to interrogate therapeutic hypotheses in vascular inflammation.
- Operational Value: Enables side-by-side comparison of permeability responses across vascular beds within the same lung preparation.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantitative fluorescence intensity readouts to assess compound effects on microvessel permeability.
- Operational Value: Standardizes perfusion and imaging conditions for reproducible, high-content vascular screening.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Links LPS-induced permeability changes to disease-relevant mechanisms of acute lung injury.
- Operational Value: Supports dose-response modeling and pharmacokinetic-pharmacodynamic correlation in preclinical studies.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target validation through preclinical efficacy testing, particularly for pulmonary vascular modulators.
- Discovery Biology: Supports mechanistic de-risking by quantifying vascular barrier function in response to inflammatory stimuli.
- Screening: Delivers assay-ready, quantifiable outputs for evaluating compound effects on single-vessel permeability.
- Analytics: Provides permeability index calculations from time-lapse imaging to enable comparative condition analysis.
- Translational Research: Connects microvascular responses to preclinical models of lung injury via LPS challenge.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for assessing vascular permeability across multiple compound classes and disease models.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity in vascular leak pathways through direct, single-vessel resolution.
- Operational Value: Standardizes microcatheter infusion and imaging protocols for cross-laboratory reproducibility.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by providing early, quantitative vascular safety signals.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of candidates based on pulmonary vascular effects.
Implementation Considerations
- Requires expertise in rodent surgery, vascular cannulation, and fluorescence microscopy.
- Depends on pressure-regulated perfusion systems and intravital imaging infrastructure.
- Necessitates standardization of infusion rates, fluorophore concentrations, and washout protocols across teams.
- Adaptation to other species or disease models may require validation of perfusion parameters and vascular accessibility.
- Practical limitations include technical complexity of microcatheter placement and potential lung trauma from cannulation.
