Quantificare singolo microvasi Permeabilità in Isolata Blood-perfusione Rat Lung Preparazione
30 giugno 2014
La preparazione isolato polmone sangue perfuso rende possibile visualizzare le reti microvasali sulla superficie polmonare. Qui si descrive un metodo per quantificare permeabilità delle singole microvasi nei polmoni isolati utilizzando l'imaging di fluorescenza in tempo reale.
L'obiettivo generale di questa procedura è quantificare la permeabilità in singoli microvasi di polmoni isolati di ratto mediante un metodo basato sulla fluorescenza. Questo viene ottenuto isolando innanzitutto i polmoni di ratto e perfondendoli con sangue autologo. Il secondo passaggio della procedura consiste nell'inserire un microcatetere atriale sinistro in una piccola regione del polmone per infondere della destrina marcata con flora quattro.
Successivamente, mentre viene infusa la destrina marcata, vengono acquisite immagini dei microvasi polmonari. L'ultimo passaggio consiste nel quantificare la permeabilità dei singoli microvasi a partire dalle immagini, utilizzando un software. In definitiva, i risultati possono mostrare il grado di permeabilità dei microvasi polmonari in diverse condizioni, ad esempio dopo il trattamento con LPS.
La procedura sarà dimostrata dal dottor Kava Kasami, ricercatore postdottorato del mio laboratorio. Iniziare eseguendo una tracheotomia su un ratto maschio in un piano anestetico chirurgicamente adeguato. Utilizzare una cannula tracheale PE 90 e fissarla con punti di sutura. Successivamente, infondere nel cuore da 100 a 200 unità di eparina utilizzando un ago butterfly da 21 gauge.
Attendere un minuto, quindi esanguinare il sangue. Raccogliere il sangue e metterlo da parte insieme alla soluzione salina. Riempire due cannule realizzate con tubo in teflon lungo quattro centimetri e di tre millimetri di diametro, con un'estremità svasata.
Ora eseguire una toracotomia. Praticare un'incisione appena sufficiente per inserire la cannula nel ventricolo destro e far scivolare l'estremità svasata di una cannula verso l'arteria polmonare. Fissare la cannula con punti di sutura.
Utilizzare la stessa tecnica per inserire l'altra cannula nell'apice del ventricolo sinistro in direzione dell'atrio sinistro. Fissarla con un nastro ombelicale largo due millimetri. A questo punto rimuovere i tessuti connettivi di ostacolo ed estrarre il cuore insieme alle cannule.
Trasferirli in una piastra di Petri con la superficie diaframmatica del polmone rivolta verso l'alto e le tre cannule allineate. Spostare il preparato dissezionato su un supporto regolabile dotato di tubo tigon numero 18 collegato a trasduttori di pressione che fungono da tubi di ingresso e di uscita. Mescolare ora il campione di sangue con un volume uguale di soluzione al 5% di albumina.
Aggiungere questa miscela al serbatoio di carico. Avviare la pompa a 14 millilitri al minuto. Assicurarsi che il tubo non contenga bolle d'aria.
Durante la preparazione, collegare l'arteria polmonare al tubo di ingresso del polmone e la cannula atriale sinistra al tubo di uscita. Verificare attentamente che non ci siano bolle d'aria nei tubi e controllare anche che lo shunt sia aperto.
Collegare la cannula tracheale a un terzo trasduttore di pressione. Gonfiare i polmoni attraverso la cannula tracheale con il 30% di ossigeno. Mantenere i polmoni a una pressione di cinque centimetri di acqua.
Ora bloccare il derivatore e avviare la pompa a 14 millilitri al minuto. Per iniziare la perfusione polmonare durante la perfusione, regolare la pompa in modo da mantenere la pressione polmonare a circa 10 centimetri di acqua e mantenere la pressione atriale sinistra a tre centimetri di acqua. Iniziare preparando il polmone infuso con sangue.
Per prima cosa, costruire un catetere di infusione utilizzando un tratto di 40 centimetri di tubo PE 10 inserito in un tratto di 30 centimetri di tubo PE 90. Collegare l'altra estremità del tubo PE 10 a un ago da 30 gauge fissato a una siringa da 1 cc. Portare l'estremità del tubo collegata al polmone sopra il preparato e fissare il catetere di infusione ad essa.
Guidare il catetere di infusione nell'atrio sinistro e quindi nel polmone fino a quando non incontra resistenza. Una forza eccessiva danneggerebbe il polmone. L'incisione corretta del microcatetere è fondamentale, poiché qualsiasi danno al polmone causato dal microcatetere ridurrebbe il successo del protocollo.
Successivamente, riempire la siringa con soluzione fisiologica e collegarla a una pompa. Infondere lentamente la soluzione a un ritmo di 10 microlitri al minuto. Gradualmente, il sito di infusione diventerà pallido rispetto al resto del polmone, mantenendo la superficie polmonare umida, tranne che nel sito di infusione.
Ora, per visualizzare il polmone, crea una finestra di osservazione attaccando un anello O a un coprioggetto da 22 millimetri. Utilizzando grasso per rubinetti, fissa l'anello O a un porta provette. Quindi posiziona la finestra sopra il sito di infusione.
Completare l'allestimento posizionando un obiettivo 20x sopra il vetrino e mettendo a fuoco il polmone. Non ci si aspetta alcuna distorsione visiva. Ora infondere il polmone con una soluzione a scelta.
In questo esempio, dopo la somministrazione della soluzione salina, un millilitro di destrina coniugata con ZI viene infuso nel polmone tramite pompa a siringa nell'arco di 60 minuti. Utilizzando il software di acquisizione immagini, acquisire un'immagine al minuto durante l'intera ora di infusione e continuare la registrazione per ulteriori 10 minuti durante il successivo passaggio di lavaggio. Dopo l'infusione della destrina Fitz, rimuoverla infondendo soluzione fisiologica per il polmone per almeno altri 10 minuti allo stesso flusso. In seguito, durante l'analisi delle immagini acquisite, determinare l'intensità massima di fluorescenza nella regione di interesse durante la fase di infusione.
Quindi valutare l'intensità di fluorescenza massima della fluorescenza residua dopo il lavaggio di 10 minuti. I cambiamenti nella permeabilità vascolare sono stati analizzati mediante infusione di destrina fitzy a seguito del trattamento con lipopolisaccaride batterico, poiché questo rappresenta un modello ampiamente utilizzato di LI. La fluorescenza residua di fit e risultava bassa nei microvasi trattati con ringer, ma elevata in quelli trattati con LPS. Inoltre, rispetto all'infusione di ringer, l'infusione di LPS ha causato una riduzione significativa dell'indice di permeabilità, suggerendo un aumento globale della permeabilità in tutti i vasi all'interno del campo dell'immagine.
Inoltre, rispetto all'infusione di ringer, l'infusione di LPS ha causato una riduzione significativa dell'indice di permeabilità, suggerendo un aumento globale della permeabilità in tutti i vasi presenti nel campo dell'immagine. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come preparare polmoni di uccello isolati, inserire un microcatetere nella coda sinistra e definire la permeabilità a livello microscopico.
Visualizza la trascrizione completa e accedi a migliaia di video scientifici
Panoramica
Questo articolo descrive un metodo per quantificare la permeabilità di singoli microvasi nei polmoni isolati di ratto mediante imaging fluorescente in tempo reale. Il preparato polmonare isolato perfuso con sangue consente la visualizzazione delle reti microvascolari sulla superficie del polmone.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Neuroscienze
- Biologia vascolare
- Immagini di fluorescenza
Sfondo
- Comprendere la permeabilità dei microvasi è fondamentale per lo studio della funzione polmonare.
- Le preparazioni polmonari isolate forniscono un ambiente controllato per gli esperimenti.
- L'imaging a fluorescenza consente l'osservazione in tempo reale della dinamica dei microvasi.
- Studi precedenti hanno dimostrato l'impatto di diversi trattamenti sulla permeabilità vascolare.
Scopo dello studio
- Quantificare la permeabilità in singoli microvasi di polmoni isolati di ratto.
- Utilizzare un metodo basato sulla fluorescenza per misurazioni accurate.
- Valutare gli effetti di condizioni come il trattamento con LPS sulla permeabilità dei microvasi.
Metodi Utilizzati
- Isolamento dei polmoni di ratto e perfusione con sangue autologo.
- Inserimento di un microcatetere atriale sinistro nel polmone.
- Infusione di destrina marcata con fluoresceina nei microvasi.
- Acquisizione di immagini durante il processo di infusione per l'analisi.
Risultati principali
- È stata ottenuta la quantificazione della permeabilità in singoli microvasi.
- I risultati hanno indicato diversi gradi di permeabilità in diverse condizioni sperimentali.
- L'imaging a fluorescenza ha fornito una chiara visualizzazione delle reti microvascolari.
- I dati sostengono ulteriori indagini sugli effetti dei trattamenti sui microvasi polmonari.
Conclusioni
- Il metodo quantifica efficacemente la permeabilità dei microvasi in polmoni isolati.
- L'immagine in tempo reale è uno strumento prezioso per la ricerca vascolare.
- I risultati contribuiscono alla comprensione delle risposte vascolari polmonari a diversi stimoli.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
Questo metodo consente una quantificazione diretta delle variazioni di permeabilità in singoli microvasi polmonari in condizioni infiammatorie, fornendo informazioni meccanicistiche sui percorsi di fuoriuscita vascolare. Combinando la perfusione polmonare isolata con imaging fluorescente in tempo reale, supporta la validazione di bersagli nei modelli di infiammazione polmonare e facilita la valutazione preclinica di candidati protettivi della barriera. L'approccio riduce la dipendenza dall'elaborazione dei tessuti a fine sperimentazione, accelerando l'acquisizione dei dati per decisioni di avanzamento o interruzione nelle fasi iniziali della scoperta.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Target
- Valore scientifico: Misura in tempo reale la fuoriuscita di fluidi attraverso segmenti venulari e capillari per verificare ipotesi terapeutiche nell'infiammazione vascolare.
- Valore operativo: Consente il confronto diretto delle risposte di permeabilità tra diversi letti vascolari all'interno dello stesso preparato polmonare.
Sviluppo di screening e saggi
- Valore scientifico: Genera letture quantitative dell'intensità di fluorescenza per valutare gli effetti dei composti sulla permeabilità dei microvasi.
- Valore operativo: Standardizza le condizioni di perfusione e di imaging per uno screening vascolare riproducibile e ad alto contenuto informativo.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Valore scientifico: Collega i cambiamenti di permeabilità indotti dal LPS ai meccanismi rilevanti per la malattia nell'insulto polmonare acuto.
- Valore operativo: Permette la modellizzazione dose-risposta e la correlazione farmacocinetica-farmacodinamica negli studi preclinici.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Il metodo si inserisce nel percorso di scoperta che va dalla validazione del bersaglio fino ai test di efficacia preclinica, in particolare per modulatori del sistema vascolare polmonare.
- Biologia della scoperta: Supporta la riduzione del rischio meccanicistica quantificando la funzione della barriera vascolare in risposta a stimoli infiammatori.
- Screening: Fornisce output pronti per il saggio e quantificabili per valutare gli effetti dei composti sulla permeabilità di singoli vasi.
- Analisi: Offre calcoli dell'indice di permeabilità derivati da immagini in time-lapse per consentire l'analisi comparativa tra condizioni.
- Ricerca traslazionale: Collega le risposte microvascolari a modelli preclinici di danno polmonare mediante stimolazione con LPS.
- Riutilizzo aziendale: Stabilisce una piattaforma riutilizzabile per valutare la permeabilità vascolare in diversi classi di composti e modelli di malattia.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Riduce l'ambiguità meccanicistica nei percorsi di fuoriuscita vascolare grazie a una risoluzione diretta a livello di singolo vaso.
- Valore operativo: Standardizza le procedure di infusione con microcatetere e di imaging per garantire riproducibilità tra diversi laboratori.
- Valore strategico: Migliora le decisioni di proseguimento o interruzione dello sviluppo fornendo precoci segnali quantitativi sulla sicurezza vascolare.
- Impatto sul portafoglio: Permette una priorizzazione dei candidati basata sugli effetti vascolari polmonari, adeguata al livello di rischio.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze in chirurgia su roditori, cannullatura vascolare e microscopia a fluorescenza.
- È dipendente da sistemi di perfusione regolati dalla pressione e da infrastrutture per l'imaging intravitale.
- Necessita della standardizzazione delle velocità di infusione, delle concentrazioni di fluorocromo e dei protocolli di lavaggio tra diversi gruppi di lavoro.
- L'adattamento ad altre specie o modelli di malattia potrebbe richiedere la validazione dei parametri di perfusione e dell'accessibilità vascolare.
- I limiti pratici includono la complessità tecnica del posizionamento del microcatetere e il potenziale trauma polmonare derivante dalla cannullatura.
