Analisi automatizzata del Dynamic Ca

L'obiettivo generale del seguente esperimento è analizzare l'attività del calcio endoteliale nelle arterie coronarie del maiale mediante analisi automatizzata delle regioni di interesse (ROI). Questo viene ottenuto dissezionando e aprendo le arterie coronarie del maiale per misurare l'attività del calcio endoteliale come secondo passaggio. Viene eseguita un'analisi automatizzata delle ROI sulle misurazioni del calcio acquisite, che produce un output riassuntivo dell'attività del calcio.

I prossimi script software vengono eseguiti sui risultati al fine di analizzare statisticamente e rappresentare graficamente i dati dell'analisi dell'attività del calcio, ottenendo risultati che mostrano i parametri transitori del segnale del calcio basati sull'analisi automatizzata delle ROI e sul relativo trattamento statistico. Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti, come l'analisi manuale delle ROI, è che l'analisi automatizzata è più rapida, più completa e meno soggetta a errori dell'operatore. In questa procedura, posizionare i ventricoli destri di suino raccolti nella piastra per dissezione A-P-D-M-S contenente abbondante soluzione salina fisiologica tamponata.

Sotto il microscopio stereoscopico, rimuovere un segmento dell'arteria coronaria discendente anteriore sinistra staccandolo dagli strati circostanti del tessuto cardiaco. Prestare attenzione a non perforare la parete del vaso. Successivamente, posizionare il blocco in PDMS nella piastra per dissezioni e utilizzare un ago per fissarlo al fondo.

Aggiungere tampone nella piastra. Quindi tagliare un filo di tungsteno di diametro di circa 40 micron in 12 segmenti di lunghezza di 0,3 centimetri, formando dei microperni, e posizionarli nella piastra. Utilizzare la pinzetta per fissare un'estremità del segmento di vaso al blocco con un microperno.

Inserire con attenzione le piccole forbici a molla all'interno della cavità del vaso e praticare un'incisione longitudinalmente lungo un lato del vaso per aprirlo completamente. Successivamente, posizionare il segmento di vaso aperto con l'endotelio rivolto verso l'alto. Utilizzare i micro perni rimanenti per fissare i bordi del segmento di vaso aperto al blocco in modo che il vaso formi un rettangolo piatto.

Quindi preparare un millilitro di soluzione di carico flu oh 4:00 AM. Immergere l'intero blocco nella soluzione di carico per circa 40 minuti a temperatura ambiente al buio. Dopo il carico, lavare il blocco e immergerlo in PSS tampone per cinque-dieci minuti. Successivamente, montare il blocco su distanziali spessi da 50 a 100 micron in una camera con fondo in vetrino contenente PSS tampone.

Posizionare la camera sul portacampioni di un microscopio invertito dotato di sistema per imaging confocale e mettere a fuoco il livello delle cellule endoteliali utilizzando un software di acquisizione sequenziale delle immagini confocali per catturare sequenze temporali di fluorescenza basale per tre minuti a un ingrandimento di 20x e una frequenza di acquisizione di otto fotogrammi al secondo. Dopo tre minuti di registrazione della fluorescenza basale, sostituire la soluzione PSS tampone con lo stesso volume di sostanza P a 100 picomolari disciolta in PSS tampone ed effettuare la registrazione per altri tre minuti. In questa procedura, convertire la sequenza di immagini dell'attività calcica fluorescente ottenuta dal software di acquisizione confocale in un file in formato TIFF a scala di grigi a 8 bit senza informazioni di scala.

Quindi aprire l'immagine in J. Fare clic su Apri nel menu File e selezionare la sequenza di immagini appropriata nella finestra dell'esploratore. Per visualizzare la sequenza di immagini in J, determinare un'area di interesse (ROI) appropriata utilizzando lo strumento ROI rettangolare per stimare i limiti superiore e inferiore della diffusione spaziale dell'attività all'interno della sequenza di immagini. Successivamente, creare una nuova cartella sul disco rigido del computer e aggiungere la sequenza di immagini nella directory della cartella.

In ImageJ, fare clic sulla finestra plugin. Quindi fare clic su lc pro. Per avviare l'analisi, inserire il valore del diametro della ROI e selezionare il valore della soglia del filtro dopo la parola.

Fare clic sulla casella di controllo del trattamento farmacologico e inserire i valori dei punti temporali immediatamente prima e dopo l'aggiunta del farmaco. Quindi fare clic su OK e inserire la directory della sequenza di immagini nella finestra dell'esploratore file. In questo passaggio, scaricare la versione di R 3.0 0.2 e installarla.

Quindi aprire la versione a 32 bit di R. Successivamente fare clic su File. Poi aprire lo script e selezionare lo script del grafico traccia RR per generare report sperimentali grafici. Installare i pacchetti calibrate e gpls selezionando Pacchetti.

Installare i pacchetti e successivamente selezionare i pacchetti appropriati. Fare clic su file, quindi sul comando cambia directory e utilizzare la finestra dell'esploratore per selezionare la directory corrispondente all'output dell'analisi lc pro. Quindi fare clic sulla finestra dello script e successivamente sul comando esegui tutto per eseguire lo script qui.

Le immagini in time-lapse di una sequenza di immagini iniziale con intervallo di campionamento basale, seguita da un intervallo di campionamento stimolato dalla sostanza P, sono mostrate in sequenze di immagini in scala di grigi. Le migliori lisi per gli intervalli basale e stimolato sono state elaborate con lc Pro, e le curve di intensità scalate nel tempo provenienti da ciascuna ROI posizionata automaticamente sono mostrate qui. Istogrammi dell'ampiezza di picco, della durata a metà del valore massimo e della massima diffusione spaziale, relativi sia al controllo che agli eventi stimolati dalla sostanza P, ottenuti da un esperimento rappresentativo, sono stati elaborati. L'output di lc Pro è stato successivamente processato graficamente utilizzando R.

È importante notare che la stimolazione con la sostanza P ha aumentato il numero di eventi e determinato uno spostamento significativo verso destra della mediana dell'ampiezza e della durata, come evidenziato da un test U di Mann-Whitney. Durante l'esecuzione di questa procedura, è fondamentale ricordare di minimizzare gli artefatti dell'immagine dovuti al movimento del piano focale o a impostazioni errate del contrasto, poiché ciò potrebbe influenzare notevolmente i risultati dell'analisi.