Name: Analisi automatizzata del Dynamic Ca 2 + Segnali in sequenze di immagini (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-06-16T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 49 s
Description: Scopri l'analisi automatizzata dei segnali Ca²⁺ nell'endotelio delle arterie coronarie di maiale. Questo metodo riduce l'errore dell'utente e migliora l'efficienza nello studio della fisiologia cardiovascolare.

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Questo lavoro è stato sostenuto in parte dal National Institutes of Health Grants HL-085887, HL-092992, S10RR027535, e MOP-93676.

1. Dissezione della nave e Imaging <ol><li> Tessuto raccolto da suini giovanili nazionali, come descritto nella Martens et al 27. Posizionare raccolte ventricoli destro suina in un polidimetilsilossano (PDMS) piatto dissezione fondo contenente HEPES tamponata soluzione fisiologica (PSS). <ol><li> Con l&#39;ausilio di uno stereomicroscopio, sezionare e rimuovere un segmento discendente anteriore dell&#39;arteria coronaria (~ lunghezza 8 mm, diametro 0,5 mm) dal tessuto circostante con pinze e forbici molla rimuovendo il segmento del vaso dalle circostanti strati di tessuto cardiaco. NOTA: Fare attenzione a non forare la parete del serbatoio. </li><li> Collocare un blocco PDMS (1 x 0,5 x 0,5 cm) nel piatto dissezione, e utilizzare un ago al pin al fondo. Tagliare un filo di tungsteno di circa 40 micron di diametro in dodici ~ segmenti di lunghezza 0,3 centimetri, formando micropins, e inserire questi nel piatto. Utilizzando pinze, fissare una estremità del segmento del vaso al blocco con un MICROPIn. </li><li> Inserire con cautela piccole forbici primavera nel lume del vaso, e tagliare longitudinalmente su un lato della nave per aprirlo completamente. Orientare il segmento di vaso aperto con l&#39;endotelio alto. </li><li> Utilizzare i restanti micropins per fissare i confini del segmento del vaso aperto per bloccare tale che la nave si forma un rettangolo piatto. NOTA: piani MicroPin devono essere piegate a 90 ° e inseriti a filo con la superficie del blocco. Si deve prestare attenzione per allungare la preparazione natante senza pressioni eccessive; larghezza finale dovrebbe essere ~ 1.5X la larghezza di partenza non deformato. </li><li> Preparare un piccolo volume (~ 1 ml) di Fluo-4 soluzione AM loading mescolando Fluo-4 AM (10 mM) disciolto in DMSO con Pluronic (0,03%) in un tamponata con HEPES PSS (contenente in mM: 134 NaCl, KCl 6 , 1 MgCl, 10, 10 HEPES glucosio), e inserire l&#39;intero blocco nella soluzione di carico per circa 40 minuti a temperatura ambiente al buio. </li><li> Dopo il caricamento, lavare il blocco in HEPES bufferizzatiPSS per 5-10 min. </li><li> Montare il blocco sul 50-100 micron distanziali di spessore in una camera inferiore coprioggetti contenente HEPES tamponata PSS. NOTA: perni metallici possono essere usati come distanziatori e garantiscono il segmento del vaso è rivolta verso il basso e non toccare i distanziali. </li><li> Posizionare la camera sul palcoscenico di un microscopio invertito attrezzato per l&#39;imaging confocale, e concentrarsi sul livello delle cellule endoteliali. </li><li> Sequenze di immagini lasso di tempo la cattura di basale fluorescenza relativa per ~ 3 min a 20X di ingrandimento e un frame rate di ~ 8 fotogrammi al secondo con immagine confocale software sequenza di acquisizione. </li><li> Dopo circa 3 minuti di registrazione fluorescenza basale, sostituire HEPES soluzione tamponata PSS con lo stesso volume (~ 1 ml) di sostanza P (100 pM) disciolto in tampone HEPES PSS, e record per un supplementare 3 min. </li></ol></li></ol> 2. Analisi automatizzata <ol><li> Render sequenza di immagini (s) di attività del calcio fluorescente da software di acquisizione confocale come 8 bit, g&#39;. tif&#39; files rayscale formato senza informazioni di scala. </li><li> Aperto ImageJ, clicca su &#39;aperto&#39; nel menu File, e selezionare la sequenza di immagini appropriato nella finestra di Explorer per visualizzare la sequenza di immagini (s) in ImageJ. </li><li> Determinare un diametro ROI appropriato utilizzando lo strumento ROI rettangolare per stimare i limiti superiori e inferiori della distribuzione spaziale di attività all&#39;interno della sequenza di immagini (s). NOTA: Il diametro rettangolare media è una scelta adatta per diametro ROI. </li><li> Creare una nuova cartella sul disco rigido del computer, e aggiungere la sequenza di immagini (s) nella directory della cartella. </li><li> In ImageJ, fare clic su finestra &quot;plugins&quot;, quindi fare clic su &#39;LC_Pro&#39; per avviare l&#39;analisi. </li><li> Inserire il valore del diametro ROI e selezionare il valore di soglia del filtro (sia 0.05 o 0.01). </li><li> Fare clic sulla casella di controllo &#39;di trattamento della droga&#39; e inserire i valori del punto di tempo immediatamente prima e dopo l&#39;aggiunta del farmaco (in secondi). </li><li> Fare clic su &#39;ok&#39;, einserire la directory sequenza di immagini nella finestra di file explorer. </li></ol> 3. Uscita grafica <ol><li> Scarica R versione 3.0.2 da <a href="http://www.r-project.org/">http://www.r-project.org/</a> . </li><li> Aprire la versione a 32 bit di R. </li><li> Fare clic su &quot;file&quot;, quindi &#39;script open&#39; e selezionare script &#39;traceplot.R&#39; R per la generazione di report grafici sperimentali. </li><li> Installare la calibrazione, e gplots pacchetti tramite la scelta &quot;pacchetti&quot;, &#39;installare i pacchetti &quot;, e selezionando i pacchetti giustificativo utile. </li><li> Fare clic su &#39;file&#39;, poi &#39;change directory&#39; comando, e utilizzare la finestra di esplorazione per selezionare la directory che corrisponde all&#39;uscita analisi LC_Pro. </li><li> Cliccate sulla finestra dello script e poi il &#39;eseguire tutti&#39; comando per eseguire lo script. </li></ol>

<ol><li>Berridge, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inositol+trisphosphate+and+calcium+signalling%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Inositol trisphosphate and calcium signalling.</a> Nature. 361 (6410), 315-325 (1993).</li>
<li>Berridge, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+versatility+and+universality+of+calcium+signalling%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The versatility and universality of calcium signalling.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 1 (1), 11-21 (2000).</li>
<li>Delisle, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+four+dimensions+of+calcium+signalling+in+Xenopus+oocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Calcium%22%5BJournal%5D)">The four dimensions of calcium signalling in Xenopus oocytes.</a> Cell Calcium. 12 (2-3), 217-227 (1991).</li>
<li>Dupont, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+dynamics%3A+spatio-temporal+organization+from+the+subcellular+to+the+organ+level%5BTitle%5D)+AND+%22Int+Rev+Cytol%22%5BJournal%5D)">Calcium dynamics: spatio-temporal organization from the subcellular to the organ level.</a> Int Rev Cytol. 261, 193-245 (2007).</li>
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<li>Gaspers, L. D., Thomas, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+signaling+in+liver%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Calcium%22%5BJournal%5D)">Calcium signaling in liver.</a> Cell Calcium. (3-4), 329-342 (2005).</li>
<li>Hellman, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytoplasmic+Ca2%2B+oscillations+in+pancreatic+%C3%9F-cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Cytoplasmic Ca2+ oscillations in pancreatic ß-cells.</a> Biochem Biophys Acta. 1113 (3-4), 295-305 (1992).</li>
<li>Kansui, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+spontaneous+Ca2%2B+events+in+endothelial+cells+reflect+signalling+through+myoendothelial+gap+junctions+in+pressurized+mesenteric+arteries%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Calcium%22%5BJournal%5D)">Enhanced spontaneous Ca2+ events in endothelial cells reflect signalling through myoendothelial gap junctions in pressurized mesenteric arteries.</a> Cell Calcium. 44 (2), 135-146 (2008).</li>
<li>Tatsumi, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+the+intracellular+calcium+concentration+in+guinea-pig+myenteric+neurons+by+using+fura-2%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+res%22%5BJournal%5D)">Measurement of the intracellular calcium concentration in guinea-pig myenteric neurons by using fura-2.</a> Brain res. 451 (1-2), 371-375 (1988).</li>
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<li>Mukamel, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+analysis+of+cellular+signals+from+large-scale+calcium+imaging+data%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Automated analysis of cellular signals from large-scale calcium imaging data.</a> Neuron. 63 (6), 747-760 (2009).</li>
<li>Reidl, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Independent+component+analysis+of+high-resolution+imaging+data+identifies+distinct+functional+domains%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroimage%22%5BJournal%5D)">Independent component analysis of high-resolution imaging data identifies distinct functional domains.</a> Neuroimage. 34 (1), 94-108 (2007).</li>
<li>Wegner, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+detection+of+elementary+calcium+release+events+using+the+%C3%A1+trous+wavelet+transform%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Automated detection of elementary calcium release events using the á trous wavelet transform.</a> Biophys J. 90 (6), 2151-2163 (2006).</li>
<li>Cheng, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amplitude+distribution+of+calcium+sparks+in+confocal+images%3A+theory+and+studies+with+an+automatic+detection+method%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Amplitude distribution of calcium sparks in confocal images: theory and studies with an automatic detection method.</a> Biophys J. 76 (2), 606-617 (1999).</li>
<li>Picht, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SparkMaster%3A+automated+calcium+spark+analysis+with+ImageJ%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">SparkMaster: automated calcium spark analysis with ImageJ.</a> Am J Physiol Cell Physiol. 293 (3), (2007).</li>
<li>Abramoff, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Image+processing+with+ImageJ%5BTitle%5D)+AND+%22Biophoton+Int%22%5BJournal%5D)">Image processing with ImageJ.</a> Biophoton Int. 11, 36-42 (2004).</li>
<li>Francis, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+region+of+interest+analysis+of+dynamic+Ca2%2B+signals+in+image+sequences%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">Automated region of interest analysis of dynamic Ca2+ signals in image sequences.</a> Am J Physiol Cell Physiol. 303 (3), (2012).</li>
<li>Qian, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recruitment+of+dynamic+endothelial+Ca2%2B+signals+by+the+TRPA1+channel+activator+AITC+in+rat+cerebral+arteries%5BTitle%5D)+AND+%22Microcirculation%22%5BJournal%5D)">Recruitment of dynamic endothelial Ca2+ signals by the TRPA1 channel activator AITC in rat cerebral arteries.</a> Microcirculation. 20 (2), 138-148 (2013).</li>
<li>Taylor, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+Ca2%2B+signal+modalities+in+the+vascular+endothelium%5BTitle%5D)+AND+%22Microcirculation%22%5BJournal%5D)">Dynamic Ca2+ signal modalities in the vascular endothelium.</a> Microcirculation. 19 (5), 423-429 (2012).</li>
<li>Martens, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mucous+solids+and+liquid+secretion+by+airways%3A+studies+with+normal+pig%2C+cystic+fibrosis+human%2C+and+non-cystic+fibrosis+human+bronchi%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Lung+Cell+Mol+Physiol%22%5BJournal%5D)">Mucous solids and liquid secretion by airways: studies with normal pig, cystic fibrosis human, and non-cystic fibrosis human bronchi.</a> Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 301 (2), (2011).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Decodifica complessi Ca 2 + segnali a livello cellulare e multicellulare richiederà approcci sperimentali e analitici rigorosi. Qui, un approccio è descritto in cui il tempo risolti sequenze di immagini confocale di Ca 2 + fluorescenza dipendenti sono sottoposti ad una analisi automatizzata che identifica e quantifica statisticamente rilevanti Ca 2 + segnali all&#39;interno di campi di cellulari intatti nel caso specifico presentato, un segmento di arteria è stata isolata dal cuore di ma...

Ca 2 + è un secondo messaggero onnipresente molecola di segnalazione e Ca 2 + citosolico livelli sono altamente regolamentati. Intracellulare di Ca 2 + segnali sono complesse e includono transitori isolate, oscillazioni e moltiplicazione onde 1-4. Controllo spaziale e temporale di Ca 2 + è pensato per essere alla base fisiologica specificità del segnale, e quindi l&#39;analisi di Ca 2 + modelli di segnale è di notevole interesse per gli investigatori in più campi 5. Coloranti Ca 2 + indicatore come Fluo-4 e Fura-2 sono comunemente impiegati per misurare Ca2 + intracellulare segnali con fluorescenza microscopia 5-12. Tipicamente, temporali Ca 2 + segnali vengono valutati come cambia il tempo-dipendenti medio di fluorescenza all&#39;interno di un&#39;area definita dall&#39;utente, o regione di interesse (ROI) 5,6,13 - 16. Attualmente, analisi del ROI manuale sia in termini di tempo e di lavoro intensiva perché richiede agli utenti di identificare molti ROI ed eseguire calcoli ripetitivi 17 - 19. Queste tecniche possono essere soggette a notevoli errori degli utenti, compresa l&#39;introduzione di modalità di segnali artificiali e l&#39;esclusione di segnali diffusi 18,20 bassa ampiezza o. Algoritmi di rilevamento ROI automatizzati sono stati precedentemente implementato utilizzando una varietà di approcci statistici per determinare il posizionamento ottimale ROI, ma sono stati generalmente limitata all&#39;analisi della scansione linea o pseudo-line immagini di scansione, che limita l&#39;analisi ad una sola dimensione spaziale nel tempo 17, 19-22. Inoltre, molti algoritmi esistenti non sono sufficienti per comprendere la diversità di Ca 2 + eventi di rilascio che vanno da periodici, transitori localizzati di onde che si propagano 23,24. Valutazione complessiva delle fisiologiche Ca 2 + segnali è spesso ulteriormente complicata dalla presenza di una significativa artif immagineatto che confonde il segnale alla discriminazione rumore in molti sistemi sperimentali. In precedenza, una soluzione algoritmo di rilevamento ROI automatizzato per Ca 2 + segnale di rilevamento transitorio, implementato come plugin per il software NIH ImageJ (National Institutes of Health, Bethesda, MD), è stato sviluppato e convalidato 25,26. Questo algoritmo, chiamato LC_Pro, è stato progettato per identificare e analizzare ROI comprende Ca 2 + transitori di segnale bidimensionali time lapse sequenze di immagini. Qui un protocollo sperimentale e dimostrazione pratica rappresentativo di una applicazione dell&#39;algoritmo in porcino coronarico endotelio è fornito, con postprocessing aggiuntiva utilizzando l&#39;open source software di elaborazione statistica R per generare output grafico utilizzabile.

<table><tbody><tr><td>Piatto di dissezione</td><td>Fisher Sci</td><td>#08-772-70</td><td></td></tr><tr><td>Polidimetilsilossano (PDMS)</td>Kit <td>di elastomeri Fisher</td> <td>Sci</td><td>#NC9644388, deve essere modellato in piastre</td></tr><tr><td>PSS Sigma</td><td></td><td>#H3375-250G</td><td>HEPES acido</td></tr><tr><td>Stereomicroscopio</td><td>Nikon Inst.</td><td></td><td></td>#MNA42000</tr><tr><td>Forcipe</td><td>Fine Science Tools</td><td>#11223-20</td><td></td></tr><tr><td>Forbici a molla</td><td>Fine Science Tools</td><td>15003-08</td><td></td></tr><tr><td>Filo di tungsteno</td><td>Scientific Inst Svcs</td><td>#406</td><td></td></tr><tr><td>Fluo-4 AM</td><td>Life Tech.</td><td>#F-14201</td><td></td></tr><tr><td>Pluronic F-127</td><td>Life Tech.</td><td></td><td></td>#P3000MP</tr><tr><td>Perni metallici</td><td>Fine Science Tools</td><td>#26002-10</td><td></td></tr><tr><td>Camera inferiore</td><td></td><td></td> in vetro di copertura <td></td></tr><tr><td>Microscopio confocale a disco rotante</td> progettato su misura <td>Perkin Elmer</td><td>RS-3</td><td></td></tr><tr><td>ImageJ software</td><td></td><td></td><td><a href="http://rsbweb.nih.gov/ij/download.html">download su: http://rsbweb.nih.gov/ij/download.html</a></td></tr><tr><td>LC_Pro plugin per imageJ</td><td></td><td></td><td><a href="http://rsbweb.nih.gov/ij/plugins/lc-pro/index.html">download su: http://rsbweb.nih.gov/ij/plugins/lc-pro/index.html</a></td></tr><tr><td>R software</td><td></td><td></td><td><a href="http://www.r-project.org/">scarica su: http://www.r-project.org/</a></td></tr><tr><td>R traceplot script</td><td></td><td></td><td><a href="https://docs.google.com/file/d/0B-PSp1D9e2fjV3NIcGppUzkxdEk/edit?usp=sharing">scarica su: https://docs.google.com/file/d/0B-PSp1D9e2fjV3NIcGppUzkxdEk/edit?usp=sharing</a></td></tr></tbody></table>

analisi automatizzata del dynamic ca<sup&gt; 2 +</sup&gt; segnali in sequenze di immagini

Automated Analysis of Dynamic Ca2+ Signals in Image Sequences

Intracellulare di Ca 2 + segnali sono comunemente studiate con coloranti fluorescenti Ca 2 + indicatore e le tecniche di microscopia. Tuttavia, l&#39;analisi quantitativa di Ca 2 + dati di imaging è in termini di tempo e soggetto a bias. Automatizzati algoritmi di analisi del segnale in base alla regione di interesse (ROI) rilevazione sono state implementate per scansione misurazioni linea unidimensionale, ma non esiste alcun algoritmo corrente che integra identificazione ottimizzata e analisi di ROI in sequenze di immagini bidimensionali. Qui un algoritmo per acquisizione rapida e analisi di ROI in sequenze di immagini è descritto. Utilizza ellissi adattano ai segnali filtrati rumore per determinare il posizionamento ottimale ROI, e calcola i parametri del segnale Ca 2 + di ampiezza, durata e distribuzione spaziale. Questo algoritmo è stato implementato come plugin liberamente disponibile per ImageJ (NIH) software. Insieme con gli script di analisi scritti per l&#39;open source software di elaborazione statistica R,questo approccio fornisce una pipeline ad alta capacità per l&#39;esecuzione di analisi statistiche rapida della produzione sperimentale. Gli autori suggeriscono che l&#39;uso di questo protocollo di analisi porterà ad una caratterizzazione più completa e imparziale di fisiologica Ca 2 + segnalazione.

Un algoritmo personalizzato, LC_Pro, è stato sviluppato e realizzato al fine di effettuare l&#39;analisi automatizzata di Ca 2 + dinamiche su sequenze di immagini confocale. Come illustrato nella figura 1, l&#39;algoritmo utilizza moduli di elaborazione sequenziale a) individuare e siti di traiettoria dinamica Ca 2 + cambiare sopra statistico (p &lt;0.01) rumore, B) definire le regioni di interesse (ROI) automaticamente ai centri sito attivo, e C) il calcolo dell&#39;intensità medi...

Qui una regione romanzo di interesse protocollo di analisi basato su ordinamento ellissi best-fit assegnati a regioni di segnale positivo nel tempo bidimensionale sequenze di immagini decadenza è dimostrata. Questo algoritmo può consentire ai ricercatori di analizzare globalmente segnali fisiologici Ca 2 + con l&#39;input minimo da parte dell&#39;utente e pregiudizi.

Analisi automatizzata del Dynamic Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt; Segnali in sequenze di immagini

Intracellular Ca2+ signals are commonly studied with fluorescent Ca2+ indicator dyes and microscopy techniques. However, quantitative analysis of Ca2+ ...

L'obiettivo generale del seguente esperimento è analizzare l'attività del calcio endoteliale nelle arterie coronarie del maiale mediante analisi automatizzata delle regioni di interesse (ROI). Questo viene ottenuto dissezionando e aprendo le arterie coronarie del maiale per misurare l'attività del calcio endoteliale come secondo passaggio. Viene eseguita un'analisi automatizzata delle ROI sulle misurazioni del calcio acquisite, che produce un output riassuntivo dell'attività del calcio.I prossimi script software vengono eseguiti sui risultati al fine di analizzare statisticamente e rappresentare graficamente i dati dell'analisi dell'attività del calcio, ottenendo risultati che mostrano i parametri transitori del segnale del calcio basati sull'analisi automatizzata delle ROI e sul relativo trattamento statistico. Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti, come l'analisi manuale delle ROI, è che l'analisi automatizzata è più rapida, più completa e meno soggetta a errori dell'operatore. In questa procedura, posizionare i ventricoli destri di suino raccolti nella piastra per dissezione A-P-D-M-S contenente abbondante soluzione salina fisiologica tamponata.Sotto il microscopio stereoscopico, rimuovere un segmento dell'arteria coronaria discendente anteriore sinistra staccandolo dagli strati circostanti del tessuto cardiaco. Prestare attenzione a non perforare la parete del vaso. Successivamente, posizionare il blocco in PDMS nella piastra per dissezioni e utilizzare un ago per fissarlo al fondo.Aggiungere tampone nella piastra. Quindi tagliare un filo di tungsteno di diametro di circa 40 micron in 12 segmenti di lunghezza di 0,3 centimetri, formando dei microperni, e posizionarli nella piastra. Utilizzare la pinzetta per fissare un'estremità del segmento di vaso al blocco con un microperno.Inserire con attenzione le piccole forbici a molla all'interno della cavità del vaso e praticare un'incisione longitudinalmente lungo un lato del vaso per aprirlo completamente. Successivamente, posizionare il segmento di vaso aperto con l'endotelio rivolto verso l'alto. Utilizzare i micro perni rimanenti per fissare i bordi del segmento di vaso aperto al blocco in modo che il vaso formi un rettangolo piatto.Quindi preparare un millilitro di soluzione di carico flu oh 4:00 AM. Immergere l'intero blocco nella soluzione di carico per circa 40 minuti a temperatura ambiente al buio. Dopo il carico, lavare il blocco e immergerlo in PSS tampone per cinque-dieci minuti. Successivamente, montare il blocco su distanziali spessi da 50 a 100 micron in una camera con fondo in vetrino contenente PSS tampone.Posizionare la camera sul portacampioni di un microscopio invertito dotato di sistema per imaging confocale e mettere a fuoco il livello delle cellule endoteliali utilizzando un software di acquisizione sequenziale delle immagini confocali per catturare sequenze temporali di fluorescenza basale per tre minuti a un ingrandimento di 20x e una frequenza di acquisizione di otto fotogrammi al secondo. Dopo tre minuti di registrazione della fluorescenza basale, sostituire la soluzione PSS tampone con lo stesso volume di sostanza P a 100 picomolari disciolta in PSS tampone ed effettuare la registrazione per altri tre minuti. In questa procedura, convertire la sequenza di immagini dell'attività calcica fluorescente ottenuta dal software di acquisizione confocale in un file in formato TIFF a scala di grigi a 8 bit senza informazioni di scala.Quindi aprire l'immagine in J. Fare clic su Apri nel menu File e selezionare la sequenza di immagini appropriata nella finestra dell'esploratore. Per visualizzare la sequenza di immagini in J, determinare un'area di interesse (ROI) appropriata utilizzando lo strumento ROI rettangolare per stimare i limiti superiore e inferiore della diffusione spaziale dell'attività all'interno della sequenza di immagini. Successivamente, creare una nuova cartella sul disco rigido del computer e aggiungere la sequenza di immagini nella directory della cartella.In ImageJ, fare clic sulla finestra plugin. Quindi fare clic su lc pro. Per avviare l'analisi, inserire il valore del diametro della ROI e selezionare il valore della soglia del filtro dopo la parola.Fare clic sulla casella di controllo del trattamento farmacologico e inserire i valori dei punti temporali immediatamente prima e dopo l'aggiunta del farmaco. Quindi fare clic su OK e inserire la directory della sequenza di immagini nella finestra dell'esploratore file. In questo passaggio, scaricare la versione di R 3.0 0.2 e installarla.Quindi aprire la versione a 32 bit di R. Successivamente fare clic su File. Poi aprire lo script e selezionare lo script del grafico traccia RR per generare report sperimentali grafici. Installare i pacchetti calibrate e gpls selezionando Pacchetti.Installare i pacchetti e successivamente selezionare i pacchetti appropriati. Fare clic su file, quindi sul comando cambia directory e utilizzare la finestra dell'esploratore per selezionare la directory corrispondente all'output dell'analisi lc pro. Quindi fare clic sulla finestra dello script e successivamente sul comando esegui tutto per eseguire lo script qui.Le immagini in time-lapse di una sequenza di immagini iniziale con intervallo di campionamento basale, seguita da un intervallo di campionamento stimolato dalla sostanza P, sono mostrate in sequenze di immagini in scala di grigi. Le migliori lisi per gli intervalli basale e stimolato sono state elaborate con lc Pro, e le curve di intensità scalate nel tempo provenienti da ciascuna ROI posizionata automaticamente sono mostrate qui. Istogrammi dell'ampiezza di picco, della durata a metà del valore massimo e della massima diffusione spaziale, relativi sia al controllo che agli eventi stimolati dalla sostanza P, ottenuti da un esperimento rappresentativo, sono stati elaborati. L'output di lc Pro è stato successivamente processato graficamente utilizzando R.È importante notare che la stimolazione con la sostanza P ha aumentato il numero di eventi e determinato uno spostamento significativo verso destra della mediana dell'ampiezza e della durata, come evidenziato da un test U di Mann-Whitney. Durante l'esecuzione di questa procedura, è fondamentale ricordare di minimizzare gli artefatti dell'immagine dovuti al movimento del piano focale o a impostazioni errate del contrasto, poiché ciò potrebbe influenzare notevolmente i risultati dell'analisi.

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