Name: Analisi automatizzata del Dynamic Ca 2 + Segnali in sequenze di immagini (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-06-16T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 49 s
Description: Scopri l'analisi automatizzata dei segnali Ca²⁺ nell'endotelio delle arterie coronarie di maiale. Questo metodo riduce l'errore dell'utente e migliora l'efficienza nello studio della fisiologia cardiovascolare.

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Questo lavoro è stato sostenuto in parte dal National Institutes of Health Grants HL-085887, HL-092992, S10RR027535, e MOP-93676.

1. Dissezione della nave e Imaging <ol><li> Tessuto raccolto da suini giovanili nazionali, come descritto nella Martens et al 27. Posizionare raccolte ventricoli destro suina in un polidimetilsilossano (PDMS) piatto dissezione fondo contenente HEPES tamponata soluzione fisiologica (PSS). <ol><li> Con l&#39;ausilio di uno stereomicroscopio, sezionare e rimuovere un segmento discendente anteriore dell&#39;arteria coronaria (~ lunghezza 8 mm, diametro 0,5 mm) dal tessuto circostante con pinze e forbici molla rimuovendo il segmento del vaso dalle circostanti strati di tessuto cardiaco. NOTA: Fare attenzione a non forare la parete del serbatoio. </li><li> Collocare un blocco PDMS (1 x 0,5 x 0,5 cm) nel piatto dissezione, e utilizzare un ago al pin al fondo. Tagliare un filo di tungsteno di circa 40 micron di diametro in dodici ~ segmenti di lunghezza 0,3 centimetri, formando micropins, e inserire questi nel piatto. Utilizzando pinze, fissare una estremità del segmento del vaso al blocco con un MICROPIn. </li><li> Inserire con cautela piccole forbici primavera nel lume del vaso, e tagliare longitudinalmente su un lato della nave per aprirlo completamente. Orientare il segmento di vaso aperto con l&#39;endotelio alto. </li><li> Utilizzare i restanti micropins per fissare i confini del segmento del vaso aperto per bloccare tale che la nave si forma un rettangolo piatto. NOTA: piani MicroPin devono essere piegate a 90 ° e inseriti a filo con la superficie del blocco. Si deve prestare attenzione per allungare la preparazione natante senza pressioni eccessive; larghezza finale dovrebbe essere ~ 1.5X la larghezza di partenza non deformato. </li><li> Preparare un piccolo volume (~ 1 ml) di Fluo-4 soluzione AM loading mescolando Fluo-4 AM (10 mM) disciolto in DMSO con Pluronic (0,03%) in un tamponata con HEPES PSS (contenente in mM: 134 NaCl, KCl 6 , 1 MgCl, 10, 10 HEPES glucosio), e inserire l&#39;intero blocco nella soluzione di carico per circa 40 minuti a temperatura ambiente al buio. </li><li> Dopo il caricamento, lavare il blocco in HEPES bufferizzatiPSS per 5-10 min. </li><li> Montare il blocco sul 50-100 micron distanziali di spessore in una camera inferiore coprioggetti contenente HEPES tamponata PSS. NOTA: perni metallici possono essere usati come distanziatori e garantiscono il segmento del vaso è rivolta verso il basso e non toccare i distanziali. </li><li> Posizionare la camera sul palcoscenico di un microscopio invertito attrezzato per l&#39;imaging confocale, e concentrarsi sul livello delle cellule endoteliali. </li><li> Sequenze di immagini lasso di tempo la cattura di basale fluorescenza relativa per ~ 3 min a 20X di ingrandimento e un frame rate di ~ 8 fotogrammi al secondo con immagine confocale software sequenza di acquisizione. </li><li> Dopo circa 3 minuti di registrazione fluorescenza basale, sostituire HEPES soluzione tamponata PSS con lo stesso volume (~ 1 ml) di sostanza P (100 pM) disciolto in tampone HEPES PSS, e record per un supplementare 3 min. </li></ol></li></ol> 2. Analisi automatizzata <ol><li> Render sequenza di immagini (s) di attività del calcio fluorescente da software di acquisizione confocale come 8 bit, g&#39;. tif&#39; files rayscale formato senza informazioni di scala. </li><li> Aperto ImageJ, clicca su &#39;aperto&#39; nel menu File, e selezionare la sequenza di immagini appropriato nella finestra di Explorer per visualizzare la sequenza di immagini (s) in ImageJ. </li><li> Determinare un diametro ROI appropriato utilizzando lo strumento ROI rettangolare per stimare i limiti superiori e inferiori della distribuzione spaziale di attività all&#39;interno della sequenza di immagini (s). NOTA: Il diametro rettangolare media è una scelta adatta per diametro ROI. </li><li> Creare una nuova cartella sul disco rigido del computer, e aggiungere la sequenza di immagini (s) nella directory della cartella. </li><li> In ImageJ, fare clic su finestra &quot;plugins&quot;, quindi fare clic su &#39;LC_Pro&#39; per avviare l&#39;analisi. </li><li> Inserire il valore del diametro ROI e selezionare il valore di soglia del filtro (sia 0.05 o 0.01). </li><li> Fare clic sulla casella di controllo &#39;di trattamento della droga&#39; e inserire i valori del punto di tempo immediatamente prima e dopo l&#39;aggiunta del farmaco (in secondi). </li><li> Fare clic su &#39;ok&#39;, einserire la directory sequenza di immagini nella finestra di file explorer. </li></ol> 3. Uscita grafica <ol><li> Scarica R versione 3.0.2 da <a href="http://www.r-project.org/">http://www.r-project.org/</a> . </li><li> Aprire la versione a 32 bit di R. </li><li> Fare clic su &quot;file&quot;, quindi &#39;script open&#39; e selezionare script &#39;traceplot.R&#39; R per la generazione di report grafici sperimentali. </li><li> Installare la calibrazione, e gplots pacchetti tramite la scelta &quot;pacchetti&quot;, &#39;installare i pacchetti &quot;, e selezionando i pacchetti giustificativo utile. </li><li> Fare clic su &#39;file&#39;, poi &#39;change directory&#39; comando, e utilizzare la finestra di esplorazione per selezionare la directory che corrisponde all&#39;uscita analisi LC_Pro. </li><li> Cliccate sulla finestra dello script e poi il &#39;eseguire tutti&#39; comando per eseguire lo script. </li></ol>

<ol><li>Berridge, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inositol+trisphosphate+and+calcium+signalling%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Inositol trisphosphate and calcium signalling.</a> Nature. 361 (6410), 315-325 (1993).</li>
<li>Berridge, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+versatility+and+universality+of+calcium+signalling%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The versatility and universality of calcium signalling.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 1 (1), 11-21 (2000).</li>
<li>Delisle, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+four+dimensions+of+calcium+signalling+in+Xenopus+oocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Calcium%22%5BJournal%5D)">The four dimensions of calcium signalling in Xenopus oocytes.</a> Cell Calcium. 12 (2-3), 217-227 (1991).</li>
<li>Dupont, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+dynamics%3A+spatio-temporal+organization+from+the+subcellular+to+the+organ+level%5BTitle%5D)+AND+%22Int+Rev+Cytol%22%5BJournal%5D)">Calcium dynamics: spatio-temporal organization from the subcellular to the organ level.</a> Int Rev Cytol. 261, 193-245 (2007).</li>
<li>Hayashi, H., Miyata, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+imaging+of+intracellular+Ca2%5BTitle%5D)+AND+%22J+Pharmacol+Toxicol+Methods%22%5BJournal%5D)">Fluorescence imaging of intracellular Ca2.</a> J Pharmacol Toxicol Methods. 31 (1), 1-10 (1994).</li>
<li>Barreto-Chang, O. L., Dolmetsch, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+imaging+of+cortical+neurons+using+Fura-2+AM%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Calcium imaging of cortical neurons using Fura-2 AM.</a> J Vis Exp. 23, (2009).</li>
<li>Hong, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracellular+calcium+spikes+in+rat+suprachiasmatic+nucleus+neurons+induced+by+BAPTA-based+calcium+dyes%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Intracellular calcium spikes in rat suprachiasmatic nucleus neurons induced by BAPTA-based calcium dyes.</a> PloS One. 5 (3), (2010).</li>
<li>Kuga, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large-scale+calcium+waves+traveling+through+astrocytic+networks+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Large-scale calcium waves traveling through astrocytic networks in vivo.</a> J Neurosci. 31 (7), 2607-2614 (2011).</li>
<li>Mumtaz, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mechanism+of+agonist+induced+Ca2%2B+signalling+in+intact+endothelial+cells+studied+confocally+in+in+situ+arteries%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Calcium%22%5BJournal%5D)">The mechanism of agonist induced Ca2+ signalling in intact endothelial cells studied confocally in in situ arteries.</a> Cell Calcium. 49 (1), 66-77 (2011).</li>
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<li>Silei, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+intracellular+calcium+levels+by+the+fluorescent+Ca2%2B+indicator+Calcium-Green%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res+Brain+Res+Protoc%22%5BJournal%5D)">Measurement of intracellular calcium levels by the fluorescent Ca2+ indicator Calcium-Green.</a> Brain Res Brain Res Protoc. 5 (2), 132-134 (2000).</li>
<li>Simpson, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+measurement+of+%5BCa2%2B%5Dc%3A+basic+practical+considerations%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Fluorescent measurement of [Ca2+]c: basic practical considerations.</a> Methods Mol Biol. 937, 3-36 (2006).</li>
<li>Gaspers, L. D., Thomas, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+signaling+in+liver%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Calcium%22%5BJournal%5D)">Calcium signaling in liver.</a> Cell Calcium. (3-4), 329-342 (2005).</li>
<li>Hellman, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytoplasmic+Ca2%2B+oscillations+in+pancreatic+%C3%9F-cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Cytoplasmic Ca2+ oscillations in pancreatic ß-cells.</a> Biochem Biophys Acta. 1113 (3-4), 295-305 (1992).</li>
<li>Kansui, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+spontaneous+Ca2%2B+events+in+endothelial+cells+reflect+signalling+through+myoendothelial+gap+junctions+in+pressurized+mesenteric+arteries%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Calcium%22%5BJournal%5D)">Enhanced spontaneous Ca2+ events in endothelial cells reflect signalling through myoendothelial gap junctions in pressurized mesenteric arteries.</a> Cell Calcium. 44 (2), 135-146 (2008).</li>
<li>Tatsumi, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+the+intracellular+calcium+concentration+in+guinea-pig+myenteric+neurons+by+using+fura-2%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+res%22%5BJournal%5D)">Measurement of the intracellular calcium concentration in guinea-pig myenteric neurons by using fura-2.</a> Brain res. 451 (1-2), 371-375 (1988).</li>
<li>Lorenz, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pixel-based+criteria-oriented+analysis+of+time-lapse+Ca2%2B-fluorescence+images%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Meth%22%5BJournal%5D)">Pixel-based criteria-oriented analysis of time-lapse Ca2+-fluorescence images.</a> J Neurosci Meth. 127 (2), 157-166 (2003).</li>
<li>Mukamel, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+analysis+of+cellular+signals+from+large-scale+calcium+imaging+data%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Automated analysis of cellular signals from large-scale calcium imaging data.</a> Neuron. 63 (6), 747-760 (2009).</li>
<li>Reidl, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Independent+component+analysis+of+high-resolution+imaging+data+identifies+distinct+functional+domains%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroimage%22%5BJournal%5D)">Independent component analysis of high-resolution imaging data identifies distinct functional domains.</a> Neuroimage. 34 (1), 94-108 (2007).</li>
<li>Wegner, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+detection+of+elementary+calcium+release+events+using+the+%C3%A1+trous+wavelet+transform%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Automated detection of elementary calcium release events using the á trous wavelet transform.</a> Biophys J. 90 (6), 2151-2163 (2006).</li>
<li>Cheng, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amplitude+distribution+of+calcium+sparks+in+confocal+images%3A+theory+and+studies+with+an+automatic+detection+method%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Amplitude distribution of calcium sparks in confocal images: theory and studies with an automatic detection method.</a> Biophys J. 76 (2), 606-617 (1999).</li>
<li>Picht, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SparkMaster%3A+automated+calcium+spark+analysis+with+ImageJ%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">SparkMaster: automated calcium spark analysis with ImageJ.</a> Am J Physiol Cell Physiol. 293 (3), (2007).</li>
<li>Abramoff, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Image+processing+with+ImageJ%5BTitle%5D)+AND+%22Biophoton+Int%22%5BJournal%5D)">Image processing with ImageJ.</a> Biophoton Int. 11, 36-42 (2004).</li>
<li>Francis, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+region+of+interest+analysis+of+dynamic+Ca2%2B+signals+in+image+sequences%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">Automated region of interest analysis of dynamic Ca2+ signals in image sequences.</a> Am J Physiol Cell Physiol. 303 (3), (2012).</li>
<li>Qian, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recruitment+of+dynamic+endothelial+Ca2%2B+signals+by+the+TRPA1+channel+activator+AITC+in+rat+cerebral+arteries%5BTitle%5D)+AND+%22Microcirculation%22%5BJournal%5D)">Recruitment of dynamic endothelial Ca2+ signals by the TRPA1 channel activator AITC in rat cerebral arteries.</a> Microcirculation. 20 (2), 138-148 (2013).</li>
<li>Taylor, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+Ca2%2B+signal+modalities+in+the+vascular+endothelium%5BTitle%5D)+AND+%22Microcirculation%22%5BJournal%5D)">Dynamic Ca2+ signal modalities in the vascular endothelium.</a> Microcirculation. 19 (5), 423-429 (2012).</li>
<li>Martens, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mucous+solids+and+liquid+secretion+by+airways%3A+studies+with+normal+pig%2C+cystic+fibrosis+human%2C+and+non-cystic+fibrosis+human+bronchi%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Lung+Cell+Mol+Physiol%22%5BJournal%5D)">Mucous solids and liquid secretion by airways: studies with normal pig, cystic fibrosis human, and non-cystic fibrosis human bronchi.</a> Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 301 (2), (2011).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Decodifica complessi Ca 2 + segnali a livello cellulare e multicellulare richiederà approcci sperimentali e analitici rigorosi. Qui, un approccio è descritto in cui il tempo risolti sequenze di immagini confocale di Ca 2 + fluorescenza dipendenti sono sottoposti ad una analisi automatizzata che identifica e quantifica statisticamente rilevanti Ca 2 + segnali all&#39;interno di campi di cellulari intatti nel caso specifico presentato, un segmento di arteria è stata isolata dal cuore di ma...

Ca 2 + è un secondo messaggero onnipresente molecola di segnalazione e Ca 2 + citosolico livelli sono altamente regolamentati. Intracellulare di Ca 2 + segnali sono complesse e includono transitori isolate, oscillazioni e moltiplicazione onde 1-4. Controllo spaziale e temporale di Ca 2 + è pensato per essere alla base fisiologica specificità del segnale, e quindi l&#39;analisi di Ca 2 + modelli di segnale è di notevole interesse per gli investigatori in più campi 5. Coloranti Ca 2 + indicatore come Fluo-4 e Fura-2 sono comunemente impiegati per misurare Ca2 + intracellulare segnali con fluorescenza microscopia 5-12. Tipicamente, temporali Ca 2 + segnali vengono valutati come cambia il tempo-dipendenti medio di fluorescenza all&#39;interno di un&#39;area definita dall&#39;utente, o regione di interesse (ROI) 5,6,13 - 16. Attualmente, analisi del ROI manuale sia in termini di tempo e di lavoro intensiva perché richiede agli utenti di identificare molti ROI ed eseguire calcoli ripetitivi 17 - 19. Queste tecniche possono essere soggette a notevoli errori degli utenti, compresa l&#39;introduzione di modalità di segnali artificiali e l&#39;esclusione di segnali diffusi 18,20 bassa ampiezza o. Algoritmi di rilevamento ROI automatizzati sono stati precedentemente implementato utilizzando una varietà di approcci statistici per determinare il posizionamento ottimale ROI, ma sono stati generalmente limitata all&#39;analisi della scansione linea o pseudo-line immagini di scansione, che limita l&#39;analisi ad una sola dimensione spaziale nel tempo 17, 19-22. Inoltre, molti algoritmi esistenti non sono sufficienti per comprendere la diversità di Ca 2 + eventi di rilascio che vanno da periodici, transitori localizzati di onde che si propagano 23,24. Valutazione complessiva delle fisiologiche Ca 2 + segnali è spesso ulteriormente complicata dalla presenza di una significativa artif immagineatto che confonde il segnale alla discriminazione rumore in molti sistemi sperimentali. In precedenza, una soluzione algoritmo di rilevamento ROI automatizzato per Ca 2 + segnale di rilevamento transitorio, implementato come plugin per il software NIH ImageJ (National Institutes of Health, Bethesda, MD), è stato sviluppato e convalidato 25,26. Questo algoritmo, chiamato LC_Pro, è stato progettato per identificare e analizzare ROI comprende Ca 2 + transitori di segnale bidimensionali time lapse sequenze di immagini. Qui un protocollo sperimentale e dimostrazione pratica rappresentativo di una applicazione dell&#39;algoritmo in porcino coronarico endotelio è fornito, con postprocessing aggiuntiva utilizzando l&#39;open source software di elaborazione statistica R per generare output grafico utilizzabile.

<table><tbody><tr><td>Piatto di dissezione</td><td>Fisher Sci</td><td>#08-772-70</td><td></td></tr><tr><td>Polidimetilsilossano (PDMS)</td>Kit <td>di elastomeri Fisher</td> <td>Sci</td><td>#NC9644388, deve essere modellato in piastre</td></tr><tr><td>PSS Sigma</td><td></td><td>#H3375-250G</td><td>HEPES acido</td></tr><tr><td>Stereomicroscopio</td><td>Nikon Inst.</td><td></td><td></td>#MNA42000</tr><tr><td>Forcipe</td><td>Fine Science Tools</td><td>#11223-20</td><td></td></tr><tr><td>Forbici a molla</td><td>Fine Science Tools</td><td>15003-08</td><td></td></tr><tr><td>Filo di tungsteno</td><td>Scientific Inst Svcs</td><td>#406</td><td></td></tr><tr><td>Fluo-4 AM</td><td>Life Tech.</td><td>#F-14201</td><td></td></tr><tr><td>Pluronic F-127</td><td>Life Tech.</td><td></td><td></td>#P3000MP</tr><tr><td>Perni metallici</td><td>Fine Science Tools</td><td>#26002-10</td><td></td></tr><tr><td>Camera inferiore</td><td></td><td></td> in vetro di copertura <td></td></tr><tr><td>Microscopio confocale a disco rotante</td> progettato su misura <td>Perkin Elmer</td><td>RS-3</td><td></td></tr><tr><td>ImageJ software</td><td></td><td></td><td><a href="http://rsbweb.nih.gov/ij/download.html">download su: http://rsbweb.nih.gov/ij/download.html</a></td></tr><tr><td>LC_Pro plugin per imageJ</td><td></td><td></td><td><a href="http://rsbweb.nih.gov/ij/plugins/lc-pro/index.html">download su: http://rsbweb.nih.gov/ij/plugins/lc-pro/index.html</a></td></tr><tr><td>R software</td><td></td><td></td><td><a href="http://www.r-project.org/">scarica su: http://www.r-project.org/</a></td></tr><tr><td>R traceplot script</td><td></td><td></td><td><a href="https://docs.google.com/file/d/0B-PSp1D9e2fjV3NIcGppUzkxdEk/edit?usp=sharing">scarica su: https://docs.google.com/file/d/0B-PSp1D9e2fjV3NIcGppUzkxdEk/edit?usp=sharing</a></td></tr></tbody></table>

analisi automatizzata del dynamic ca<sup&gt; 2 +</sup&gt; segnali in sequenze di immagini

Automated Analysis of Dynamic Ca2+ Signals in Image Sequences

Intracellulare di Ca 2 + segnali sono comunemente studiate con coloranti fluorescenti Ca 2 + indicatore e le tecniche di microscopia. Tuttavia, l&#39;analisi quantitativa di Ca 2 + dati di imaging è in termini di tempo e soggetto a bias. Automatizzati algoritmi di analisi del segnale in base alla regione di interesse (ROI) rilevazione sono state implementate per scansione misurazioni linea unidimensionale, ma non esiste alcun algoritmo corrente che integra identificazione ottimizzata e analisi di ROI in sequenze di immagini bidimensionali. Qui un algoritmo per acquisizione rapida e analisi di ROI in sequenze di immagini è descritto. Utilizza ellissi adattano ai segnali filtrati rumore per determinare il posizionamento ottimale ROI, e calcola i parametri del segnale Ca 2 + di ampiezza, durata e distribuzione spaziale. Questo algoritmo è stato implementato come plugin liberamente disponibile per ImageJ (NIH) software. Insieme con gli script di analisi scritti per l&#39;open source software di elaborazione statistica R,questo approccio fornisce una pipeline ad alta capacità per l&#39;esecuzione di analisi statistiche rapida della produzione sperimentale. Gli autori suggeriscono che l&#39;uso di questo protocollo di analisi porterà ad una caratterizzazione più completa e imparziale di fisiologica Ca 2 + segnalazione.

Un algoritmo personalizzato, LC_Pro, è stato sviluppato e realizzato al fine di effettuare l&#39;analisi automatizzata di Ca 2 + dinamiche su sequenze di immagini confocale. Come illustrato nella figura 1, l&#39;algoritmo utilizza moduli di elaborazione sequenziale a) individuare e siti di traiettoria dinamica Ca 2 + cambiare sopra statistico (p &lt;0.01) rumore, B) definire le regioni di interesse (ROI) automaticamente ai centri sito attivo, e C) il calcolo dell&#39;intensità medi...

Qui una regione romanzo di interesse protocollo di analisi basato su ordinamento ellissi best-fit assegnati a regioni di segnale positivo nel tempo bidimensionale sequenze di immagini decadenza è dimostrata. Questo algoritmo può consentire ai ricercatori di analizzare globalmente segnali fisiologici Ca 2 + con l&#39;input minimo da parte dell&#39;utente e pregiudizi.

Analisi automatizzata del Dynamic Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt; Segnali in sequenze di immagini

Intracellular Ca2+ signals are commonly studied with fluorescent Ca2+ indicator dyes and microscopy techniques. However, quantitative analysis of Ca2+ ...

L'obiettivo generale del seguente esperimento è analizzare l'attività del calcio endoteliale nelle arterie coronarie del maiale mediante analisi automatizzata delle regioni di interesse (ROI). Questo viene ottenuto dissezionando e aprendo le arterie coronarie del maiale per misurare l'attività del calcio endoteliale come secondo passaggio. Viene eseguita un'analisi automatizzata delle ROI sulle misurazioni del calcio acquisite, che produce un output riassuntivo dell'attività del calcio.I prossimi script software vengono eseguiti sui risultati al fine di analizzare statisticamente e rappresentare graficamente i dati dell'analisi dell'attività del calcio, ottenendo risultati che mostrano i parametri transitori del segnale del calcio basati sull'analisi automatizzata delle ROI e sul relativo trattamento statistico. Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti, come l'analisi manuale delle ROI, è che l'analisi automatizzata è più rapida, più completa e meno soggetta a errori dell'operatore. In questa procedura, posizionare i ventricoli destri di suino raccolti nella piastra per dissezione A-P-D-M-S contenente abbondante soluzione salina fisiologica tamponata.S

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Dettagli di metodi ad alta risoluzione...

Focale Ca 2 + Rilevamento transitoria nel muscolo liscio

In miociti cardiaci, strutture a membrana tubolare formano reti intracellulari. Descriviamo protocolli per i) l'isolamento dei miociti da cuore del mouse, tra cui il controllo di qualità, ii) la colorazione delle cellule vive per microscopia state-of-the-art fluorescenza ottimizzato, e iii) analisi di immagine diretta di quantificare la complessità dei componenti e la plasticità della membrana intracellulare reti.

Analisi della membrana tubolare reti in Cardiac miociti da atri e ventricoli

Qui presentiamo tecniche per l'imaging di eventi locali di Ca2+ mediati da IP3 utilizzando la microscopia a fluorescenza in cellule di mammifero intatte caricate con indicatori di Ca2+ insieme a un algoritmo che automatizza l'identificazione e l'analisi di questi eventi.

Imaging locale Ca<sup&gt; 2+</sup&gt; Segnali in cellule di mammifero coltivate

Presentiamo una soluzione software per il monitoraggio semi-automatico della concentrazione proteica relativa lungo la lunghezza delle protuberanze cellulari dinamiche.

Un&#39;interfaccia utente grafica per il monitoraggio assistito della concentrazione di proteine ​​in protrusioni cellulari dinamiche

Vi presentiamo un protocollo per il rilevamento ottico in tempo reale di singole proteine senza etichetta come essi sono secernuti dalle cellule viventi. Questo si basa su microscopia interferometrica scattering (iSCAT), che può essere applicata ad una varietà di diversi sistemi biologici e configurazioni.

Label-Free Imaging di singole proteine secernuto dalle cellule viventi tramite iSCAT microscopia

Indicatori di codificato geneticamente Ca2 + (GECIs) hanno cambiato radicalmente come in situ Ca2 + imaging viene eseguita. Per massimizzare il recupero dei dati da tali registrazioni, analisi appropriata di Ca2 + segnali è necessaria. I protocolli in questa carta facilitano la quantificazione di Ca2 + segnali registrati in situ utilizzando spatiotemporal mappatura e analisi delle particelle.

Applicazioni di mappatura spazio-temporale e tecniche di analisi delle particelle per quantificare la segnalazione intracellulare Ca2 + In Situ

Questo protocollo presenta passaggi per acquisire e analizzare immagini fluorescenti di calcio da periciti che riscaldano il cervello e dati sul flusso sanguigno dai vasi sanguigni vicini in topi anestetizzati. Queste tecniche sono utili per gli studi di fisiologia delle cellule murali e possono essere adattate per studiare i transitori di calcio in qualsiasi tipo di cellula.

Calcio dei periciti cerebrali e imaging emodinamico nei topi transgenici in vivo

TrackMate Analysis of Calcium Imaging (TACI) è un plugin ImageJ open source per l'analisi 3D dell'imaging del calcio che esamina il movimento sull'asse z e identifica il valore massimo di ogni z-stack per rappresentare l'intensità di una cella nel punto temporale corrispondente. Può separare i neuroni che si sovrappongono nella direzione laterale (x / y) ma su diversi piani z.

TACI: un plugin ImageJ per l'analisi 3D dell'imaging del calcio

In questo protocollo, presentiamo una nuova tecnica per la registrazione e l'analisi dei segnali di Ca2+ nelle vene intrapolmonari (piccole vene polmonari o PV) a pressioni intraluminali fisiologiche. La tecnica prevede l'isolamento di piccoli PV, l'incubazione con un indicatore di Ca2+ , l'incannulamento e la pressurizzazione, l'imaging confocale dei segnali di Ca2+ e l'analisi dei dati.

Imaging dei segnali Ca2+ in piccole vene polmonari a pressioni intraluminali fisiologiche

In questo rapporto, proponiamo una nuova applicazione di resine dentali fotopolimerizzabili per la base di montaggio degli elettrodi o sonde di microdialisi in esperimenti cronica. Questo materiale permette legame diretto al cranio.

Applicazione della Luce cured resina adesiva dentale per montaggio elettrodi o sonde Microdialisi negli esperimenti cronica

Scopri l'analisi automatizzata dei segnali Ca²⁺ nell'endotelio delle arterie coronarie di maiale. Questo metodo riduce l'errore dell'utente e migliora l'efficienza nello studio della fisiologia cardiovascolare.

Analisi automatizzata del Dynamic Ca

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