Name: Lento rilascio Drug Delivery attraverso Elvax 40W al Rat Retina: Implicazioni per il trattamento di condizioni croniche (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-09-17T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 49 s
Description: Impara a preparare un complesso farmaco-resina con Elvax 40W per il rilascio prolungato di farmaci nella retina del ratto. Questo metodo economico consente la somministrazione diretta e il trattamento di patologie oculari croniche.

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Questa ricerca è stata supportata dall'Australian Research Council attraverso l'ARC Centre of Excellence in Vision Science (CE0561903), il National Health and Medical Research Council (1049990), e il Progetto regionale speciale multiasse 'Reti per l'Alta Formazione' - PO FSE Abruzzo 2007-2013 - Azione 4.II.iii.

Tutti gli esperimenti condotti erano in conformità con la Dichiarazione ARVO per l&#39;uso di animali in Oftalmica e Vision Research, e con l&#39;approvazione dell &#39;Università di L&#39;Aquila comitato etico degli animali e la sperimentazione comitato etico degli animali Australian National University. Ratti adulti (P100-200) sono stati utilizzati in questo studio. 1 Preparare il pellet Copolimero resina <ol><li> Mettere 20 pellet Elvax 40W in un piccolo bicchiere di vetro nella cappa. </li><li> Riempire il bicchiere con il 100% di etanolo garantire a coprire tutte le pellet. </li><li> Coprire il becher con Parafilm, e godersi il pellet in 100% di etanolo a temperatura ambiente per 7-10 giorni. NOTA: Da questo punto in poi, non utilizzare metallo o plastica per maneggiare o conservare la resina. </li></ol> 2 Preparare la soluzione di droga per il caricamento <ol><li> Sciogliere il farmaco di scelta nel 0,1% dimetilsolfossido (DMSO). Rendere la soluzione farmaco fino a 40 microlitri di volume.Caricare la resina con tre volte la concentrazione del farmaco che verrebbe somministrato in una singola dose. </li></ol> 3 Preparare e caricare il complesso farmaco-resina <ol><li> Trasferire le 20 palline lavati in un altro bicchiere di vetro piccolo. Sciogliere il pellet in 4 ml di diclorometano per circa 45 min. Coprire il becher con Parafilm, mentre i pellet si stanno dissolvendo. </li><li> Preparare una soluzione di Fast Verde FCF sciogliendolo in 0,1% DMSO ad una concentrazione di 0,001 mg / ml. </li><li> Prendete una pipetta, e redige 40 microlitri della soluzione di farmaco preparato in precedenza. Caricare un altro pipetta con 40 ml di soluzione veloce verde. </li><li> Aggiungere le due soluzioni contemporaneamente nel bicchiere. Mescolare rapidamente con un bicchiere mescolando asta fino a quando il colorante verde è distribuita uniformemente in tutta la miscela. </li><li> Prontamente trasferire il bicchiere sul ghiaccio secco per 10 minuti per congelare la resina digiunare. </li><li> Impostare una &quot;camera di evaporazione&quot; per far evaporare il solvente. Riempire uncontenitore più grande fino a un terzo con ciottoli solfato di calcio. Creare un pozzo in ciottoli, e posizionare con cura il bicchiere nel pozzo in modo che i sassolini arrivano fino alla metà del bicchiere, per stabilizzare il bicchiere nella camera. </li><li> Coprire il contenitore esterno più grande con Parafilm. </li><li> Trasferire la camera di evaporazione per il freezer. Conservare a -20 ° C per 2-3 settimane. </li></ol> 4 Preparare il complesso farmaco-resina per impianto chirurgico <ol><li> Rimuovere la camera di evaporazione dal freezer. Trasferire il blocco farmaco-resina solida per un piatto di vetro tenuta in ghiaccio. </li><li> Con l&#39;aiuto di un microscopio o lente, tagliare un pezzo circa 0,05 mm di diametro e 0,1 mm di lunghezza del blocco utilizzando uno strumento di trapano o punzone. </li><li> Avvolgere il resto del blocco in materiale resistente congelamento (ad esempio, un foglio di alluminio) e conservare a -20 ° C fino all&#39;utilizzo. </li></ol> 5. chirurgicamente Implant il complesso farmaco-resina nel ratto Eye </p&gt; <ol><li> Preparare l&#39;animale per un intervento chirurgico. Anestetizzare con un&#39;iniezione intraperitoneale di una miscela di ketamina (100 mg / kg di peso corporeo) e xilazina (12 mg / kg di peso corporeo). Osservare l&#39;animale fino a raggiungere anestesia totale. NOTA: L&#39;animale dovrebbe avere una perdita di movimenti (ad eccezione di respirazione), e una perdita di riflessi corneali e pizzico punta. </li><li> Trasferire l&#39;animale completamente anestetizzato al tavolo operatorio. Utilizzare mydriaticum (ad esempio, solfato di atropina), e anestetico locale (ad esempio, tetracaina cloridrato) gocce sull&#39;occhio (s) sottoposti a chirurgia. Applicare lacrime artificiali per mantenere la cornea umido durante l&#39;intervento chirurgico. Utilizzare aghi monouso e strumenti sterili per tutta la chirurgia. </li><li> Stabilizzare l&#39;occhio con un paio di pinze curve smussate dopo la pupilla è completamente dilatata. Utilizzare un microscopio operatorio per effettuare una profondità completa puntura per raggiungere il vitreo, circa 2 mm dal limbus usando un ago 25 G. </li><li> Inserire il pezzo preparato di tegli complesso farmaco-resina nella ferita puntura con un paio di pinze a punta fine, (ad esempio, pinzette) che sono in grado di penetrare il sito di puntura. </li><li> Come profilassi per le infezioni batteriche, applicare una pomata antibiotica per l&#39;occhio, per prevenire l&#39;infiammazione e prevenire la secchezza della cornea, mentre l&#39;animale si sta riprendendo. </li><li> Osservare l&#39;animale fino alla completa guarigione. Non lasciare l&#39;animale incustodito fino a quando non ha ripreso conoscenza. Non rispedire l&#39;animale verso la compagnia di altri animali fino alla completa guarigione. Se l&#39;animale mostra segni di stress o disagio, analgesici devono essere utilizzati secondo il protocollo etico approvato. </li><li> Seguire le consuete procedure sperimentali per la raccolta e l&#39;analisi del tessuto. </li><li> Al termine degli esperimenti, eutanasia dell&#39;animale con un&#39;iniezione intraperitoneale di pentobarbital (60 mg / kg di peso corporeo) 2% di soluzione di lidocaina cloridrato. </li></ol> NOTA: lidocaina cloridrato minminimizza le disagio locale.

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Gli autori non hanno nulla a divulgazione.

Questo documento dimostra l&#39;uso di un complesso farmaco-resina per la consegna lento rilascio di farmaci alla retina. Abbiamo puntato a presentare un metodo che è relativamente poco costoso e facile da applicare in un piccolo modello animale. Dato che la funzione di APB è di agire come un analogo glutammato, bloccherà la risposta retinica nell&#39;occhio. I risultati mostrano che APB ha causato il blocco della risposta retinica di una settimana dopo l&#39;impianto. Ciò indica che APB è s...

Il trattamento di malattie croniche come il diabete e pressione alta presenta molte sfide, in quanto queste malattie in genere richiedono un trattamento per lunghi periodi di tempo, spesso per tutta la vita. Ciò ha richiesto lo sviluppo di sistemi di somministrazione di farmaci a rilascio lento, che riducono la necessità di dosaggio frequente. L&#39;efficacia di questi metodi a lento rilascio è stata dimostrata attraverso lo sviluppo di pompe di insulina, per ridurre il numero di iniezioni di insulina necessarie per trattare il diabete. Le malattie croniche degli occhi, in particolare quelli che interessano i suoi strati interni, richiedono la somministrazione frequente di farmaci attraverso procedure invasive. Una tale malattia cronica che colpisce l&#39;occhio umano è la degenerazione maculare senile (AMD). Essa colpisce la retina centrale, che è uno strato di tessuto neurale situata nella parte posteriore dell&#39;occhio responsabile di avviare la visione. AMD è la principale causa di cecità nel mondo occidentale 1. Una sfida particolare per il trattamento di rimalattie fonodale è che il farmaco è necessario per raggiungere questo strato profondo negli occhi, che spesso richiede metodi invasivi di consegna. I farmaci sono di solito somministrati alla camera vitreo e la retina con iniezioni intravitreali. Tuttavia, con ogni iniezione vi è il rischio di complicanze post-iniezione, tra cui endoftalmite, distacco di retina, cataratta ed emorragia del vitreo 2. Tale rischio è moltiplicato per ogni reiniezione del farmaco. Ridurre la necessità di iniezioni multiple sarebbe un vantaggio importante nel trattamento di AMD. Per trattare la forma umida di AMD, in cui la crescita di nuovi vasi è un segno distintivo, la strategia terapeutica stabilita è di indirizzare i fattori di crescita endoteliale (VEGF) utilizzando inibitori VEGF 3. Allo stato attuale, questi vengono forniti attraverso iniezioni intravitreali ripetute. Allo stesso modo, per il trattamento di edema maculare, una complicanza comune della retinopatia diabetica, i corticosteroidi vengono consegnati attraverso iniezioni ripetute <sup&gt; 4. Consegna di questi farmaci attraverso metodi a lento rilascio potrebbe effettivamente ridurre il rischio di complicanze post-iniezione. La nozione di un sistema di erogazione di farmaci a lento rilascio è stata descritta prima con un veicolo gomma di silicone per offrire piccole molecole in tessuti animali 5. Da allora, altri metodi a lento rilascio sono stati sviluppati per fornire molecole più grandi, molti dei quali sono stati testati negli occhi. Vettori di particelle, come microsfere biodegradabili, poli-lattide-co-glicolico (PLGA) nanoparticelle e vescicole fosfolipidiche (liposomi) possono essere utili come veicoli di consegna 6,7. Nanoparticelle di PLGA e liposomi sono stati confrontati in un ambiente in vitro per la loro capacità di fornire agenti anti-cancro attraverso la sclera nel tempo 7. Entrambi i veicoli sono stati efficaci nel rilasciando lentamente la droga. Tuttavia, lo studio è stato condotto solo in un ambiente in vitro. Bochot et al. (2002) 8 testatil&#39;efficacia di liposomi per fornire molecole alla retina in vivo. Essi hanno dimostrato che i liposomi consegnare con successo i piccoli oligonucleotidi alla retina di coniglio. Gli autori hanno suggerito che i liposomi potrebbe essere utile nel trattamento di malattie della retina 8. Tuttavia, la natura di queste vescicole a galleggiare nel vitreo significa che essi saranno probabilmente sfocare o mettere in pericolo la visione 9. Okabe et al. (2003) 10 usato dischi non polimeriche biodegradabili costituite da 33% acetato di etilene-vinile applicare beta-methasone nei conigli. Hanno impiantato dischi in una tasca sclerale e dimostrato l&#39;effettivo rilascio del farmaco nel vitreo e retina per fino a un mese 10. Tuttavia, in questo particolare protocollo, l&#39;impianto era relativamente grande e rigido, e richiede una procedura chirurgica più complessa che include una vasta incisione sclerale e la sutura. Un precedente studio ha esaminato la tissue risposta a vari veicoli polimero li impiantare nella cornea degli occhi di coniglio, e ha scoperto che di etilene-vinile copolimeri acetato lavati in alcool non causano infiammazione o irritazione. Questi complessi sono stati mostrati per sostenere l&#39;erogazione dei composti più grandi in tessuti animali per lunghi periodi di tempo, qualche superiore fino a 100 giorni dipendenti dal farmaco 11. Un tale tipo di resina copolimero è stato sviluppato industrialmente in forma di Elvax 40W (40% in peso di etilene-vinil acetato contenuto di comonomero con un additivo ammide &#39;W&#39; per migliorare la maneggevolezza pellet). Questa resina copolimero è una sostanza inerte, stabile sia ambiente e la temperatura corporea. Non è stato dimostrato di causare allergie o tossicità nei tessuti biologici. Questa resina ha effettivamente fornito una grande varietà di farmaci in diversi modelli sperimentali che investigano le funzioni dei vari sistemi, come il sistema duttale mammario 12, la corteccia uditiva primaria 13,14 &lt;/ Sup&gt;, e il sistema visivo 15 rana. Questa resina è stata utilizzata anche negli occhi di consegnare la droga a sviluppare tartaruga 16,17, pollo embrione 18,19, e furetto adulto retine 20. Nel sistema nervoso centrale di ratto, la resina è stata utilizzata solo nel cervello 21-23, ma il suo uso nell&#39;occhio ratto non è stata documentata. I vantaggi di utilizzare questa resina copolimero a consegnare i farmaci lentamente alla retina rispetto ad altri metodi, è che si tratta di un composto stabile che non provoca infiammazione o irritazione negli occhi. A differenza di vettori di particelle, il complesso farmaco-resina non compromettere la visione dopo l&#39;impianto, che rimane normalmente nel sito di consegna anziché galleggianti nel vitreo. Sarebbe necessario soltanto un semplice processo di impianto nella cavità vitreale vicino al limbus dell&#39;occhio, e non richiederebbe sutura dopo l&#39;impianto. Recentemente, c&#39;è stato un emergere in diversi sistemi di consegna di nuovi, come ad esempiotecnologia delle celle incapsulate (ECT) 24,25, gli idrogel 26, 27 e microfilm. Tuttavia, il metodo utilizzato nel presente studio per la preparazione e la realizzazione del complesso farmaco-resina è sia facile da seguire e poco costoso, essendo quindi più vantaggioso per l&#39;utilizzo in un ambiente di ricerca di base. La sfida di utilizzare questo complesso per fornire trattamenti farmacologici a lungo termine è quello di determinare la concentrazione ottimale del farmaco in grado di massimizzare i benefici terapeutici di avere un minor numero di iniezioni intravitreali. Questo lavoro si propone di illustrare l&#39;utilizzo del complesso farmaco-resina per trattamento a lungo termine della retina di ratto adulto. L&#39;efficacia di questa modalità di consegna viene testata utilizzando il glutammato analogico 2-amino-4-phosphonobutyrate (APB), come la droga. APB blocca la risposta luce delle cellule bipolari ON imitando glutammato, un neurotrasmettitore endogeno nella retina 28. Quando APB compete con glutammato per il suo recettore, blocca il lighrisposta t. APB è stato utilizzato in studi fisiologici per controllare la funzione retinica e misurare il suo effetto utilizzando metodi elettrofisiologici quali elettroretinografia (ERG). In studi precedenti, APB è stato usato sia a breve termine 29 e trattamento a lungo termine della retina sviluppo; quest&#39;ultimo coinvolto dando una dose singola per via intraoculare giorno per 30 giorni 30. La stessa quantità di APB (0,092 mg in soluzione fisiologica sterile, ad una concentrazione di 50 mM) è stato utilizzato per tutte le iniezioni come suggerito nel precedente 28,29,31 lavoro. Abbiamo scelto APB per testare il complesso farmaco-resina come veicolo lento rilascio per fornire farmaci nell&#39;occhio. I metodi descritti in questo studio sono simili ai metodi precedentemente descritti comportano la preparazione del farmaco-resina complesso 16,32; tuttavia abbiamo anche dettaglio il suo utilizzo specifico negli occhi ratto adulto. Dopo impianto chirurgico della resina APB-caricato nell&#39;occhio, ERG è stata eseguita per stabilire se APB abolisce il rrisposta chiara etinal, e quindi se APB è stata rilasciata con successo nel vitreo e la retina.

<table><tbody><tr><td>Elvax 40W Pellets</td><td>Du Pont, DE, USA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dimetil solfossido (DMSO)</td><td>Sigma-Aldrich Co. LLC., MO, USA Acido</td><td></td><td></td></tr><tr><td>2-ammino-4-fosfonobutirrico (APB)</td><td>Sigma-Aldrich Co. LLC., MO, USA</td><td>A1910</td><td></td></tr><tr><td>Diclorometano</td><td>Sigma-Aldrich Co. LLC., MO, USA</td><td>34856</td><td></td></tr><tr><td>Fast Green FCF</td><td>Sigma-Aldrich Co. LLC., MO, USA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Drierite, solfato di calcio</td><td>Sigma-Aldrich Co. LLC., MO, USA</td><td>238910</td><td></td></tr><tr><td>Ketamina, Ilium Ketamil</td><td>Troy Laboratories Pty. Ltd., NSW, Australia</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Xilazina, Ilium Xylazil-20</td><td>Troy Laboratories Pty. Ltd., NSW, Australia</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Solfato di atropina, Minims collirio</td><td>Bausch & Lomb Pty. Ltd., NSW, Australia</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tetracaina cloridrato, Minims collirio</td><td>Bausch & Lomb Pty. Ltd., Nuovo Galles del Sud, Australia</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cloramfenicolo, Unguento al clorsig</td><td>Aspen Pharma Pty. Ltd., Nuovo Galles del Sud, Australia</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pentobarbital, Lethabarb</td><td>Virbac Australia Pty. Ltd., Nuovo Galles del Sud, Australia</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Lidocaina cloridrato, Ilium Lignocaine-20</td><td>Troy Laboratories Pty. Ltd., Nuovo Galles del Sud, Australia</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Punzone Uni-Core Strumento</td><td>di precisione mondiale Instruments Inc., FL, USA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pinze curve</td><td>World Precision Instruments Inc., FL, USA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microscopio operatorio, Zeiss OPMI 99</td><td>Zeiss, Germania</td><td></td><td></td>Ovest</tr><tr><td>25 G Ago da insulina</td><td>Terumo Corp., Tokyo, Giappone</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pinzette Dumont</td><td>World Precision Instruments Inc., FL, USA</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

lento rilascio drug delivery attraverso elvax 40w al rat retina: implicazioni per il trattamento di condizioni croniche

Slow-release Drug Delivery through Elvax 40W to the Rat Retina: Implications for the Treatment of Chronic Conditions

Malattie della retina sono difficili da trattare, come la retina si trova in profondità all&#39;interno dell&#39;occhio. Metodi invasivi di somministrazione di farmaci sono spesso necessari per il trattamento di queste malattie. Malattie della retina croniche come l&#39;edema retinico o neovascolarizzazione di solito richiedono più iniezioni intraoculari per trattare efficacemente la condizione. Tuttavia, i rischi associati a queste iniezioni aumentano con la consegna ripetuta del farmaco. Pertanto, metodi di consegna alternativi devono essere stabiliti in modo da minimizzare i rischi di reiniezione. Diversi altri studi hanno sviluppato metodi per fornire farmaci nel corso del tempo prolungato, attraverso materiali capaci di rilasciare sostanze chimiche lentamente nell&#39;occhio. In questa indagine, delineiamo l&#39;uso di Elvax 40W, una resina copolimero, di agire come un veicolo per la somministrazione di farmaci alla retina di ratto adulto. La resina è realizzato e caricato con il farmaco. Il complesso farmaco-resina viene poi impiantato nella cavità vitreale, dove lentamente rilasciare il farmaco sopra time. Questo metodo è stato testato utilizzando 2-amino-4-phosphonobutyrate (APB), un analogo glutammato che blocca la risposta luce della retina. È stato dimostrato che l&#39;APB è stato rilasciato lentamente dalla resina, ed è stato in grado di bloccare la risposta della retina di 7 giorni dopo l&#39;impianto. Ciò indica che la somministrazione di farmaci a lento rilascio con questa resina copolimero è efficace per il trattamento della retina, e potrebbe essere utilizzato terapeuticamente con ulteriori test.

Elettroretinografia pieno campo (ERG) è stato utilizzato per rilevare l&#39;effetto di APB sulla retina. Per i dettagli su come è stata eseguita l&#39;ERG, fare riferimento ai seguenti studi 33,34. In breve, dopo anestetizzare l&#39;animale, un elettrodo d&#39;oro è stata posta sulla cornea dell&#39;occhio, e l&#39;elettrodo di riferimento è stato posto nel cuoio capelluto anteriore tra gli occhi, per registrare l&#39;attività elettrica della retina. Gli stimoli sono stati generati utilizzando un flash elettr...

Dettagli del presente documento come Elvax 40W può essere utilizzato come metodo lento rilascio per la somministrazione di farmaci alla retina di ratto adulto. Il protocollo per la preparazione, il caricamento, e consegna del complesso farmaco-resina per l&#39;occhio viene descritto.

Lento rilascio Drug Delivery attraverso Elvax 40W al Rat Retina: Implicazioni per il trattamento di condizioni croniche

Diseases of the retina are difficult to treat as the retina lies deep within the eye. Invasive methods of drug delivery are often needed to treat these ...

L'obiettivo generale del seguente esperimento è dimostrare un metodo relativamente semplice ed economico per fornire un sistema di somministrazione prolungata del farmaco utile per trattare condizioni croniche dell'occhio. Questo risultato si ottiene innanzitutto preparando i pellet di resina a base di co-polimero, creando così un veicolo per il farmaco prescelto. Come secondo passaggio, la soluzione del farmaco e D vengono combinate per formare il complesso farmaco-resina.Successivamente, il complesso farmaco-resina viene inserito nell'occhio per garantire una somministrazione diretta del farmaco alla retina. I risultati ottenuti dimostrano la corretta somministrazione del farmaco in base all'elettroretinoscopia. L'implicazione di questa tecnica si estende quindi alla terapia delle condizioni retiniche croniche, poiché può fornire un rilascio prolungato direttamente al tessuto bersaglio.Il principale vantaggio di questa tecnica rispetto ad altri metodi esistenti, come nanoparticelle, idrogeli e microfilm, è che è relativamente semplice da seguire ed economica, e quindi realizzabile in un ambiente di laboratorio scientifico. Il primo passo consiste nel preparare le pastiglie di res

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