Name: qPCR è un metodo sensibile e rapido per il rilevamento del DNA Cytomegaloviral in fissato in formalina, incluse in paraffina biopsia (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-07-09T20:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 8 s
Description: Impara a rilevare il DNA del citomegalovirus in biopsie gastrointestinali fissate in formalina e incluse in paraffina mediante qPCR. Questo metodo sensibile supera le tecniche di colorazione convenzionali per una diagnosi più accurata.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Riconosciamo Amy Thomasson per la sua assistenza con la preparazione di questo manoscritto, e Fredrik Skarstedt e Ryan Christy per i loro sforzi nella preparazione di figure.

Con l&#39;approvazione del Institutional Review Board, una ricerca della banca dati laboratorio elettronico è stata effettuata per identificare fissato in formalina, paraffina (FFPE) blocchi che rappresentano casi di citomegalovirus (CMV) in gastrointestinali (GI) biopsie diagnosticati dal istopatologia (ematossilina eosina (H &amp; E) e / o immunoistochimica (IHC)). 1. Tissue Processing da FFPE GI biopsia <ol><li> Raccogliere FFPE GI blocchi di tessuto per la biopsia citomegalovirus (CMV) polymerase chain reaction quantitativa (qPCR). Questi blocchi sono conservati a temperatura ambiente. </li><li> Tubi Pre-label 1,7 ml microcentrifuga con il numero di identificazione univoco del blocco. </li><li> Bloccare il volantino microtomo. </li><li> Ospitare il blocco di tessuto nel morsetto. </li><li> Utilizzando una lama inutilizzato fresco, allineare il blocco all&#39;angolo coltello sul microtomo. </li><li> Regolare il microtomo per tagliare 10 sezioni micron di spessore. </li><li> Sblocca the volantino e avanzare il blocco verso la lama. </li><li> Tagliare 5 sezioni del blocco a 10 micron intervalli di spessore, permettendo ogni taglio di rotolare in un rotolo di tessuto. Assicurarsi che ogni rotolo contiene una rappresentazione adeguata dei tessuti bioptici desiderati. </li><li> Bloccare il volantino microtomo. </li><li> Con una pinza, posizionare tutti e 5 i rotoli di tessuto in provetta da centrifuga pre-etichettati, facendo attenzione a solo manipolare il rotolo dalla paraffina, al fine di ridurre il potenziale di contaminazione incrociata. Far scattare il tappo sul tubo e rimetterlo sul rack. </li><li> Rimuovere il blocco di tessuto dal microtomo. </li><li> Rimuovere e gettare la lama. </li><li> Decontaminare le superfici o strumenti che possano essere venuti a contatto con il tessuto precedente. </li><li> Inserire una lama inutilizzato fresche nella porta coltello. </li><li> Ripetere i passaggi 1,4-1,14 per ogni blocco aggiuntivo da elaborare. I tubi microcentrifuga contenenti i rotoli di tessuto possono essere conservati a temperatura ambiente fino a quando la time di estrazione del DNA. </li></ol> 2. Estrazione DNA da Rotoli di FFPE GI biopsia NOTA: Questo protocollo è tratto dal foglietto illustrativo del tessuto kit FFPE DNA di estrazione (ATTENZIONE: fare riferimento alla Scheda Dati di Sicurezza (SDS)). <ol><li> Aggiungere 1 ml di xilene (ATTENZIONE: fare riferimento alla scheda di sicurezza) ad ogni provetta per microcentrifuga campione. Chiudere il coperchio e mescolare vigorosamente nel vortex per 10 secondi. </li><li> Procedere con l&#39;estrazione del DNA come specificamente indicato nel foglio illustrativo del produttore con le seguenti modifiche. </li><li> Primo aggiungere 6 ml di controllo interno (IC) ad ogni provetta per microcentrifuga. <ol><li> A seguito della ATL / proteinasi K lisi incubazione a 56 ° C per 1 ora, incubare a 99 ° C per 30 min, anziché 90 ° C per 1 ora. </li><li> Durante l&#39;ultima fase di eluizione del DNA, aprire con cautela il coperchio della colonna di purificazione del DNA e applicare 50 microlitri di acqua DNasi / RNasi-free distillata al centro della membrana, anziché buffer ATE. NOTA: Consultare il foglietto illustrativo per la conservazione e preparazione dei reagenti appropriati. DNA deve essere estratto da tutti e 5 i rotoli FFPE. Eseguire tutte le fasi di centrifugazione a temperatura ambiente (15-25 ° C). </li></ol></li></ol> 3. QPCR per CMV <ol><li> Polymerase Chain Reaction (PCR) Procedimento <ol><li> Generare un foglio di lavoro di Excel PCR per la sessione d&#39;analisi CMV. Questo foglio di lavoro Excel calcola la quantità totale di ogni reagente necessario per rendere il master mix con Mg. Si moltiplica la quantità di ogni reagente necessario per campione (elencati di seguito) volte il numero di campioni e controlli più uno (per compensare la perdita a causa di pipettaggio). <ol><li> Comprendono i seguenti reagenti in ciascuna reazione PCR nella quantità indicata: Reagente0; Importo per campione CMV LC master mix fiala 12,5 ml Mg soluzione giallo fiala 2,5 ml Volume totale 15.0 ml </li></ol></li><li> Includere in ogni test, eseguire un acqua o nessun controllo di destinazione (NTC), controllo negativo, un controllo basso positivo, un alto controllo positivo, e sia QS3 o QS4, e tutti i campioni dei pazienti. I capillari devono essere impostati in questo ordine. </li><li> Ottenere il blocco di raffreddamento specifico per lo strumento PCR in tempo reale che viene conservata a 4 ° C. Posizionare i tubi capillari appropriate nel blocco di raffreddamento. Non toccare la superficie dei capillari. Utilizzare sempre guanti quando si maneggiano i capillari. </li><li> Impostare tutte le reazioni a catena della polimerasi in una cappa pulita, non inquinata con l&#39;amplificazione produzionets. <ol><li> Rimuovere il corretto numero di flaconcini di maestri del kit PCR per testare tutti i campioni dei pazienti, più 5 controlli. Lasciate che i flaconi master, soluzione Mg e PCR grado disgelo dell&#39;acqua nel blocco di raffreddamento. Ogni flaconcino master contiene reagenti sufficienti per 12 test. </li><li> Vortice delicatamente le fiale di master e rapido li girare nella centrifuga alla massima velocità. </li><li> Unire il contenuto di ciascun flacone maestro in un flaconcino, e agitare delicatamente di nuovo. </li><li> Unire il master mix e la soluzione Mg nelle quantità indicate nel foglio di lavoro PCR in un unico tubo microcentrifuga sterile. </li><li> Mescolare delicatamente e un&#39;aliquota di 15 ml di master mix con Mg in ogni provetta capillare, tranne il capillare in posizione 5, che è per lo standard di quantificazione (QS). </li></ol></li><li> Spostare il blocco di raffreddamento contenente i capillari e le master mix con Mg dalla cappa pulita ad una cappa di elaborazione. </li><li> Aggiungere 2 ml di controllo interno (IC) per i rimanenti 30 ml di maestromescolare con Mg. Mescolare delicatamente e aliquota 15 microlitri nel capillare in posizione 5 (posizione per il QS). </li><li> Pipettare 10 ml di acqua, controllano il DNA, o DNA campione nel tubo capillare appropriata. Tappare le provette capillari utilizzando lo strumento di tappatura. </li><li> Prendere raffreddamento blocco / campioni allo strumento PCR real-time. </li></ol></li><li> Programmare il real-time PCR Instrument (cfr. tabella 1) </li><li> Amplificazione e la rilevazione eseguite sullo strumento PCR real-time <ol><li> Accedere al computer </li><li> Fare doppio clic sull&#39;icona dello strumento e accedere al software. </li><li> Accendere lo strumento PCR real-time </li><li> Clicca su &quot;CMV / EBV&quot; dallo schermo anteriore. </li><li> Seguire le istruzioni della procedura guidata macro. </li><li> Selezionare la casella per eseguire un auto-test quando richiesto dal software. Un self-test deve essere eseguito una volta al giorno lo strumento è in uso. </li><li> Assegnare un nome alla corsa. </li><li> Regolare il conteggio del campione si trova nella LEF superioret angolo della pagina per la somma di controlli e pazienti inclusi nella corsa e inserire il numero identificativo di ogni campione del paziente. </li><li> Fare clic sulla scheda &quot;Abs Quant&quot;. </li><li> In &quot;Tipo di campione&quot;, assegnare il tipo di campione appropriato per lo standard. </li><li> Digitare le concentrazioni previste per lo standard di quantificazione (QS). </li><li> Rimuovere i tubi capillari sul blocco di raffreddamento e metterli nella posizione corrispondente nella giostra (raffreddamento blocco campioni # 1 deve essere posto in posizione # 1 sulla giostra, ecc). </li><li> Posizionare la giostra in centrifuga e premere start dello strumento. </li><li> Aprire centrifuga e rimuovere la giostra. </li><li> Posizionare la giostra nello strumento PCR real-time. Chiudere il coperchio. </li><li> Premere il tasto &quot;Start Esegui&quot;. </li><li> Lo strumento PCR real-time controllerà ogni posizione per un campione. Non a piedi dallo strumento fino a quando questo controllo è stato completato, specialmentecialmente se uno dei capillari non è nel carosello. Lo strumento di notare che questo e chiedere se la corsa deve essere continuato. Rispondere di sì prima di partire. </li><li> Una volta che la corsa è completa, chiudere il report che è stato generato. </li><li> Clicca su &quot;Absolute Quantitation&quot;. </li><li> Fare clic sulla freccia accanto a Colore compensazione. </li><li> Fare clic su &quot;Select compensazione del colore&quot; dalla casella a discesa. </li><li> Scegliere il file di compensazione colore più attuale da applicare alla corsa. </li><li> Fare clic su OK quando la finestra si apre. </li><li> Fare clic sulla freccia curva standard. </li><li> Selezionare &quot;uso esterno&quot; dal menu a discesa. </li><li> Selezionare più file corrente curva standard esterno, quindi fare clic su OK. </li><li> Guardate ogni curva sotto il menu Assoluto Quantificazione per garantire che le curve siano presenti e non linea piatta, se la concentrazione è assegnato. L&#39;Assoluto quantificazione del 705/Back 530 viene analizzata automaticamente. </li></ol></li><li> Qucontrollo nalità <ol><li> Genera una nuova curva standard ogni volta che viene ricevuto un numero nuovo lotto di reagenti, o ogni sei mesi, a seconda di quale è più frequente. </li><li> Aggiungere 10 ml di ogni standard al master mix con Mg. Considerate le norme incluse nel kit come DNA precedentemente estratto. </li><li> Aggiungere 1 ml di controllo interno per ogni standard al master mix con Mg utilizzati per generare la curva standard per assicurare quantificazione accurata. Non aggiungere IC al master mix con Mg per il Control Template No (NTC). </li><li> Preparare un NTC e tre repliche di quantificazione Standards QS 4, 3, 2, 1, e una diluizione 1:10 del QS4 per la corsa per generare la curva standard, pari a 16 punti dati. </li><li> Selezionare &quot;replica di&quot; nel menu a tendina per gli standard ripetute </li><li> Scegli canale 530/back nessuno e attivare compensazione del colore quando si analizza la corsa, </li><li> In &quot;Curva Standard (In Run)&quot;, selezionare &quot;salva con nome exinterna &quot;e il nome della curva. Inserisci il commento &quot;applicato come curva standard&quot; per il salvataggio. </li><li> Rappresentare graficamente i risultati. Il coefficiente di linearità risultante deve essere ≥ 0,81. </li><li> Per le corse giornaliere, includere una copia del QS3 o QS4 come controllo nella corsa. L&#39;attuale curva standard esterna può essere importato in corsa durante la fase di analisi. </li><li> Esegui controlli: nessun controllo del DNA, di controllo negativo, bassi e alti controlli positivi. Carica virale atteso è determinato e regolato per ogni fornitore e numero di lotto. </li><li> Aggiungere un IC a ciascun campione e controllo durante l&#39;estrazione del DNA. </li><li> Se uno qualsiasi dei controlli cadono fuori portata, registrare i risultati inaccettabili e di sottoporre il test per la risoluzione dei problemi. </li></ol></li><li> Frequenza dei controlli <ol><li> Includere in ogni corsa: un NTC, alto positivo, e standard di controllo positivo negativo, basso. </li></ol></li></ol> NOTA: i limiti accettabili per i controlli. Nessun picchi dovrebbero essere osservared per il modello no (NTC) e controlli negativi. Peaks dovrebbero essere presenti nel canale 530 e carica virale attesi sono determinati e adeguati per ogni fornitore e il numero di lotto per i controlli positivi alte e basse.

<ol><li>Hodinka, R. L. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHodinka%2C+RL+%22Manual+of+Clnical+Microbiology%22">Manual of Clnical Microbiology</a>. 2, ASM Press. 1558-1574 (2011).</li>
<li>Lasry, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interstrain+variations+in+the+cytomegalovirus+%28CMV%29+glycoprotein+B+gene+sequence+among+CMV-infected+children+attending+six+day+care+centers%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+infectious+diseases%22%5BJournal%5D)">Interstrain variations in the cytomegalovirus (CMV) glycoprotein B gene sequence among CMV-infected children attending six day care centers.</a> The Journal of infectious diseases. 174, 606-609 (1996).</li>
<li>Murph, J. R., Baron, J. C., Brown, C. K., Ebelhack, C. L., Bale Jr, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+occupational+risk+of+cytomegalovirus+infection+among+day-care+providers%5BTitle%5D)+AND+%22JAMA+%3A+the+journal+of+the+American+Medical+Association%22%5BJournal%5D)">The occupational risk of cytomegalovirus infection among day-care providers.</a> JAMA : the journal of the American Medical Association. 265, 603-608 (1991).</li>
<li>Pass, R. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vaccine+prevention+of+maternal+cytomegalovirus+infection%5BTitle%5D)+AND+%22The+New+England+journal+of+medicine%22%5BJournal%5D)">Vaccine prevention of maternal cytomegalovirus infection.</a> The New England journal of medicine. 360, 1191-1199 (2009).</li>
<li>McCoy, M. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((qPCR+increases+sensitivity+to+detect+cytomegalovirus+in+paraffin-embedded%2C+formalin-fixed+tissue+of+gastrointestinal+biopsies%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Pathology%22%5BJournal%5D)">qPCR increases sensitivity to detect cytomegalovirus in paraffin-embedded, formalin-fixed tissue of gastrointestinal biopsies.</a> Human Pathology. 45, 48-53 (2014).</li>
<li>Mills, A. M., Guo, F. P., Copland, A. P., Pai, R. K., Pinsky, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comparison+of+CMV+detection+in+gastrointestinal+mucosal+biopsies+using+immunohistochemistry+and+PCR+performed+on+formalin-fixed%2C+paraffin-embedded+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22The+American+journal+of+surgical+pathology%22%5BJournal%5D)">A comparison of CMV detection in gastrointestinal mucosal biopsies using immunohistochemistry and PCR performed on formalin-fixed, paraffin-embedded tissue.</a> The American journal of surgical pathology. 37, 995-1000 (2013).</li>
<li>Krech, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complement-fixing+antibodies+against+cytomegalovirus+in+different+parts+of+the+world%5BTitle%5D)+AND+%22Bulletin+of+the+World+Health+Organization%22%5BJournal%5D)">Complement-fixing antibodies against cytomegalovirus in different parts of the world.</a> Bulletin of the World Health Organization. 49, 103-106 (1973).</li>
<li>Chou, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Newer+methods+for+diagnosis+of+cytomegalovirus+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Reviews+of+infectious+diseases%22%5BJournal%5D)">Newer methods for diagnosis of cytomegalovirus infection.</a> Reviews of infectious diseases. 12 Suppl 7, (1990).</li>
<li>Brytting, M., Xu, W., Wahren, B., Sundqvist, V. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytomegalovirus+DNA+detection+in+sera+from+patients+with+active+cytomegalovirus+infections%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+clinical+microbiology%22%5BJournal%5D)">Cytomegalovirus DNA detection in sera from patients with active cytomegalovirus infections.</a> Journal of clinical microbiology. 30, 1937-1941 (1992).</li>
<li>Revello, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+cytomegalovirus+in+blood+of+immunocompetent+persons+during+primary+infection%3A+prognostic+implications+for+pregnancy%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+infectious+diseases%22%5BJournal%5D)">Human cytomegalovirus in blood of immunocompetent persons during primary infection: prognostic implications for pregnancy.</a> The Journal of infectious diseases. 177, 1170-1175 (1998).</li>
<li>Shinkai, M., Bozzette, S. A., Powderly, W., Frame, P., Spector, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Utility+of+urine+and+leukocyte+cultures+and+plasma+DNA+polymerase+chain+reaction+for+identification+of+AIDS+patients+at+risk+for+developing+human+cytomegalovirus+disease%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+infectious+diseases%22%5BJournal%5D)">Utility of urine and leukocyte cultures and plasma DNA polymerase chain reaction for identification of AIDS patients at risk for developing human cytomegalovirus disease.</a> The Journal of infectious diseases. 175, 302-308 (1997).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Molti metodi di laboratorio sono disponibili per la diagnosi di citomegalovirus (CMV), tra cui la sierologia, coltura virale, saggi viremia molecolare, istologia del materiale bioptico, e, come recentemente dimostrato, saggi molecolari di fissati in formalina, inclusi in paraffina (FFPE) biopsia 5,6 tessuto. Sierologia, una volta che un pilastro della diagnosi, identifica solo in modo affidabile l&#39;esposizione e non si correla bene con acuta infezione da CMV 7. Cultura virale, sia convenzionali ...

Interpretazione del citomegalovirus (CMV) in campioni clinici è estremamente importante. CMV è un membro della sottofamiglia Betaherpesvirinae degli herpesvirus. Analogamente agli altri herpesvirus, CMV ha la capacità di stabilire infezione persistente o latente caratterizzata da una mancanza di replicazione virale attiva 1. La riattivazione del virus può verificarsi durante periodi di stress o di altro immunosoppressione, che porta alla replicazione virale attiva caratterizzata dal rilascio di virioni, che può essere accompagnata da manifestazioni di malattia 2-4. Gastrointestinale (GI) sintomi di malattia CMV spesso includono dolore addominale e / o feci sanguinolente 1. La diagnosi di CMV gastroenterite da istologia utilizza ematossilina ed eosina (H &amp; E) per identificare inclusioni virali CMV. Nei casi in cui è alta ancora presenti inclusioni evidenti si osservano sospetto clinico, immunoistochimica (IHC) è spesso utilizzato come metodo di prova aggiunto. Tuttavia, IHCpuò anche essere ostacolata da figuranti pattern di colorazione cellulare non classici rare (equivoci), rendendo difficile interpretazione (Figura 2) 5. Si è cercato di utilizzare il DNA estratto da fissati in formalina, inclusi in paraffina (FFPE) tessuti GI biopsia e quantitativa reazione a catena della polimerasi (qPCR) per rilevare CMV in biopsie di GI. Questa tecnica ha dimostrato di essere utile nel rilevamento di CMV in biopsie GI, ed è particolarmente utile in casi di colorazione IHC equivoci 5,6. Inoltre, qPCR ha anche dimostrato di correlare bene con l&#39;aggiunta di dati di test clinici CMV quando è disponibile 6. L&#39;uso di qPCR nel rilevare CMV può portare a diagnosi precoce e il trattamento in caso di sospetto clinico per CMV è alto, ma H &amp; E e CMV IHC sono negativi.

<table><tbody><tr><td>Provette per microfuga da 1,7 ml</td><td>Costar</td><td>3620</td><td></td></tr><tr><td>Pinze seghettate</td><td>Servizi di microscopia elettronica</td><td>62086-1S</td><td>Micro Pinze MF-1</td></tr><tr><td>Centrifughe da tavolo (microfuge)</td><td>Eppendorf</td><td>5424</td><td></td></tr><tr><td>Xylene</td><td>Fisher</td><td>Fisher Scientific: X3P</td><td>1 gallone</td></tr><tr><td>Etanolo</td><td>Fisher</td><td>Fisher Scientific: ET108</td><td>96-100% </td></tr><tr><td>Microtomo</td><td>Leica</td><td>RM2255</td><td></td></tr><tr><td>QIAamp DNA FFPE Kit di tessuti</td><td>Qiagen</td><td>56404</td><td></td></tr><tr><td>artus CMV LightCycler PCR ASR</td><td>Qiagen</td><td>4500025</td><td></td></tr><tr><td>CMV LC PCR Kit di supplemento</td><td>Qiagen</td><td>1031873</td><td></td></tr><tr><td>LightCycler centrifuga</td><td>Roche</td><td>75005087</td><td></td></tr><tr><td>LightCycler Blocco di raffreddamento</td><td>Roche</td><td></td><td></td>10800058001</tr><tr><td>LightCycler Strumento di Tappatura</td><td>Roche</td><td>3357317</td><td></td></tr><tr><td>Kit di Compensazione del Colore</td><td>Roche</td><td>2158850</td><td></td></tr><tr><td>LightCycler 20 &mu; l Capillari</td><td>Roche</td><td>1 909 339</td><td></td></tr><tr><td>Lame</td><td>Sakura</td><td>Fisher Scientific: 4689</td><td>Accu-Edge a basso profilo</td></tr></tbody></table>

qpcr è un metodo sensibile e rapido per il rilevamento del dna cytomegaloviral in fissato in formalina, incluse in paraffina biopsia

qPCR Is a Sensitive and Rapid Method for Detection of Cytomegaloviral DNA in Formalin-fixed, Paraffin-embedded Biopsy Tissue

E &#39;fondamentale individuare citomegalovirus (CMV) nel tratto gastrointestinale (GI) dei pazienti immunodepressi, data la loro maggior rischio di sviluppare infezioni gravi. Sono stati sviluppati molti metodi di laboratorio per la rilevazione di infezione da CMV, compresa sierologia, coltura virale, e metodi molecolari. Spesso, questi metodi riflettono coinvolgimento sistemico con CMV e non individuano il coinvolgimento del tessuto locale. Pertanto, il rilevamento di infezione da CMV nel tratto GI è spesso fatto da istologia tradizionale di tessuto bioptico. Ematossilina e eosina (H &amp; E) colorazione in combinato disposto con l&#39;immunoistochimica (IHC) sono rimasti i pilastri di esaminare tali biopsie. H &amp; E e IHC volte provocano atipici (equivoci) pattern di colorazione, rendendo difficile l&#39;interpretazione. E &#39;stato dimostrato che polymerase chain reaction quantitativa (qPCR) per CMV può correttamente essere eseguita su fissato in formalina, biopsia dei tessuti inclusi in paraffina (FFPE) per moltoalta sensibilità e specificità. L&#39;obiettivo di questo protocollo è quello di dimostrare come eseguire il test qPCR per la rilevazione di CMV nella biopsia del tessuto FFPE in un ambiente di laboratorio clinico. Questo metodo è probabile che sia di grande beneficio per i pazienti in caso di colorazione equivoca di CMV in biopsie di GI.

Un totale di 228 blocchi di tessuto sono stati testati dal quantitativo polymerase chain reaction (qPCR), che comprendeva 91 citomegalovirus (CMV) casi positivi sulla base di istologia ed immunoistochimica positiva (IHC), 18 con equivoca CMV IHC, e 79 controlli negativi. Come illustrato nella figura 2, i casi positivi CMV avrebbero dimostrato tipiche inclusioni CMV virali (A) e / o positivo colorazione IHC (B). Casi dubbi avrebbero dimostrato rare, non classici pattern ...

Questo protocollo descrive la rilevazione qPCR del citomegalovirus in un tessuto bioptico fissato in formalina e incluso in paraffina, che è rapido, sensibile, specifico e utile per interpretare modelli di colorazione equivoci di ematossilina ed eosina o immunoistochimica.

qPCR è un metodo sensibile e rapido per il rilevamento del DNA Cytomegaloviral in fissato in formalina, incluse in paraffina biopsia

It is crucial to identify cytomegalovirus (CMV) infection in the gastrointestinal (GI) tract of immunosuppressed patients, given their greater risk for ...

L'obiettivo generale della procedura seguente è aumentare la sensibilità nella rilevazione del DNA virale del citomegalovirus nei prelievi bioptici gastrointestinali, in particolare nei campioni che risultano dubbiosi con i metodi convenzionali di colorazione. Questo risultato si ottiene innanzitutto tagliando e raccogliendo sezioni sottili di tessuto bioptico gastrointestinale fissato in formalina e inclusi in paraffina. Successivamente, il DNA viene estratto dalle sezioni di tessuto per l'amplificazione.I primer specifici utilizzati amplificano selettivamente qualsiasi DNA virale del citomegalovirus. Quando i metodi convenzionali applicati su tessuto bioptico gastrointestinale mostrano risultati incerti, questo metodo sensibile può rilevare il DNA virale del citomegalovirus. Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ad altri metodi del settore, come l'ematin, l'andin e l'immunohistochimica, è che questo metodo non richiede l'interpretazione di pattern di colorazione non classici. Sulla diapositiva che illustra il taglio del tessuto bioptico gastrointestinale sarà presente Zainab van Horn, un'istotecnologa del laboratorio che illustrerà l'estrazione degli acidi nucleici, nonché l'allestimento della R-T-P-C-R in laboratorio.Rebecca Jocelyn Per questo protocollo. Avere pronti blocchi di tessuto da biopsia gastrointestinale in FFPE posizionati su ghiaccio tritato. Etichettare innanzitutto un tubo microcentrifuga per ciascun blocco campione con il numero identificativo del blocco di tessuto al microtomo.Assicurarsi che la manopola sia bloccata e inserire il blocco di tessuto nella pinza della cassetta. Verificare di utilizzare una lama nuova per prevenire contaminazioni incrociate tra i campioni. È fondamentale utilizzare una lama non usata per il primo campione.Passare a una lama diversa tra un campione e l'altro e decontaminare il microtomo tra i campioni. Successivamente, allineare il blocco all'angolo del coltello e regolare lo spessore delle sezioni a 10 micrometri. Sbloccare ora la manopola e avanzare il blocco verso la lama.Tagliare cinque sezioni del blocco a intervalli di 10 micron, permettendo a ciascuna sezione di arrotolarsi in un rotolino di tessuto. Assicurarsi che ciascun rotolino contenga una rappresentazione adeguata del tessuto bioptico desiderato. Una volta tagliati i cinque rotolini, bloccare la manopola.Quando si trasferiscono i cinque strati al tubo centrifugo etichettato, assicurarsi che la pinzetta tocchi soltanto la paraffina e non il tessuto. Chiudere il tubo con il tappo, quindi rimuovere il blocco dalla pinza della cassetta per raccogliere gli strati dal campione successivo. Per prima cosa, rimuovere e scartare la lama.E prima di caricare una nuova lama non utilizzata, decontaminare tutte le superfici che potrebbero essere venute a contatto con il campione precedente. Fino a quando i campioni non vengono ulteriormente processati, possono essere conservati a temperatura ambiente. Il seguente protocollo è adattato dal kit di estrazione del DNA da tessuti FFPE.Assicurarsi di consultare la scheda di dati di sicurezza del materiale prima di procedere. Iniziare aggiungendo un millilitro di xilene in ogni provetta campione, quindi vortexare energicamente per 10 secondi. Successivamente, seguire le istruzioni del produttore con le seguenti modifiche.Per prima cosa, aggiungere sei microlitri del controllo interno in ogni provetta. In secondo luogo, dopo l'incubazione della lisi con proteinasi K A TL a 56 gradi Celsius per un'ora. Incubare i campioni a 99 gradi Celsius per 30 minuti anziché a 90 gradi Celsius per un'ora.In terzo luogo, durante il completamento del passaggio di eluizione, invece del tampone, applicare con attenzione 50 microlitri di acqua distillata priva di DNA e RNA al centro della membrana della colonna di eluizione. Infine, tutti i passaggi di centrifugazione devono essere eseguiti a temperatura ambiente. Impostare le reazioni in una cappa sterile che non contenga contaminanti da prodotti di amplificazione provenienti dal kit.Rimuovere un numero sufficiente di fiale madri e di soluzione di magnesio per i campioni più cinque controlli. Ogni fiala madre contiene reagente sufficiente per 12 test. Dopo lo scongelamento, vortexare le fiale madri e centrifugarle brevemente alla velocità massima.Successivamente, seguendo il foglio di lavoro della PCR, combinare la soluzione di magnesio e la miscela master. Mescolare delicatamente le soluzioni mediante pipettaggio, quindi posizionarle nel blocco refrigerante. Aggiungere 15 microlitri della miscela ai capillari di prova nel blocco refrigerante, tranne nella posizione cinque.Questo capillare è riservato allo standard di quantificazione. Spostare il blocco refrigerato contenente i capillari e la miscela master con magnesio dalla cappa sterile a una cappa di elaborazione separata. Aggiungere qui due microlitri di controllo interno ai restanti 30 microlitri di miscela master.Mescolare la soluzione aspirando e dispensando con una pipetta e trasferire 15 microlitri di questa miscela nella capillare nella posizione cinque. Successivamente, aggiungere 10 microlitri di DNA di controllo con acqua o di DNA del campione nella capillare appropriata. Dopo il caricamento, chiudere le capillari con lo strumento di chiusura presente nella centrifuga per capillari.Trasferire i capillari dal blocco di raffreddamento alla posizione corrispondente nel supporto del carosello. Quindi caricare il carosello nella centrifuga ed eseguire il ciclo dopo la centrifugazione. Trasferire il carosello sul termociclatore in tempo reale ed eseguire la reazione in un secondo momento durante l'analisi.Visualizzare i dati utilizzando la quantificazione assoluta per assicurarsi che sia disponibile una curva per effettuare quantificazioni per un totale di 228. I blocchi di tessuto sono stati testati mediante QPCR 91. I blocchi erano casi positivi per CMV in base all'istologia e all'immunohistochimica positiva.18 blocchi avevano un risultato equivaricante per C-M-V-I-H-C. Gli altri 79 erano controlli negativi. Sono stati dimostrati casi positivi per CMV.Inclusioni virali tipiche da CMV e colorazione IHC positiva, oppure almeno uno dei due. I casi dubbio presentavano rari pattern di colorazione non classici, mentre i controlli negativi non mostravano istologia sospetta né colorazione IHC nei 91 tessuti positivi per CMV 88. Risultati positivi al QPCR: tra i 71 controlli negativi, uno è risultato positivo per CMV al QPCR.A. Nel protocollo testuale viene fornita una discussione sulle biopsie con colorazione C-M-V-I-H-C ambigua. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come eseguire l'estrazione del DNA da tessuto di biopsia gastrointestinale fissato in formalina e inclusi in paraffina, e successivamente la rilevazione del DNA virale del citomegalovirus mediante PCR in tempo reale.

qpcr-is-sensitive-rapid-method-for-detection-cytomegaloviral-dna

Research

Ricerca

JoVE Journal

Biology

Biologia

In questo video, le cellule infettate da virioni MCPyV sono state sottoposte a reazione a catena di ibridazione in situ per rilevare genomi specifici di MCPyV. Inoltre, la tecnica DNA-HCR è stata combinata con la FISH per visualizzare il DNA MCPyV nelle cellule della pelle umana infetta.

HCR-DNA FISH: Una tecnica di ibridazione in situ a fluorescenza per rilevare il DNA virale nelle cellule infette

Provided è un protocollo per lo sviluppo di un test di amplificazione della polimerasi ricombinasi in tempo reale per quantificare la concentrazione iniziale di campioni di DNA utilizzando un termociclatore o un microscopio e un riscaldatore per tavolini. Viene anche descritto lo sviluppo di un controllo positivo interno. Vengono forniti script per l'elaborazione di dati grezzi di fluorescenza in tempo reale.

Sviluppo di un Quantitative ricombinasi Polymerase Amplificazione Assay con un controllo positivo interno

I cromosomi progettisti del progetto Synthetic Yeast Genome, Sc2.0, possono essere distinti dalle loro controparti native utilizzando un test di genotipizzazione basato su PCR chiamato PCRTagging, che ha un punto finale di presenza/assenza. Qui descriviamo un metodo di rilevamento della PCR in tempo reale ad alto rendimento per la genotipizzazione PCRTag.

Analisi qPCRTag - A High Throughput, Real Time PCR Assay per Sc2.0 genotipizzazione

L'obiettivo di questo video è quello di dimostrare come eseguire l'estrazione del DNA automatizzato da inclusi in paraffina linee cellulari fissate in formalina (FFPE) di riferimento standard e delle gocce digitali PCR (ddPCR) analisi per individuare mutazioni rare in un ambiente clinico. Rilevamento mutazioni nei campioni FFPE dimostra l'utilità clinica di ddPCR in campioni FFPE.

Impiegando digitale Droplet PCR per identificare mutazioni BRAF V600E in inclusi in paraffina fissati in formalina Linee cella di riferimento standard

L'ottenimento di DNA genomico di alta qualità dai tessuti del tumore è un primo passo essenziale per analizzare le alterazioni genetiche mediante sequenziamento di nuova generazione. In questo articolo, presentiamo un metodo semplice e rapido per arricchire le cellule del tumore e ottenere DNA intatto dal tocco impronta campioni citologici.

Metodo semplice e veloce per ottenere alta qualità tumore del DNA da campioni clinico-patologiche utilizzando Touch Imprint citologia

Il manoscritto descrive un chip digitale test PCR per rilevare una variante rara di trascrizione CDH1 (CDH1a) nel normale fresco-congelato e tessuti del tumore ottenuti da pazienti con cancro gastrico.

Rilevamento di una variante rara trascrizione CDH1 in tessuti di cancro gastrico fresco congelato mediante PCR digitale basata su Chip

Digitale per la catena della polimerasi (PCR) è uno strumento utile per la rilevazione di alto-sensibilità di singolo nucleotide varianti e varianti numeri di copia del DNA. Qui, dimostriamo considerazioni chiave per varianti rare nel genoma umano usando la PCR digitale con il formato di chip-in-a-tubo di misurazione.

Reazione a catena della polimerasi digitale per la variazione genetica in un paziente di poliposi adenomatosa familiare sporadica utilizzando il formato di Chip-in-a-tubo

Analisi di reazione a catena della polimerasi quantitativa in tempo reale combinata con trascrizione inversa (RT-qPCR) è stato ampiamente utilizzato per misurare il livello di infezioni da virus a RNA. Qui presentiamo un'analisi di RT-qPCR diretta, che non richiede una fase di purificazione di RNA, sviluppato per la quantificazione di parecchi virus RNA, compreso il virus di febbre rompiossa.

RNA del Virus di febbre rompiossa nel supernatante di coltura delle cellule infettate da reazione a catena della polimerasi quantitativa in tempo reale di misurazione

Qui presentiamo un protocollo per rilevare le mutazioni somatiche tumorali nel DNA circolante presente nei fluidi biologici dei pazienti (biofluidi). Il nostro metodo basato sulla reazione a catena della polimerasi digitale delle goccioline (dPCR) consente la quantificazione della frequenza allelica della mutazione tumorale (MAF), facilitando un complemento minimamente invasivo alla diagnosi e al monitoraggio temporale della risposta tumorale.

Rilevamento e monitoraggio del DNA circolante associato al tumore nei biofluidi dei pazienti

Identificazione dei meccanismi alla base danno muscolare è cruciale. Qui vi presentiamo la tecnica istologica per la preparazione inclusi in paraffina e congelati sezioni dei muscoli toracici Drosophila. Questo permette l'analisi della morfologia muscolare e la localizzazione di proteine ​​e altri componenti delle cellule muscolari.

Sezioni incluse in paraffina e surgelati di Drosophila Adulti Muscoli

Impara a rilevare il DNA del citomegalovirus in biopsie gastrointestinali fissate in formalina e incluse in paraffina mediante qPCR. Questo metodo sensibile supera le tecniche di colorazione convenzionali per una diagnosi più accurata.

qPCR è un metodo sensibile e rapido per il rilevamento del DNA Cytomegaloviral in fissato in formalina, incluse in paraffina biopsia (Video) | JoVE Journal

qPCR è un metodo sensibile e rapido per il rilevamento del DNA Cytomegaloviral in fissato in formalina, incluse in paraffina biopsia

Esplora altri video