Name: siRNA screening per identificare ubiquitina e ubiquitina-come regolatori del sistema di percorsi biologici in cellule di mammifero coltivate (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-05-24T14:45:00.000+00:00
Duration: 10 min 43 s
Description: Scopri lo screening siRNA mirato per identificare nuovi regolatori del sistema ubiquitina nella risposta all'ipossia mediata da HIF1A in cellule di mammifero. Questo metodo efficiente consente di studiare vie metaboliche specifiche.

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Questo lavoro è stato supportato da The Wellcome Trust, Glaxosmithkline (GSK) e l&#39;Istituto scozzese per la segnalazione cellulare (ora parte della proteina fosforilazione MRC e l&#39;unità ubiquitylation).

1. Assay Fase di sviluppo Nota: prima di iniziare la schermata siRNA, una fase di sviluppo di analisi è fondamentale per impostare i parametri importanti per lo screening con la linea cellulare giornalista. È essenziale investire sforzo significativo in questa fase, questo sosterrà il futuro successo della schermata. <ol><li> Per caratterizzare l&#39;ipossia-reattività del U20S-HRE linea cellulare giornalista, crescere 2 x 75 cm 2 flaconi di cellule U20S-HRE al 80-90% di confluenza in Dulbeccos Modified Eagle Medium (DMEM) supplementato con 10% FBS. </li><li> Aspirare il supporto da un pallone di cellule, lavate due volte con 10 ml di PBS e staccare cellule aggiungendo 2 ml di 0,05% soluzione di tripsina-EDTA e incubando a 37 ° C per 5 min. Risospendere le cellule in 8 ml DMEM 10% FBS e pipetta su e giù per creare una sospensione cellulare omogenea. </li><li> Pipettare 20 ml di sospensione ad una camera di conteggio delle cellule, in duplicato, e inserire la camera in un cou cella automatizzatanter. Fare clic su &quot;Visualizza immagine&quot; sul software bancone cellulare e assicurarsi che le cellule sono a fuoco. Fare clic su &quot;Count&quot; e prendere nota della densità cellulare. Ripetere questa operazione per l&#39;altro duplicato e calcolare la densità media cella. Diluire le cellule con DMEM 10% FBS ad una concentrazione di 60.000 cellule / ml. </li><li> Usando una pipetta multicanale, aggiungere 100 ml (6.000 cellule) delle cellule diluite agli stessi tre colonne (ad es A5-H5, H6 e A6-A7-H7), della 5 a 96 pozzetti piastre sterili bianche pareti saggio, e il trasferimento di un umidificata 37 ° C incubatore al 5% di CO 2 durante la notte. Nota: queste piastre saranno utilizzati per determinare la potenza luciferasi ipossia-dipendente per una serie di esposizioni ipossia: 0 ore, 2 ore, 6 ore, 10 ore e 24 ore. </li><li> Alla fine del giorno seguente, nota del tempo e aggiungere la piastra ipossia 24 ore al set workstation ipossia al 1% di ossigeno. La mattina seguente, calcolare il tempo di 10 ore, 6 ore e 2 ore prima della piastra di 24 ore è dovuto essere rimosso from la workstation ipossia. In questi momenti, aggiungere 10 ore, 6 ore e 2 piastre hr alla workstation ipossia. </li><li> Preparare 30 ml di 2x combinato tampone di luciferasi lisi / dosaggio (50 mM Tris fosfato pH 7.8, 16 mM MgCl 2, 2 mM DTT, 2% Triton-X-100, il 30% di glicerolo, 1 mM ATP, 1% BSA, 0,25 mm luciferina e 8 mM Na 4 P 2 O 7). Nota: aggiungere i componenti nell&#39;ordine indicato e permettere la BSA almeno 30 minuti per sciogliere prima dell&#39;aggiunta di luciferina e Na 4 P 2 O 7. </li><li> Rimuovere tutte le piastre dalla workstation ipossia al momento opportuno. Aggiungere 100 ml di 2x tampone di luciferasi lisi / dosaggio nei rispettivi pozzetti della piastra di analisi e coprire con pellicola trasparente. Agitare le piastre su un agitatore per 10 min a 500 rpm per lisare le cellule accuratamente. </li><li> Trasferire lo stack piastra per un sistema automatico 96 e scolapiatti luminometro. Sotto il menu &quot;Protocolli&quot;, selezionare &quot;abs 595&quot; ed evidenziare tutti welLS da leggere nella piastra mappa su schermo sotto il menu &quot;bene di selezione&quot;. Fare clic su &quot;run&quot; per misurare la luminescenza di ogni bene quindi calcolare il valore medio di ogni piatto. Calcolare l&#39;ipossia-dipendente fold-aumento dell&#39;attività giornalista dividendo il valore medio di ogni piatto ipossia dalla lettura media del normoxia (0 hr ipossia) piastra di controllo. Nota: è essenziale osservare una robusta risposta luciferasi ipossia-dipendente per essere adatto per lo screening. Un metro e ottanta volte maggiore nell&#39;attività giornalista è considerato eccellente. </li><li> Creare una piastra di controllo master che contiene quattro elevato controllo (HIF1a siRNA) replicati (pozzi A1-D1), quattro basso controllo (FIH1 siRNA) replica (pozzi A12-D12), quattro buffer di controllare solo repliche (pozzi E1-H1) e quattro replicati non bersaglio controllo siRNA (E12-H12), dove tutte le piscine siRNA sono ad una concentrazione di 200 nM. Nota: i controlli alti e bassi sono stabiliti sulla base di regolatori di via noti che aumentano e Decrfacilitare la risposta all&#39;ipossia, rispettivamente. In alternativa, lo sviluppo di analisi utilizzando un sottoinsieme della libreria può essere utilizzato per identificare un adeguato controllo. </li><li> Usando una pipetta multicanale, trasferire 10 ml di ogni siRNA controllo per un piatto bianco test murato sterile. Preparare mix trasfezione di 0,1 microlitri di reagente di trasfezione in 10 microlitri di medio-siero ridotta (1:100) per bene, e il trasferimento di 10 ml di miscela di trasfezione ad ogni controllo bene. Pipetta su e giù brevemente per mescolare e lasciare la piastra a riposo per 20-60 minuti per consentire trasfezione formazione del complesso. </li><li> Preparare una sospensione cellulare di 75.000 cellule / ml con il secondo pallone di cellule U20S-HRE. Usando una pipetta multicanale, aggiungere 80 ml (6.000 cellule) della sospensione di cellule per ogni miscela di trasfezione. Trasferire la piastra ad un incubatore umidificato a 37 ° C con 5% di CO 2 per 24 ore, quindi trasferirli su una workstation ipossia per altre 24 ore ed eseguire saggi di luciferasi come descritto ai punti 1.6-1.8. </li><li> Calcolare il Z-factor per i controlli di alti e bassi con la formula Z = 1 - [3 x (deviazione standard elevato controllo + deviazione standard di controllo basso) / (media di elevato controllo - medio bassa di controllo)]. Nota: un valore compreso fra 0,5-1 indica un saggio eccellente e dovrebbe essere adoperata per. </li></ol> 2. Schermata Principale Nota: una volta che queste condizioni di base dalla fase di sviluppo di analisi sono in atto, la schermata principale può essere eseguita in triplicato in 96 formato micropiastre utilizzando il seguente protocollo. <ol><li> Grow 7 x 75 cm 2 fiaschi di cellule U20S-HRE al 80-90% di confluenza in DMEM supplementato con 10% v / v di siero fetale bovino (FCS). Nota: I seguenti passaggi 2,2-2,13 devono essere effettuate il giorno 1. </li><li> Avviare la replica 1 preparando una piastra di controllo master contenente 200 ml di ogni controllo come descritto al punto 1.9 e lo scongelamento una serie di diluizioni del siRNA ubiquitome library per un minimo di 30 min. Nota: ogni pozzetto contiene un pool di 4 siRNA assemblate in 17 piastre x 96 pozzetti con colonne 1 e 12, lasciato vuoto per i controlli. </li><li> In una cappa a flusso laminare, etichetta (o codice a barre) 17 bianchi piastre di saggio murate sterili con coperchi dai numeri 1-17, corrispondente a ciascuna piastra della serie biblioteca siRNA. </li><li> Centrifugare la piastra di controllo master e il siRNA ubiquitome brevemente biblioteca (1 min a 2.000 xg) per garantire a tutti siRNA accumulano sul fondo del pozzo. </li><li> Utilizzare un dosatore automatico di robot &quot;stamp&quot; 10 ml di ogni controllo dalla piastra di controllo master sulle piastre di saggio 17, utilizzando la stessa pila punta 96 pozzetti per ciascuna piastra. </li><li> Utilizzando un fresco 96 pozzetti pila punta per ciascuna delle piastre di biblioteca 17, trasferimento 10 ml di ogni ubiquitome siRNA alla sua piastra di saggio corrispondente utilizzando un dosatore automatico. </li><li> Preparare 40 ml di reagente di trasfezione per i 17 piastre di saggio utilizzando i es rapportofermati in in 1.10. Nota: questo include altri 20 ml per spiegare il &quot;volume morto&quot; nel dispenser cella. Il &quot;volume morto&quot; si riferisce al volume di liquido continuamente presente all&#39;interno della rete tubo nel dispenser cella. </li><li> Utilizzare il distributore automatico cella per trasferire 10 ml di reagente di trasfezione in ciascun pozzetto in piastre di saggio 17. Brevemente agitare le piastre di saggio su un agitatore (1 min a 500 rpm) per consentire un&#39;accurata miscelazione di siRNA e reagente di trasfezione, poi lasciare ancora a temperatura ambiente per 20-60 minuti per consentire siRNA: reagente di trasfezione formazione del complesso. </li><li> Lavare due 75 centimetri 2 fiaschi di cellule U20S-HRE due volte con 10 ml di PBS e staccare con 2 ml di tripsina-EDTA a 37 ° C per 5 min. Aggiungere 8 ml di DMEM 10% FBS ad ogni pallone e pipetta su e giù parecchie volte per creare una sospensione cellulare omogenea. Unire le celle di entrambe le boccette e trasferire a una sterile tubo di plastica da 50 ml. </li><li> Calcolare la concentrazione di cellule pipettando20 celle microlitri in duplicato in una camera di conteggio delle cellule e calcolare la concentrazione media di cella da due letture di un contatore automatico cella come descritto al punto 1.3. </li><li> Preparare 155 ml di sospensione cellulare diluendo con DMEM 10% FBS ad una concentrazione di 75.000 cellule per ml in un contenitore di plastica sterile. Nota: questo volume è sufficiente per 17 piastre e comprende ulteriori 25 ml di volume morto nel dispenser cella. </li><li> Aggiungere un agitatore magnetico sterile alla sospensione cellulare e posto su un agitatore allestito all&#39;interno della cappa a flusso laminare per limitare aggregazione delle cellule. Equilibrare il dispenser cellulare automatizzata con la sospensione cellulare e impostarlo per erogare 80 ml di cellule per pozzetto (6.000 celle). </li><li> Posizionare ciascuna delle 17 piastre, a sua volta, al dispenser cella automatizzata e dispensare cellule. Registrare il tempo e le piastre dello stack in gruppi di 5 quindi inserire pile in un umido 37 ° C incubatore al 5% di CO 2 per 24 ore. Nota: la concentrazione finale dipiscina siRNA sarà 20 nM in 100 microlitri di volume totale. Nota: Le seguenti operazioni 2,14-2,15 devono essere effettuate nel Day 2. </li><li> Avviare la seconda replica il giorno 2, seguendo la procedura descritta nel Day 1 per la replica 1 (2,2-2,13). </li><li> Dopo 24 ore di trasfezione, piastre di trasferimento di replica 1 in un ambiente sterile a una workstation ipossia fissati al 1% di ossigeno e lasciare per 24 ore per indurre il reporter HRE. Nota: Le seguenti operazioni 2,16-2,20 dovrebbe essere effettuata il giorno 3. </li><li> Avviare la terza replica, seguendo la procedura descritta nel Day 1 per la replica 1 (2,2-2,13). </li><li> Dopo 24 ore di trasfezione, piastre di trasferimento di replica 2 in un ambiente sterile a una workstation ipossia fissati al 1% di ossigeno e lasciare per 24 ore per indurre il reporter HRE. </li><li> Due ore prima replicano 1 piastre devono essere rimossi dalla workstation ipossia, preparare 200 ml di tampone di lisi 2x luciferasi / dosaggio come descritto al punto 1.6. Nota: questo volume inle aderiscono ulteriori 20 ml di garantire serbatoio tampone rimane ben coperto. </li><li> Rimuovere replicare 1 piastre di saggio dalla stazione di lavoro di ipossia dopo l&#39;esposizione 24 ore ipossia e con un dosatore automatico, aggiungere 100 ml di tampone 2x luciferasi lisi / dosaggio per ogni piatto dosaggio e coprire con pellicola trasparente. </li><li> Agitare le piastre su un agitatore cella per 10 min a 500 rpm per lisare le cellule accuratamente. Trasferire ogni piatto, a sua volta a un lettore di piastre luminometro e registrare luminescenza come descritto al punto 1.8. Nota: Le seguenti operazioni 2,21-2,22 devono essere effettuate il giorno 4. </li><li> Dopo 24 ore di trasfezione, piastre di trasferimento di replica 3 in un ambiente sterile a una workstation ipossia fissati al 1% di ossigeno e lasciare per 24 ore per indurre il reporter HRE. </li><li> Leggi la replica 2 piastre seguendo i passaggi 2,18-2,20 utilizzati per replicare 1. Nota: la seguente operazione 2.23 deve essere effettuata il giorno 5. </li><li> Leggi le ripetute 3 piastre seguendopasso 2,18-2,20 utilizzato per replicare 1. </li><li> Compilare tutte e 3 le repliche dello schermo primario e calcolare il fattore Z per ogni piastra utilizzando la formula di cui al 1.12. Nota: se ogni piastra ha un fattore Z inferiore a 0,5, considerare ripetendo questa piastra per migliorare la qualità dei dati. </li><li> Calcolare il coefficiente di variazione (CV) per l&#39;alta e la bassa controlli utilizzando la seguente formula: 100 x deviazione standard di controllo / media di controllo. Nota: CV deve essere il più basso possibile, è ragionevole aspettarsi che il 10-15% di variazione. Se la variazione è significativamente più elevata, considerare ripetendo la piastra. </li><li> Calcola cento attivazione di ogni siRNA per piastra utilizzando la seguente formula: [(media di elevato controllo - punteggio siRNA) / (media di elevato controllo - medio bassa di controllo)] x 100 Inoltre, calcolare il non-target (NT. )-fold di ogni siRNA utilizzando la formula [dati / medio di NT Esempio]. Sia per l&#39;attivazione cento e NT-piega, calcolare la media dei tre ReplicAtes e compilare i valori. </li><li> Utilizzando i dati grezzi, calcolare Classificato Coefficiente di correlazione di Spearman (SRCC) per determinare quanto strettamente le tre piastre replicati in correlazione con la formula: <img fo:content-width="1in" src="/files/ftp_upload/51572/51572eq1.jpg" width="120" /> dove r = SRCC; d = differenza tra i due numeri in ciascuna coppia di ranghi e n = numero di coppie di dati. Nota: una buona correlazione tra le repliche piastra darà valori prossimi a 1 Se una replica mostra partire SRCC contro gli altri 2 piastre, approfondire e considerare ripetere quel piatto.. </li><li> Decidere quali siRNA sono di sufficiente interesse per lo screening secondario (fino al 80). Impiegare cut off definite dall&#39;utente (ad esempio, la selezione di tutti i siRNA mostrano meno del 5% o oltre il 95% per cento di attivazione, o inferiore a 0,5 NT volte o più di 1,5 NT-fold) o applicare la bioinformatica o ragionamento basato sulla conoscenza per la ricerca di cluster di colpisce rientrano la stessa via UBL. Nota:normalmente, una combinazione di questi approcci determina quale siRNA sono presi in screening secondario. </li></ol> 3. Schermo secondario Nota: una schermata di conferma secondario è effettuata sulla base di un massimo di 80 siRNA di interesse dalla schermata principale. Questo numero può essere convenientemente con ciascun replicato placcato su una singola piastra a 96 pozzetti con i comandi completi come da schermata principale (vedi 2.2). E &#39;molto utile per confermare che le autorità di regolamentazione individuati nella schermata principale riproducibile suscitano lo stesso fenotipo, e questo aiuterà ad affinare le decisioni di triage su cui risultati dovrebbero essere effettuati fino alla schermata finale terziaria / deconvoluzione. <ol><li> Grow 1 x 75 cm 2 boccetta di cellule U20S-HRE al 80-90% di confluenza in DMEM con 10% FBS. </li><li> Prendere nota del numero di targa e la posizione dei colpi dello schermo primario, e pianificare la loro nuova posizione sullo schermo secondario ciliegia raccolto piatto principale, lasciando colonne 1 and 12 gratuito per i controlli. Preparare la piastra di controllo master come in 1.9 ma con un volume totale di ogni controllo di 50 microlitri. </li><li> Scongelare una seconda serie di diluizioni della biblioteca ubiquitome (mettere da parte per i singoli piscine siRNA-cherry picking) per un minimo di 30 min. Centrifugare la piastre brevemente (1 min a 2.000 xg), quindi aggiungere 50 ml di i siRNA schermo secondario per le loro nuove posizioni piastra sulla ciliegia scelto piastra master. </li><li> Effettuare lo schermo secondario utilizzando lo stesso protocollo di base delineato per la schermata principale con le seguenti modifiche: (a) eseguire tutti e tre repliche nella stessa giornata in una piastra di saggio per ogni replica e (b) regolare i volumi di reagenti di conseguenza. </li></ol> 4. Terziario Deconvolution Schermo / Nota: lo screening terziaria o deconvoluzione viene eseguita su un massimo di 20 siRNA dallo schermo secondario. Questo passo è quello di esaminare l&#39;effetto di knockdown con ogni singolo siRNA dalla cacca originalel di quattro. Normalmente, almeno due duplex siRNA individuali di ogni pool dovrebbero illecito lo stesso fenotipo di avere un ragionevole grado di fiducia che il fenotipo osservato non è dovuta a siRNA effetti off-target. Per aumentare ulteriormente la fiducia in questa fase, individuali supplementari duplex siRNA rivolti al gene in questione possono essere progettati e testati per la loro capacità di suscitare il fenotipo dato. I risultati di questi esperimenti possono quindi essere utilizzati per calcolare il punteggio H, dove H = 0,6 o superiore (cioè dove almeno 3 su 5 siRNAs singoli suscitare il fenotipo) è considerato accettabile 6. <ol><li> Crescere un 75 centimetri 2 fiasco di cellule U20S-HRE al 80-90% di confluenza in DMEM con 10% FBS. </li><li> Creare una mappa piastra per lo schermo superiore pianificando la posizione dei quattro duplex siRNA individuali di ciascun colpo sul piatto maestro schermo superiore, lasciando colonne 1 e 12, gratuito per i controlli. Preparare il piatto principale di controllo come in 1.9, ma con un totalevolume di ciascuna controllo di 50 microlitri. </li><li> Scongelare le piastre deconvolution / siRNA individuale e aggiungere 50 ml di singoli siRNA (200 Nm) in ciascun pozzetto della piastra maestro schermo terziaria secondo la mappa piastra (4.2) per consentire tre x 10 replicati microlitri e un comodo eccesso di 20 microlitri . </li><li> Effettuare la schermata terziaria utilizzando lo stesso protocollo di base delineato per la schermata principale con le seguenti modifiche: (a) eseguire tutte e tre le repliche nello stesso giorno in una piastra di saggio per ogni replica e (b) adeguare i volumi di reagenti di conseguenza </li></ol> Nota: Idealmente la soglia per i singoli duplex siRNA deve essere impostato alla stessa rigorosità cut-off come per la piscina. Tuttavia, può essere accettabile per rilassare la soglia del 10-20% per i singoli siRNA, specialmente dove almeno un&#39;altra duplex rientra nella soglia impostata. È cuscinetto pena ricordare che l&#39;effetto individuale di siRNA può essere inferiore a quello dila piscina, e viceversa, in alcuni casi specifici siRNA può mostrare un forte effetto sul fenotipo cellulare in isolamento rispetto a quando esiste in piscina (anche quando la concentrazione è rappresentato).

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</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

L&#39;uso di genoma di ampiezza schermi siRNA in cellule di mammifero ha dimostrato di essere estremamente utile per identificare nuovi regolatori di vie biologiche distinte. Qui, abbiamo descritto l&#39;uso di uno schermo ubiquitome siRNA targeting per identificare regolatori della risposta cellulare HIF1a mediata da ipossia. Schermi mirati stanno diventando sempre più attraente in quanto sono generalmente più economiche, più veloce, più facile da gestire e riferire solo sui componenti della via in cui gli investigator...

Modifica delle proteine ​​con ubiquitina e ubiquitina-come molecole (UBLs) rappresenta un sistema biochimico espansiva che regola diverse vie biologiche e risposte allo stress. L&#39;attacco covalente di UBLs alle loro proteine ​​bersaglio può avere vari risultati che regolano la stabilità, localizzazione, funzione o interattoma del substrato 1. I passaggi enzimatici sottostanti modifica UBL sono stati stabiliti in primo luogo per ubiquitina, e ora servono come paradigma per la modifica con la maggior parte UBLs, tra cui SUMO, NEDD8, ISG15 e FAT10. Per modifica si verifichi, il gruppo carbossilato del diglycine motivo LBM viene prima attivato da un enzima attivando E1 a formare un tiolo ad alta energia che viene trasferita al sito attivo di un enzima cisteina coniugare E2. Il E2 poi interagisce con un substrato con associazione E3 ligasi di mediare trasferimento della LBM su (di solito) un residuo di lisina bersaglio creando una catena ramificata (isopeptide) linkage 2. Cicli successivi di modifica può verificarsi per costruire catene isopeptide sul substrato, che per ubiquitina può avvenire attraverso uno dei suoi sette lisine, o attraverso la metionina N-terminale per creare catene di ubiquitina lineari. Queste modifiche formano topologie discrete con finalità diverse come la creazione di nuovi motivi di interazione e di targeting delle proteine ​​per la degradazione prima della rimozione UBL da proteasi specializzati. Nel caso di ubiquitina ci sono due enzimi E1, E2 30-40 enzimi coniugando, almeno 600 E3 ligasi e circa 100 enzimi deubiquitylating (Dubs). Mentre le vie sono meno espansiva per gli altri 10 o giù di lì UBLs, complessità generale ubiquitome offre grande diversità nel risultato biologico di una modifica particolare UBL. Tuttavia, mentre sono stati compiuti importanti progressi nella UBL biologia, i ruoli cellulari precise della maggior parte di questi componenti ubiquitome rimangono sconosciute. L&#39;uso di short intacido ribonucleico erfering (siRNA) è emersa come un potente strumento in genetica inversa a causa della capacità di siRNA per indirizzare specificamente mRNA cellulari per la distruzione, consentendo il ruolo dei singoli geni da esaminare in contesti biologici differenti 3. Schermi genoma interi sono stati utilizzati per identificare e validare nuovi regolatori di molti processi cellulari, e hanno creato una grande quantità di dati utili accessibili alla più ampia comunità scientifica. Tuttavia, mentre gli schermi intero genoma si sono dimostrati estremamente utili, schermi mirati stanno diventando sempre più popolari come sono più economici, più veloci, coinvolgere meno la gestione dei dati e la relazione solo sui membri del genoma in cui il ricercatore è più interessati. Pertanto, per capire meglio quali componenti della famiglia processi cellulari UBL sono coinvolti in, abbiamo compilato una libreria siRNA umano mira tutti noti e previsti componenti del ubiquitome. Questo include i UBLs, E1, E2 enzimi attivatori coniugandoenzimi, ligasi E3, ubiquitina-legame dominio (UBD) contenenti proteine ​​e dubs. Questa libreria può essere usata per schermo contro un&#39;ampia gamma di linee cellulari giornalista di problemi biologici distinti, permettendo così l&#39;identificazione corretto di componenti UBL nuovi disciplinano queste vie. Il protocollo che segue descrive come eseguire un rigoroso siRNA mirato ubiquitome schermo per identificare nuovi regolatori della risposta HIF1a-dipendente all&#39;ipossia. Sotto tensione normale di ossigeno, HIF1a è soggetto a idrossilazione prolyl che induce a essere riconosciuto e mirato per la degradazione da parte del Von Hippel Lindau (VHL) E3 ligasi complesso 4. Ipossia inibisce idrossilazione prolyl porta alla stabilizzazione di HIF1a e il suo successivo legame ad elementi di risposta ipossia (HRES) per guidare l&#39;espressione genica. Qui, descriviamo uno schermo mediante cellule di osteosarcoma U20S che esprimono stabilmente lucciola luciferasi sotto il controllo di tre copie tandem del Hypoxia Response Element (cellule U20S-HRE) 5. Questo protocollo può essere adattato per qualsiasi via biologica se un robusto lettura di attività di giornalista è realizzabile e può essere accoppiato con appropriati controlli positivi e negativi.

<table><tbody><tr><td>Dosatore automatico di liquidi</td><td>Fluid-X</td><td>XPP-721</td><td>http://www.fluidx.eu/BIOTRACK/xpp-721-liquid-handling-system.html</td></tr><tr><td>Piastra per test a parete bianca</td><td>Greiner Bio One</td><td></td><td>655083 http://www.greinerbioone.com/en/row/articles/catalogue/article/37_11/13221/</td></tr> <tr><td>Pellicola per piastre trasparenti</td><td>Perkin Elmer</td><td>1450-461</td><td>http://www.perkinelmer.co.uk/Catalog/Product/ID/1450-461</td></tr><tr><td>libreria di siRNA</td><td>Thermo Scientific</td><td>On-Target Plus</td><td></td></tr> <tr><td>http://www.thermoscientificbio.com/rnai-and-custom-rna-synthesis/sirna/on-targetplus-sirna/search-gene/ reagente di trasfezione</td><td>Invitrogen</td><td>Lipofectamine RNAimax</td><td>http://www.invitrogen.com/site/us/en/home/Products-and-Services/Applications/Protein-Expression-and-Analysis/Transfection-Selection/lipofectamine-rnaimx.html</td></tr><tr><td>Siero ridotto medio</td><td>Invitrogen</td><td>Optimem</td><td>http://products.invitrogen.com/ivgn/product/31985062?ICID=search-product</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Invitrogen</td><td>41965-039</td><td>http://products.invitrogen.com/ivgn/product/41965039#</td></tr><tr><td>FBS</td><td>Invitrogen</td><td>16000-044</td><td>https://products.invitrogen.com/ivgn/product/16000044?ICID=search-product#</td></tr><tr><td>Tryspin-EDTA</td><td>Invitrogen</td><td>25300-054</td><td>https://products.invitrogen.com/ivgn/product/25300054?ICID=search-product#</td></tr></tbody></table>

sirna screening per identificare ubiquitina e ubiquitina-come regolatori del sistema di percorsi biologici in cellule di mammifero coltivate

siRNA Screening to Identify Ubiquitin and Ubiquitin-like System Regulators of Biological Pathways in Cultured Mammalian Cells

Modificazione post-traslazionale di proteine ​​con ubiquitina e ubiquitina-come molecole (UBLs) sta emergendo come una rete di segnalazione cellulare dinamica che regola diverse vie biologiche, tra cui la risposta all&#39;ipossia, proteostasis, la risposta al danno al DNA e la trascrizione. Per capire meglio come UBLs regolano i percorsi relativi alla malattia umana, abbiamo compilato una siRNA umano &quot;ubiquitome&quot; biblioteca composta da 1.186 siRNA piscine su due piani destinati a tutti noti e previsti componenti dei percorsi del sistema UBL. Questa libreria può essere proiettato contro una serie di linee cellulari esprimenti reporter di diverse vie biologiche per determinare i componenti UBL agiscono come regolatori positivi o negativi della via in questione. Qui, descriviamo un protocollo che utilizza questa libreria per identificare ubiquitome-regolatori della risposta cellulare HIF1a-mediata all&#39;ipossia utilizzando un reporter luciferasi basato trascrizione. Una fase di sviluppo iniziale di analisiviene eseguita per stabilire parametri di schermatura della linea cellulare prima di eseguire lo schermo in tre fasi: di screening / deconvoluzione primaria, secondaria e terziaria. L&#39;uso di mirata su intere librerie genoma siRNA sta diventando sempre più popolare in quanto offre il vantaggio di notifica solo per i membri del percorso con cui i ricercatori sono più interessati. Nonostante i limiti intrinseci dello screening siRNA, in particolare falsi positivi causati da siRNA effetti off-target, l&#39;identificazione di veri e propri nuovi regolatori dei percorsi in questione superano queste carenze, che possono essere superati eseguendo una serie di esperimenti di controllo con attenzione intraprese.

Prima della proiezione, viene stabilita la ipossia-responsività delle cellule U20S-HRE. Cellule U20S-HRE esprimono un costrutto giornalista costituito da luciferasi di lucciola fuso valle di tre copie tandem dell&#39;elemento risposta all&#39;ipossia, che è vincolato da dell&#39;eterodimero HIF1A/HIF1B in caso di esposizione all&#39;ipossia (Figura 1A). Le cellule sono posti in una workstation ipossia per un intervallo di tempo per stabilire l&#39;esposizione ipossia produce la risposta più efficace per...

Qui, descriviamo una metodologia per eseguire un siRNA mirato &quot;ubiquitome&quot; schermo per identificare nuovi ubiquitina e regolatori ubiquitina-simile della risposta cellulare HIF1a-mediata all&#39;ipossia. Questo può essere adattata a qualsiasi percorso biologico in cui una lettura robusto di attività di giornalista è disponibile.

siRNA screening per identificare ubiquitina e ubiquitina-come regolatori del sistema di percorsi biologici in cellule di mammifero coltivate

Post-translational modification of proteins with ubiquitin and ubiquitin-like molecules (UBLs) is emerging as a dynamic cellular signaling network that ...

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di identificare il coinvolgimento di nuovi componenti dell'ubiquitina e dei sistemi modificatori simili all'ubiquitina nei percorsi biologici, utilizzando come esempio la risposta all'ipossia alfa dipendente HF one. Ciò si ottiene ottimizzando prima la risposta della linea cellulare reporter all'ipossia dello stimolo ambientale, in modo che siano adatte per lo screening. La seconda fase della procedura consiste nello stabilire i controlli alti e bassi per fornire un fattore Z adatto per lo screening.Con i parametri stabiliti, lo screening primario dell'irna viene eseguito in triplice copia, dopodiché i colpi vengono confermati dagli schermi di deconvoluzione secondaria e terziaria. In definitiva, i risultati possono rivelare nuovi regolatori di sistema dell'ubiquitina e dell'ubiquitina del percorso biologico in questione. Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti come lo screening dell'intero genoma Irna, è che lo screening di targeting è più veloce, più facile da eseguire, meno costoso e riporta solo i membri del percorso biochimico in cui il ricercatore è più interessato a caratterizzare.La reattività all'ipossia della linea cellulare reporter U2 O-S-H-R-E ha pronto 2 flaconi quadrati di cellule in DMM con il 10% di FBS. Quando le celle sono all'80-90% di confluenza, aspirare il terreno da un pallone e lavare quelle celle due volte con 10 millilitri di PBS. I tripli anizzano le cellule e le risospendono in otto millilitri di DMM con il 10% di FBS, rendono le cellule omogenee con una pipetta e ottengono una media di due conta cellulare, quindi diluiscono le cellule a 60.000 per millilitro.Successivamente, utilizzando una pipetta multicanale, aggiungere 6.000 cellule a tre colonne di cinque piastre per saggi 96 Well a parete bianca Incubare le cinque piastre durante la notte durante l'incubazione per superare gli effetti del bordo. Metti una carta velina umida alla base dei piatti e posiziona un sacchetto di plastica rigido e trasparente sopra la pila di piatti alla fine del giorno successivo. Annotare il tempo e trasferire una piastra nella postazione di lavoro per ipossia impostata all'1% di ossigeno.Quindi spostare una piastra nella workstation di ipossia a 14, 18 e 22 ore dopo l'inizio dell'incubazione. Quindi, preparare 30 millilitri di tampone di lisi della luciferasi. Assicurarsi che il BSA si sciolga per almeno 30 minuti nel tampone prima di aggiungere Lucifer e pirofosfato di sodio.24 ore dopo la prima edizione della piastra, scaricare la workstation per l'ipossia e aggiungere 100 microlitri del tampone preparato a ciascun pozzetto caricato delle piastre del saggio per pulire accuratamente le cellule. Coprite i piatti con pellicola trasparente e agitateli per 10 minuti. A 500 giri/min, trasferire ora le piastre in una pila al lettore di lastre automatico nel software.Selezionare il menu dei protocolli e scegliere un BS 5 95. Quindi evidenziare tutti i pozzetti da leggere nel menu di selezione dei pozzi. Fare clic sulla funzione di esecuzione e calcolare l'attività media del reporter per piastra.Quindi normalizzare i dati alle letture della piastra senza trattamento dell'ipossia. Una risposta robusta all'ipossia è essenziale per il test e l'aumento di dieci volte dell'attività di refertazione è eccellente. Procedere impostando i controlli e calcolando il fattore Z.La fase di sviluppo dell'acido è la parte più critica della procedura di screening. È importante avere una robusta risposta fenotipica della linea cellulare abbinata a buoni controlli bassi di fascia alta. Ciò garantirà il successo dello schermo IRNA.Eseguire la schermata primaria in triplice copia utilizzando il formato a 96 pozzetti. Saranno sufficienti sette flaconi confluenti di cellule. Inizia scongelando una serie di diluizioni della libreria di ubiquitina dell'RNA SI per almeno 30 minuti sotto una cappa.Successivamente, crea una piastra di controllo principale con quattro repliche da 200 microlitri di 200 nano molari SI. Rna. Caricare quattro pozzi con un controllo alto, quattro pozzetti con un controllo basso, quattro pozzi con un controllo solo tampone e quattro pozzi con un controllo IRNA non target. Etichetta successiva, 17 piastre di analisi con pareti bianche tra le colonne di controllo.Ogni pozzetto viene caricato con un pool di quattro siRNA che hanno come bersaglio lo stesso mRNA. Per garantire che le soluzioni nella piastra di controllo principale e nelle piastre di libreria siano raggruppate sul fondo di ciascuna, centrifugare bene le piastre per un minuto a 2000 gs. Quindi, utilizzando un dispenser automatizzato, trasferire 10 microlitri di ciascun pozzetto di controllo nella piastra master a ciascuna delle 17 piastre etichettate.Successivamente, utilizzare il dispenser automatico per trasferire 10 microlitri di ciascun pool di RNA SI dalle piastre della libreria a una piastra di analisi. Preparare 40 millilitri di reagente di trasfezione al rapporto predeterminato utilizzando l'erogatore Trasferire 10 microlitri in ciascun pozzetto delle 17 piastre di analisi. 40 millilitri forniscono un volume morto sufficiente per il sistema di erogazione.Dopo aver caricato il reagente di trasfezione, agitare le piastre per un minuto a 500 giri/min. Quindi lasciarli incubare per 20-60 minuti per formare i complessi di reagenti di trasfezione S-I-R-N-A. Lavare ora 2 palloni quadrati da 75 centimetri di cellule U2 O-S-H-R-E con 10 millilitri di PBS ciascuna.Quindi i tryp anizzano le cellule e le risospendono in otto millilitri di DM EM con FBS, combinano entrambe le raccolte di cellule in una provetta di plastica da 50 millilitri. Quindi calcolare la densità cellulare come prima. Utilizzare il valore per preparare una sospensione di 155 millilitri di cellule a 75.000 per millilitro.Questo volume è sufficiente per caricare le piastre e riempire il volume morto dell'erogatore sotto il cofano. Mantieni le cellule agitate con l'agitazione magnetica. Utilizzando il dispenser automatico, caricare 80 microlitri di cellule in ciascun pozzetto delle piastre di reazione.Ogni reazione preparata. Well ora contiene 100 microlitri con gli RNA SI a 20 nano molari. Registra l'ora e impila le piastre in gruppi di cinque in un'incubatrice a 37 gradi Celsius.Lasciare incubare le piastre per 24 ore nei due giorni successivi. Avvia le due repliche di queste 17 piastre di reazione. 24 ore dopo il trasferimento della trasfezione, le piastre di reazione alla stazione di lavoro per ipossia.Incubare le piastre sotto l'1% di ossigeno per 24 ore per indurre il reporter il giorno successivo, due ore prima del completamento del periodo di ipossia. Preparare un tampone fresco per il test di lisi della luciferasi, poiché prima 200 millilitri sono sufficienti per 17 piastre. Dopo aver rimosso le piastre dall'ambiente ipossico, utilizzare il dispenser automatico per caricare ogni pozzetto con 100 microlitri di tampone per il saggio.Quindi coprire ogni piastra con una pellicola trasparente e caricarla nello shaker agitando a 500 RPM per 10 minuti. Le cellule saranno accuratamente lisate. Ora procedi con la lettura delle tavole come precedentemente dettagliato.Analizzare i dati presi in triplice copia, e identificare gli irna di interesse per le schermate successive. Le cellule Greens U2 O-S-H-R-E contengono un reporter di luciferasi di lucciola fuso a tre copie a valle dell'elemento di risposta all'ipossia. Questi elementi sono legati da eterodimeri HIF uno alfa HIF e un beta, che sono abbondanti durante l'ipossia.La risposta all'ipossia di queste cellule è stata determinata prima dello screening con la libreria I a utilizzando il protocollo delineato. 24 ore di ipossia hanno indotto un aumento di dieci volte dell'espressione della luciferasi rispetto al basale. Hi F1 alfa e FIH one I a sono state selezionate come celle di controllo basse e alte.Trasfettato con questi controlli ha mostrato il 10% o il 170% del segnale della luciferasi basale dopo 24 ore di ipossia. Successivamente, le cellule sono state trasfettate con la libreria IRNA di ubiquitina ed esposte all'1% di ossigeno per 24 ore. Analizzando le piastre di reazione, è stato ottenuto un fattore Z desiderabile maggiore di 0,5 per ciascuna piastra.I valori di ciascuna piastra sono stati visualizzati utilizzando un grafico a dispersione, lo schermo primario ha registrato valori tra i controlli alto e basso. Come previsto, c'era un numero approssimativamente uguale di regolatori IRNA positivi e negativi, mentre la maggior parte non ha avuto alcun effetto significativo sul reporter, gli schermi secondari e terziari hanno continuato questo studio i dettagli su cui sono riportati nel protocollo di testo. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come eseguire uno screening mirato dell'irna per identificare i componenti dell'ubiquitina e dei sistemi lacchè di ubiquitina che regolano il tuo specifico percorso biologico di interesse.Fornendo così un punto di partenza per ulteriori indagini.

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Analisi della catena Ubiquitin mediante monitoraggio parallelo della reazione

Forniamo un protocollo dettagliato per un test di ubiquitilazione di un substrato specifico e un'ubiquitina-ligasi E3 in cellule di mammifero. Le linee cellulari HEK293T sono state utilizzate per la sovraespressione proteica, il substrato poliubiquitilato è stato purificato dai lisati cellulari mediante immunoprecipitazione e risolto in SDS-PAGE. L'immunoblotting è stato utilizzato per visualizzare questa modifica post-traduzionale.

Valutazione dell'ubiquitilazione del substrato mediante ubiquitina-ligasi E3 nei lisati a cellule di mammifero

L'esperimento qui utilizzato mostra un metodo di docking molecolare combinato con tecnologie di sonda per prevedere e convalidare l'interazione tra piccole molecole della medicina tradizionale cinese e bersagli proteici.

Screening di composti della medicina tradizionale cinese per l'inibizione dell'attività di UCHL3 basati sulla tecnologia delle sonde enzimatiche molecolari e deubiquitinanti

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siRNA screening per identificare ubiquitina e ubiquitina-come regolatori del sistema di percorsi biologici in cellule di mammifero coltivate

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