Elettrofilate Fibrosa Ponteggi di Poli (glicerolo-dodecanedioate) per l'ingegneria neurale tessuti da cellule staminali embrionali di topo
18 giugno 2014
È stata riportata la sintesi e la fabbricazione di fibre lunghe elettrofilate coprono un'area più grande deposito tramite un collettore di nuova concezione da un polimero biodegradabile romanzo chiamato poli (glicerolo-dodecanoato) (PGD). Le fibre sono in grado di sostenere la crescita di cellule derivate da cellule staminali pluripotenti di topo.
Questa procedura produce fibre lunghe filate Electros da un nuovo polimero biodegradabile chiamato poliglicerolo Dote Cano eight. Per prima cosa impostare il collettore di nuova concezione e preparare la soluzione polimerica per l'elettrofilatura, utilizzando una siringa e una pompa, erogare la soluzione al collettore. Quindi trasferire il tappetino in fibra risultante in una piastra di coltura per la reticolazione.
Successivamente, semina cellule staminali embrionali di topo sulle fibre tagliate. In definitiva, i risultati possono dimostrare che le cellule staminali embrionali di topo possono sopravvivere e differenziarsi in cellule neurali sulle impalcature delle fibre. Nel video di oggi, vi abbiamo mostrato come preparare il biomateriale dalla fabbricazione delle cellule syn e infine utilizzare quelle fibre elettro span per la coltura cellulare.
Soprattutto quando combiniamo con la cella derivata da poli e cellula di colorazione. Potrebbero avere un'applicazione molto importante in futuro per la consegna cellulare e per la creazione di un tessuto funzionale. Tessuto invis oggi che lei dimostrerà una procedura orribile per te.
Lei è la cosa più bella nel mio laboratorio. Tagliare un foglio di alluminio in un pezzo rettangolare. Piega il pezzo rettangolare in una striscia rettangolare e attaccala perpendicolarmente a una piastra metallica piatta con del nastro adesivo.
La lunghezza della striscia dipende dalle dimensioni del tappetino in fibra necessario per la soluzione polimerica. Ha mescolato glicerolo e acido decano diico in un rapporto molare uno a uno a 120 gradi Celsius per 100 ore. Per ottenere un poliglicerolo, il polimero decanoico scioglie l'ossido di polietilene e la gelatina in etanolo al 65% con un rapporto in peso da 1,5 a tre a 95,5 in un tubo da 15 millilitri.
Chiudete il tappo e scaldate il composto in forno a 60 gradi per un'ora, mescolando ogni 15 minuti fino ad ottenere una soluzione basale omogenea. Per l'elettrofilatura, mescolare il polimero PGD e la soluzione basale. In un rapporto di peso da quattro a sei, aggiungi lo 0,1% di riboflavina alla miscela e mescola bene.
Inserire la soluzione polimerica in una siringa standard da cinque millilitri con un ago in acciaio inossidabile smussato calibro 18. Quindi inserire la siringa in una pompa a siringa. Collegare il cavo con messa a terra di un alto volumetage fonte di alimentazione alla piastra metallica e il cavo caricato positivamente all'ago.
Inoltre, regola la distanza tra l'ago e il foglio di alluminio. Striscia a 15 centimetri. Ora posiziona la pompa a siringa con un angolo di circa 15 gradi rispetto all'orizzontale per evitare l'aggregazione delle fibre nella parte anteriore della striscia.
Accendere la pompa a siringa e regolare la portata della pompa a 0,6 millilitri all'ora. Accendere la fonte di alimentazione ad alta tensione e impostare la tensione di esercizio su 14,6 kilovolt. Al termine della raccolta, esporre il tappetino in fibra alla luce UV per 60 minuti di reticolazione.
Trasferisci il tappetino in fibra dalla striscia di foglio di alluminio a una piastra di Petri da 100 millimetri. Tagliare il tappetino in fibra in pezzi rotondi della stessa dimensione con la lama chirurgica e posizionare i pezzi in una piastra a 24 pozzetti. Quindi esporre la piastra alla luce UV per altri 20 minuti di sterilizzazione per la cella prima del trattamento.
Immergere i campioni di fibre in un millilitro di soluzione salina tamponata con fosfato e incubare a 37 gradi Celsius durante la notte del giorno successivo. Aspirare il PBS con cura. Aggiungere un millilitro di terreno di differenziazione a ciascun pozzetto e incubare a 37 gradi Celsius per tre ore.
Dopo aver aspirato il mezzo di differenziazione, aggiungere con cautela 0,2 millilitri di matri gel a ciascun campione di fibra e incubare a 37 gradi Celsius per 30 minuti. Rimuovere con cura l'eccesso di gel matri da ciascuno. Risciacquare bene una volta con due millilitri di mezzo di differenziazione.
Aggiungere un millilitro di tase alla piastra di coltura di cellule staminali embrionali di topo dopo 10 minuti, a 37 gradi Celsius. Quando le cellule MES sono staccate, aggiungere quattro millilitri di terreno di differenziazione. Raccogli le cellule MES galleggianti in una centrifuga in provette da 15 millilitri a 400 Gs per cinque minuti.
Risospendere le cellule pellettate in quattro millilitri di differenziazione. Medio. Trasferire 200 microlitri di sospensione cellulare in una provetta da 15 millilitri e aggiungere 10 volumi di differenziazione. Medio. Trasferire 15 microlitri della sospensione cellulare diluita in una camera dell'emocitometro.
Con un vetrino coprioggetti in posizione, contare le cellule nel quadrato centrale di un millimetro e nei quattro quadrati d'angolo dell'emocitometro. Ora scendi cinque volte 10 al quarto. Cellule ES di topo lentamente al centro dei campioni di fibre.
Aggiungere un millilitro di terreno di differenziazione a ciascun pozzetto e coltivare a 37 gradi Celsius e il 5% di anidride carbonica per l'attacco cellulare. Crescita e differenziazione. Reintegrare il millilitro di terreno di differenziazione a giorni alterni.
Per misurare la vitalità cellulare, aspirare il vecchio terreno da ciascun pozzetto e aggiungere un millilitro di un reagente di diluizione abre e fluorescenza uno su 10 in coltura. Incubare a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica per quattro ore, al riparo dalla luce diretta. Quindi trasferire campioni triplicati di 100 microlitri da ciascun pozzetto a una piastra da 96 pozzetti e misurare le immagini di microscopia elettronica a scansione di fluorescenza sono state utilizzate per valutare la morfologia delle fibre filate elettronicamente.
I diametri di queste fibre realizzate con una concentrazione del 40% di PGD sono nell'ordine dei micrometri. Le cellule staminali embrionali differenziate di topo sono state coltivate per tre giorni sulle fibre e la microscopia confocale è stata utilizzata per visualizzare la proteina fluorescente verde sovraespressa. L'aumento del numero di cellule fluorescenti verdi il sesto giorno indica che gli scaffold in fibra possono supportare sia l'adesione cellulare che la proliferazione cellulare.
Le misure di Zu e fluorescenza hanno dimostrato che il rivestimento con matrigel e laminina ha portato a una vitalità cellulare equivalente e a una proliferazione relativamente più elevata. La potenza di Flury e i marcatori delle cellule neurali sono stati quantificati mediante PCR in tempo reale al primo giorno. La maggior parte delle cellule MES coltivate su fibre esprimeva i marcatori di pluripotenza.
OCT quattro nano e SOX due. Un sottogruppo minore ha espresso i marcatori delle cellule staminali neurali PAC six e neston. Dopo due settimane di coltura, c'è stato un aumento dei livelli di espressione di alcuni marcatori di cellule neurali, come la mappa due e DCX, nonché il marcatore oligodendrocitario oligo uno e il marcatore astrocitario.
GFAP Una volta padroneggiato. Questa tecnica può essere eseguita in due o tre ore se eseguita correttamente.
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Panoramica
Questo studio descrive la sintesi e la fabbricazione di fibre elettrofilate lunghe mediante un nuovo polimero biodegradabile, il poli(glicerolo-dodecanoato) (PGD). Le fibre sostengono la crescita di cellule staminali pluripotenti murine, dimostrandone il potenziale per applicazioni biomediche.
Componenti Chiave dello Studio
Ambito Scientifico
- Biomateriali
- Coltura cellulare
- Elettrofilatura
Sfondo
- La elettrofilatura è una tecnica utilizzata per produrre fibre a partire da soluzioni polimeriche.
- I polimeri biodegradabili sono importanti per lo sviluppo di materiali sostenibili in applicazioni biomediche.
- Le cellule staminali pluripotenti del topo possono differenziarsi in vari tipi cellulari, inclusi i neuroni.
- La creazione di impalcature che supportano la crescita cellulare è fondamentale per l'ingegneria tissutale.
Scopo dello studio
- Sviluppare un nuovo metodo per la fabbricazione di fibre lunghe a partire da PGD.
- Valutare la capacità di queste fibre di sostenere la crescita cellulare.
- Dimostrare l'applicazione potenziale di queste fibre nell'ingegneria tissutale.
Metodi Utilizzati
- Preparazione di una soluzione polimerica per l'elettrofilatura.
- Utilizzo di un collettore appena progettato per il deposito delle fibre.
- Trasferimento delle stuoie di fibre in piastre di coltura per il reticolaggio.
- Seeding di cellule staminali embrionali di topo sulle fibre.
Risultati principali
- Le fibre elettrofilate sono state prodotte con successo a partire dal PGD.
- Le cellule staminali embrionali di topo sono state in grado di sopravvivere sui supporti fibrosi.
- Le cellule si sono differenziate in cellule neurali quando coltivate sulle fibre.
- Lo studio dimostra la fattibilità dell'uso di fibre in PGD per applicazioni di coltura cellulare.
Conclusioni
- Le fibre elettrofilate di PGD possono sostenere la crescita e la differenziazione delle cellule staminali.
- Questo metodo fornisce un nuovo approccio per la creazione di biomateriali per l'ingegneria tissutale.
- Sono necessarie ulteriori ricerche per esplorare il potenziale completo di queste fibre nella medicina rigenerativa.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
Questo protocollo consente la fabbricazione di impalcature elettrofilate biodegradabili in grado di sostenere la differenziazione neurale di cellule staminali embrionali di topo, offrendo una piattaforma riproducibile per la validazione precoce di bersagli nei modelli di malattie neurodegenerative. Fornendo un mimico della matrice extracellulare regolabile con proprietà meccaniche simili a quelle del tessuto nervoso, il metodo aumenta l'affidabilità predittiva dei saggi basati su cellule staminali e riduce l'ambiguità biologica nei flussi di lavoro preclinici di riduzione del rischio.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Prima Fase della Scoperta e Validazione del Target
- Valore scientifico: Consente l'analisi di ipotesi terapeutiche mediante la differenziazione controllata di cellule staminali pluripotenti in linee neurali su biomateriali definiti.
- Valore operativo: Supporta la validazione funzionale del bersaglio fornendo un substrato standardizzato per valutare sopravvivenza, proliferazione e impegno verso specifiche linee cellulari delle cellule staminali.
- Valore predittivo: Facilita la riduzione del rischio meccanicistica modellando le interazioni con la matrice extracellulare in un sistema rilevante per la patologia, prima della validazione in vivo.
Sviluppo di screening e saggi
- Valore scientifico: Prepara sistemi biologici validati per lo screening di composti successivi, stabilendo un'adesione cellulare e una crescita coerenti sulle fibre elettrofilate.
- Valore operativo: Affronta la standardizzazione dei saggi attraverso protocolli altamente riproducibili di fabbricazione delle fibre e di reticolazione, consentendo letture quantitative affidabili.
- Scalabilità: Evidenzia il potenziale di riutilizzo della piattaforma grazie a materiali economici e a un allestimento semplice, sostenendo la generazione scalabile di modelli di tessuto neurale.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Continuità Translazionale: Discute la rilevanza per le malattie attraverso la differenziazione della linea neurale, consentendo l'allineamento con studi sui biomarcatori in modelli preclinici di lesione o degenerazione neuronale.
- Avanzamento Basato sul Rischio: Descrive la continuità dalla scoperta alla validazione preclinica dimostrando un'espressione sostenuta di marcatori (ad esempio, MAP2, DCX, GFAP) per due settimane, supportando decisioni di avanzamento o interruzione.
- De-risking Predittivo: Si concentra sugli effetti del segnale mediato dalla matrice come filtro meccanicistico per i composti principali mirati alle vie di rigenerazione neuronale.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Il metodo si integra nel percorso di scoperta, dalla derivazione delle cellule staminali allo screening del fenotipo neurale, consentendo la verifica di ipotesi e la chiarificazione di vie metaboliche prima degli sforzi di identificazione del capostazione.
- Biologia della scoperta: Spiega come il metodo supporti la verifica delle ipotesi consentendo la differenziazione controllata di cellule staminali embrionali murine in sottotipi neurali su scaffold regolabili.
- Screening: Descrive la prontezza del saggio attraverso la generazione riproducibile di fibre e il loro reticolaggio, garantendo una mimica costante della matrice extracellulare per la valutazione dei composti.
- Analisi: Mette in evidenza output quantitativi come l'intensità di fluorescenza, la PCR in tempo reale per marcatori di pluripotenza e neurali (OCT4, SOX2, PAX6, Nestin, MAP2, DCX, OLIG1, GFAP) e saggi di vitalità che permettono l'analisi comparativa tra condizioni.
- Ricerca traslazionale: Collega il metodo alla continuità preclinica tramite l'espressione sostenuta di marcatori neurali e gliali per due settimane, supportando una valutazione del rischio allineata ai biomarcatori.
- Riutilizzo aziendale: Presenta il metodo come una capacità riutilizzabile grazie a materiali a basso costo, attrezzature semplici (pompa per siringa, sorgente di alta tensione) e un processo di reticolaggio standardizzato, consentendo il suo impiego in più progetti.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Affidabilità predittiva nei risultati della differenziazione delle cellule staminali, riduzione dell'ambiguità meccanicistica nella modellizzazione del tessuto nervoso e validazione degli obiettivi mediante l'espressione di marcatori specifici per la linea cellulare.
- Valore operativo: Standardizzazione, riproducibilità e scalabilità della produzione di fibre grazie a un semplice sistema di elettrofilatura e reticolazione con raggi UV.
- Valore strategico: Decisioni più efficaci su prosegui/non prosegui basate su un'analisi fenotipica precoce, efficienza del capitale grazie a impalcature a basso costo di materiale e riduzione del rischio biologico in fasi avanzate mediante la riduzione dei rischi associati ai meccanismi dipendenti dalla matrice.
- Impatto sul portafoglio: Prioritizzazione corretta per rischio dei candidati per la rigenerazione nervosa basata su variazioni dose-dipendenti nell'efficienza di differenziazione o nell'espressione di marcatori su impalcature standardizzate.
Considerazioni sull'implementazione
- È richiesta esperienza scientifica specifica nella sintesi di polimeri, nell'elettrofilatura e nelle tecniche di coltura delle cellule staminali.
- Le attrezzature necessarie includono una pompa per siringa, una fonte di alta tensione, un'unità di reticolazione UV e microscopia a fluorescenza o confocale per le analisi.
- La standardizzazione tra gruppi di lavoro richiede protocolli condivisi per le dimensioni delle fibre, la durata della reticolazione e la densità di semina cellulare, al fine di garantire la riproducibilità tra diversi laboratori.
- Le considerazioni per l'adattamento includono la regolazione della concentrazione del polimero, della geometria del collettore e del tempo di reticolazione in base alla fonte delle cellule staminali o al tessuto bersaglio.
- I limiti pratici comprendono la variabilità del diametro delle fibre, che influisce sull'allineamento cellulare, e la necessità di ottimizzare i rivestimenti (ad esempio Matrigel, laminina) per specifici sottotipi neurali.
