MicroRNA Expression Profili di cellule iPS umane, dell'epitelio pigmentato retinico derivate da iPS, e fetale dell'epitelio pigmentato retinico

L'obiettivo generale di questa procedura è confrontare l'espressione di microRNA in cellule staminali pluripotenti indotte. Cellule epiteliali pigmentate retiniche derivate da cellule staminali pluripotenti indotte e cellule epiteliali pigmentate retiniche fetali. Questo viene ottenuto innanzitutto coltivando ed espandendo cellule IPS e RPE fetali.

Il secondo passaggio consiste nel differenziare le cellule IPS in RPE. Successivamente, l'RNA viene estratto dalle cellule IPS, dalle cellule I-P-S-R-P-E e dalle cellule RPE fetali. L'ultimo passaggio prevede l'esecuzione di un'analisi mediante microarray per microRNA sui campioni di RNA e l'analisi dei dati.

Infine, l'analisi di percorsi e reti viene utilizzata per identificare microRNA differenzialmente espressi che partecipano a molteplici reti cellulari, tra cui la proliferazione e il progresso del ciclo cellulare. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nel campo della ricerca sulla visione, come il ruolo dei microRNA nel regolare la differenziazione in cellule epiteliali pigmentate retiniche mature, il progresso del ciclo cellulare, la proliferazione e la senescenza. Le implicazioni di questa tecnica si estendono alle terapie impiegate nell'epitelio pigmentato retinico derivato da cellule staminali per sostituire l’epitelio pigmentato retinico danneggiato o malato, poiché il numero di passaggi Optima delle cellule utilizzate per la terapia può essere determinato.

Sebbene questo argomento possa fornire informazioni sui fattori che regolano la differenziazione delle RRP da IPS, può essere applicato anche ad altri sistemi organici, come la differenziazione di altri tipi cellulari specifici della TC da IPS. Per iniziare questa procedura, piastrare le cellule staminali pluripotenti indotte a circa 350 colonie cellulari per pozzetto su una piastra appena rivestita in mezzo M tester one e lasciare espandere le colonie di IPSL per quattro-cinque giorni in coltura.

Poi ogni tre giorni sostituire il mezzo M tesser con quattro millilitri di mezzo di differenziamento e cambiare metà del mezzo con mezzo di differenziamento fresco. Lasciare crescere le aree pigmentate fino a quando non sono abbastanza grandi da poter essere dissezionate manualmente dalla coltura, processo che richiede circa da 40 a 50 giorni. Successivamente, utilizzare una punta di pipetta da 200 microlitri per tagliare attorno alle colonie pigmentate e sollevarle.

Raccogliere e unire le colonie dissezionate in un tubo conico da 15 millilitri. Aggiungere cinque millilitri di mezzo DMMF 12 alle cellule RPE unite e centrifugare a 300 GS per cinque minuti. Successivamente, rimuovere il mezzo e risospendere il pellet cellulare in cinque millilitri di mezzo, quindi ripetere la centrifugazione.

Rimuovere il mezzo dal pellet cellulare. Quindi preparare una soluzione di singole cellule incubando gli I-P-S-R-P-E raccolti con tripsina 0,25% EDTA per cinque-dieci minuti a 37 gradi Celsius, fino a quando gli aggregati cellulari si dissociano in singole cellule. Lavare le cellule I-P-S-R-P-E con mezzo I-P-S-R-P-E e quindi seminare le cellule raccolte su una nuova piastra rivestita con matrigel in quattro millilitri di mezzo di coltura I-P-S-R-P-E, mantenendo le cellule per tre settimane prima del passaggio e sostituendo il mezzo con mezzo I-P-S-R-P-E fresco ogni tre giorni per l'esperimento.

Seeminare le cellule I-P-S-R-P-E a 100.000 cellule per centimetro quadrato e quindi raccogliere le cellule 17 giorni dopo la semina per ottenere cellule staminali iPS indifferenziate. Coltivare le cellule fino a quando si osservano colonie indifferenziate dense al centro. Quando ciò si verifica, lavare le colonie con mezzo D-M-E-M-F 12, quindi dissociare le cellule iPS in cellule singole utilizzando Accutase.

Raccogliere le cellule in un tubo conico da 15 millilitri e centrifugare a 300 G per cinque minuti. Aspirare il soprannatante e risospendere il pellet cellulare in due millilitri di mezzo D-M-E-M-F 12 per raccogliere l'epitelio pigmentato retinico fetale; prima risciacquare le colture cellulari dell'epitelio pigmentato retinico fetale con D-M-E-M-F 12. Successivamente, dissociare le colture cellulari in singole cellule utilizzando TRIPSINA-EDTA 0,25% per cinque-dieci minuti a 37 gradi Celsius.

Raccogliere le cellule dell'epitelio pigmentato retinico fetale in un tubo conico da 15 millilitri e centrifugare a 300 ×g per cinque minuti. Quindi aspirare il soprannatante e risospendere il pellet cellulare in due millilitri di terreno D-M-E-M-F 12.

Raccogliere le cellule I-P-S-R-P-E al giorno 17. Dopo il terzo e il quinto passaggio, lavare le cellule I-P-S-R-P-E due volte in PBS e preparare una sospensione di cellule singole incubando con un millilitro di tripsina 0,25% per cinque-dieci minuti a 37 gradi Celsius. Neutralizzare quindi la tripsina con due millilitri di mezzo I-P-S-R-P-E freddo su ghiaccio e raccogliere le cellule in un tubo conico da 15 millilitri.

Centrifugare il tubo per cinque minuti a 300 G e quindi aspirare il surnatante. Risospendere il pellet cellulare in tre millilitri di buffer di marcatura del kit di microperle; centrifugare la sospensione cellulare I-P-S-R-P-E nel buffer di marcatura a 300 G per cinque minuti. Quindi aspirare il surnatante e risospendere.

Sospendere il pellet cellulare a una concentrazione di due per 10 alla sesta cellule per 100 microlitri del buffer di marcatura del kit di microperle. Aggiungere 10 microlitri di anticorpo anti TRA uno 60 PE per due per 10 alla sesta cellule. Mescolare accuratamente e quindi incubare a quattro gradi Celsius per 10 minuti.

Lavare le cellule con un millilitro di tampone di marcatura per due volte 10 alla sesta cellule. Quindi centrifugare la sospensione cellulare per 10 minuti a 300 ×g. Successivamente, aspirare il soprannatante e risospendere il pellet cellulare in 80 microlitri di tampone di marcatura per due volte 10 alla sesta cellule.

Quindi aggiungere 20 microlitri di microperle marcate con anti-PE per due volte 10 alla sesta cellule. Mescolare bene e incubare per 15 minuti a quattro gradi Celsius. Aggiungere un millilitro di buffer di marcatura per due volte 10 alla sesta cellule, centrifugare per 10 minuti a 300 G e aspirare il soprannatante.

Sospendere quindi il pellet cellulare in 500 microlitri di buffer per marcatura e separare le cellule negative per TRA-1-60 in un separatore magnetico per cellule come descritto nel protocollo testuale allegato. Lisiare le cellule facendo passare ogni campione attraverso una colonna mini spin per omogeneizzazione in un microcentrifugo disponibile in commercio, progettata per mini-preparazioni di acidi nucleici. Estrarre quindi l'RNA totale dalle cellule IPS, I-P-S-R-P-E e dall'epitelio pigmentato retinico fetale utilizzando un kit commerciale per l'estrazione di RNA, progettato per preservare le molecole di RNA di piccole dimensioni.

Utilizzare uno spettrofotometro NanoDrop per determinare le concentrazioni totali di RNA; creare un file Excel con un elenco dei microRNA identificati con livelli di espressione diversi di almeno due volte tra i gruppi di campioni. Successivamente, accedere al programma online di analisi dei percorsi dell'RNA e caricare il file Excel. Selezionare il formato flessibile come formato del file e scegliere Agilent dall'elenco a discesa per l'identificatore.

Digitare sotto l'intestazione dei dati grezzi. Assegnare l'ID alla colonna ID della sonda e assegnare osservazione uno e rapporto logaritmico alla colonna rapporto logaritmico. Selezionare ignora per tutte le altre colonne.

Selezionare i parametri per l'analisi come segue: confidenza, osservato sperimentalmente, includere solo relazioni dirette e indirette e includere sostanze chimiche endogene. Selezionare la base di conoscenza Ingenuity come insieme di riferimento. Quindi scegliere il database delle molecole di riferimento.

Questo include dati provenienti da tutte le specie, tutte le linee cellulari e tessuti e tutte le mutazioni. Dopo aver selezionato tutti i parametri, eseguire l'analisi della rete selezionando reti. Quindi selezionare le reti sovrapposte e successivamente fare clic su una rete di interesse per visualizzare i risultati.

Le cellule IPS differenziate in cellule I-P-S-R-P-E hanno mostrato il fenotipo classico delle cellule epiteliali pigmentate retiniche (RPE), caratterizzato da una morfologia esagonale e pigmentata, simile a quello delle cellule RPE fetali. Il confronto del profilo di espressione dei microRNA tra le cellule IPS indifferenziate e le cellule I-P-S-R-P-E ha rivelato un'upregolazione di 47 microRNA e una downregolazione di 36 microRNA, mentre le cellule RPE fetali hanno mostrato un'upregolazione di 61 microRNA rispetto alle cellule I-P-S-R-P-E e una downregolazione di 49 microRNA. L'analisi dei percorsi molecolari effettuata con il software Ingenuity IPA ha indicato che i geni bersaglio dei microRNA espressi in modo differenziale erano coinvolti in processi cellulari quali lo sviluppo cellulare, la crescita e il ciclo cellulare. Tale analisi ha inoltre evidenziato che i microRNA espressi nei tessuti oculari in vivo erano arricchiti nelle cellule I-P-S-R-P-E e nelle cellule RPE fetali rispetto alle cellule IPS. Durante l'esecuzione di questa procedura, è importante ricordare di prevenire la contaminazione e il degrado dei campioni di RNA.

Altri metodi, come la R-T-P-C-R, possono essere eseguiti per confermare il livello di espressione di micro RNA in ciascun tipo cellulare dopo il suo utilizzo. Questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo della ricerca sulla visione per esplorare il ruolo del micro RNA nella differenziazione e nel progresso del ciclo cellulare nell'rrp. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come ottenere l'epitelio pigmentato retinico da cellule IPS e confrontare il profilo di espressione del microRNA delle cellule I-P-S-R-P-E con quelle delle cellule IPS e dell'epitelio pigmentato retinico fetale.