Name: MicroRNA Expression Profili di cellule iPS umane, dellepitelio pigmentato retinico derivate da iPS, e fetale dellepitelio pigmentato retinico (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-06-24T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 19 s
Description: Scopri il profilo di espressione dei microRNA in cellule iPS umane, epitelio pigmentato retinico derivato da iPS e RPE fetale. Questo metodo di microarray analizza le differenze regolatorie nello sviluppo cellulare.

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I pareri o le affermazioni contenute nel presente documento sono le opinioni personali degli autori e non devono essere interpretate come ufficiale o quanto riflette le opinioni del Dipartimento dell&#39;Esercito o il Dipartimento della Difesa. Questa ricerca è stata eseguita mentre Whitney A. Greene, Alberto Muñiz, e Ramesh R. Kaini gli autori hanno tenuto una Postdoctoral Research Associateship Consiglio Nazionale delle Ricerche presso l&#39;USAISR. Microarray sono stati eseguiti dai bambini del Greehey Cancer Research Institute Microarray Nucleo Facility e Bioinformatica Dipartimento presso UT Health Science Center a San Antonio. Questo lavoro è stato supportato dal US Army programma clinico di Medicina Riabilitativa Research (CRMRP) e militare Programma di Ricerca Operativa Medicina (MOMRP).

1. Preparazione della Cultura Reagenti e piastre di coltura <ol><li> mTeSR1 Media: Preparare il supporto mTeSR1 secondo le istruzioni del produttore. Scongelare 100 ml di mTeSR1 5x supplemento notte a 4 ° C. Aggiungere 100 ml di mTeSR1 5x complemento a 400 ml di mTeSR1 terreni di base e mescolare bene. Questo supporto è stabile a 4 ° C per 2 settimane ed a -20 ° C per 6 mesi. </li><li> Differenziazione dei media: Preparare il supporto differenziazione DMEM/F12 per produrre 0.1mm β-mercaptoetanolo, 0,1 mm aminoacidi non essenziali, 2.0 mM L-glutammina, siero knockout del 10%, e 10 mg / ml di gentamicina. </li><li> iPS-RPE supporto: preparare iPS-RPE media in MEM cedere supplemento 1x N1, 0,1 mm aminoacidi non essenziali, 250 mg / ml taurina, 13 ng / ml sale di sodio triiodo-L-thyronine, 20 ng / ml idrocortisone, 5 mcg / ml gentamicina, e 15% FBS 26. </li><li> Soluzione madre sale sodico triiodo-L-thyronine. Per preparare soluzione madre sciogliere 1,0 mg di triiodo-L-thyroninesale di sodio in 1 N di idrossido di sodio agitando delicatamente. Successivamente aggiungere 49,0 ml di mezzi di comunicazione di base per rendere 50,0 ml di 20 mg / ml di sale di sodio triiodo-L-thyronine. Preparare aliquote e congelare a -20 ° C fino al momento dell&#39;uso. Utilizzare volume adeguato per raggiungere la concentrazione desiderata in mezzi di coltura finale. </li><li> Idrocortisone soluzione madre: Per preparare una soluzione madre idrocortisone, solubilizzare 1 mg di idrocortisone in 1 ml di etanolo assoluto agitando. Successivamente aggiungere 19,0 ml di mezzi di comunicazione di base per la soluzione di 20 ml di idrocortisone magazzino di 50 mg / ml. Aliquotare e congelare a -20 ° C fino al momento dell&#39;uso. Utilizzare volume adeguato per raggiungere la concentrazione desiderata in mezzi di coltura finale. </li><li> Fetale crescita media RPE. Preparare i mezzi di crescita miscelando tutti i reagenti nel kit RTEGM nei media basale, secondo le istruzioni del produttore eccezione del FBS. </li><li> Mezzi di placcatura RPE fetale. Preparare terreni in piastra trasferendo una piccola quantità di terreni di crescita in un contenitore sterile eFBS dd ad una concentrazione finale del 2%. </li><li> Dispasi: Preparare la soluzione di lavoro del dispasi di 1 mg / ml in DMEM/F12. </li><li> Matrigel rivestite con lastre: Preparare Matrigel in DMEM/F12 a 0,08 mg / ml. </li><li> Coat ciascun pozzetto di una piastra da 6 pozzetti con 1,0 ml della soluzione di matrigel. </li><li> Incubare le piastre rivestite a temperatura ambiente per 1,0 ore. </li><li> Dopo l&#39;incubazione 1,0 ore, aspirare il DMEM/F12 eccesso. </li><li> Aggiungere 0,5 ml di media mTeSR1 per evitare l&#39;essiccamento. Le piastre Matrigel rivestite sono ora pronti per l&#39;uso. </li></ol> 2. Cultura iPS <ol><li> Prima della semina delle cellule iPS hanno tutti i tubi, i media caldi mTESR1 a temperatura ambiente, e le piastre Matrigel rivestite pronte. </li><li> Scongelare rapidamente le cellule IMR90-4 iPS in un bagno d&#39;acqua a 37 °. Quindi rimuovere il esageratamente dal bagnomaria e sterilizzare utilizzando 70% di etanolo. </li><li> Trasferire le cellule in una provetta da 15 ml con una pipetta 2 ml per minimizzare rottura di aggregati cellulari. </li><li> Drop-saggio aggiungere 5 ml di warm supporti mTeSR1 alle cellule e delicatamente mescolare. Centrifugare le cellule a 300 xg per 5 min a temperatura ambiente e rimuovere il surnatante. </li><li> Risospendere con attenzione gli aggregati di cellule in 2 ml di media mTeSR1 e seminare le cellule su un pozzetto di una piastra ben sei. </li><li> Porre la piastra in un incubatore e la cultura 37 ° con il 5% di CO 2, 95% di umidità. </li><li> Cambiare la coltura delle cellule iPS quotidiana. Colonie indifferenziati appariranno 5-7 giorni dopo la semina. Verificare la presenza di colonie indifferenziati che sono pronti per il passaggio (colonie con un centro denso). </li></ol> 3. Passaging di cellule iPS <ol><li> Prima di iniziare a passaggio le cellule iPS, hanno tutte le provette, soluzione dispasi, DMEM/F12 e mTERS1 supporti riscaldata a temperatura ambiente, e la Matrigel rivestite piastre pronta. </li><li> Prima passaging cellule iPS, rimuovere le aree di differenziazione raschiando l&#39;area e aspirare il media. Differenziazione dovrebbe rimanere inferiore al 20% del pozzo per altacolture di qualità. Sciacquare accuratamente la cella contenente bene con 2 ml DMEM/F12 iPS e aggiungere 1 ml di 1 mg / ml dispasi a ciascun bene. </li><li> Incubare a 37 ° C per 7 minuti. Aspirare il dispasi e lavare delicatamente le colonie di cellule con 2 ml di DMEM/F12 due volte. </li><li> Dopo il risciacquo, aggiungere 2 ml di mTSER1 a ciascun pozzetto. </li><li> Usando una pipetta da 5 ml raschiare delicatamente le colonie della piastra a formare aggregati. </li><li> Trasferire le colonie staccate in una provetta da 15 ml. Aggiungi mezzi mTeSR1 sufficienti per seminare il prossimo passaggio di cellule. </li></ol> 4. Differenziazione delle cellule iPS per iPS-RPE <ol><li> Piastra le cellule iPS su un piatto rivestito di recente nei media mTESR1. </li><li> Lasciare colonie di cellule iPS per espandere per 4-5 giorni di coltura. </li><li> Supporti di sostituzione mTeSR1 con i media di 4 ml di differenziazione. Cambiare metà dei mezzi ogni 3 giorni. </li><li> Consentire foci pigmentate diventino abbastanza grandi per essere sezionato manualmente della cultura (40-50 giorni). </li><li> Utilizzare un200 microlitri pipetta punta a tagliare intorno e sollevare le colonie pigmentate. </li><li> Raccogliere e mettere in comune le colonie sezionato in un tubo da 15 ml. </li><li> Aggiungere quindi 5 ml di DMEM/F12 alle cellule RPE pool e centrifugare a 300 xg per 5 min due volte. </li><li> Preparare una soluzione singola cellula tramite l&#39;incubazione del pool iPS-RPE con il 0,25% tripsina EDTA. </li><li> Lavare le cellule iPS-RPE con i media iPS-RPE e piastra le cellule raccolte su un nuovo Matrigel rivestite bene in 4 ml di mezzi iPS-RPE. </li><li> Coltivare le cellule per 3 settimane prima di passaggio. Modificare i media ogni 3 giorni. Per l&#39;esperimento, piastra IPS-RPE a 100.000 cellule / cm 2. Raccogliere le cellule il giorno 17. Contare il giorno della semina come giorno 0. </li></ol> 5. Raccolta dei campioni <ol><li> iPS cellule Collection <ol><li> Cultura le cellule iPS fino colonie indifferenziati sono osservate per essere denso al centro. </li><li> Sciacquare le colonie in DMEM/F12. </li><li> Dissociarsi nelle singole cellule utilizzando accutas<html> e. Raccogliere le cellule in un tubo da 15 ml e centrifugare a 300 xg per 5 min. Aspirare il surnatante. Risospendere in 2 ml di DMEM/F12. </li></ol></li><li> Fetale RPE Collection <ol><li> Sciacquare colture cellulari fetale RPE con DMEM/F12 e dissociare nelle singole cellule utilizzando 0,25% tripsina EDTA. </li><li> Raccogliere le cellule in una provetta da 15 ml. Centrifugare a 300 xg per 5 min. Aspirare il surnatante. Risospendere in 2 ml di DMEM/F12. </li></ol></li><li> iPS-RPE cellulare Collection <ol><li> Quando il iPS-RPE raggiungere passaggio 3 e il passaggio 5, raccogliere le celle Giorno 17 dopo il passaggio. Sciacquare iPS-RPE due volte in PBS e preparare una sospensione singola cella mediante incubazione con 1,0 ml di 0,25% tripsina. </li><li> Neutralizzare la tripsina con 2 ml di ghiaccio freddo supporti iPS-RPE. </li><li> Raccogliere le cellule in un tubo da 15 ml e centrifugare a 300 xg per 5 min. Aspirare il surnatante. </li><li> Risospendere la sospensione cellulare in 3 ml di tampone colorazione del kit microbead. </li></ol></li></ol>ve_title &quot;&gt; 6. Negativo Selezione del iPS-RPE per rimuovere le cellule indifferenziate <ol><li> Conservare tutti i reagenti a 4 ° C fino al momento dell&#39;uso, ma non funzionano sul ghiaccio. Sospensione cellulare centrifuga dal punto 5.3.4 a 300 xg per 5 min. Aspirare il surnatante. </li><li> Risospendere le cellule in 100 microlitri di tampone colorazione del kit microbead a 2 x 10 6 cellule. </li><li> Aggiungere 10 ml di anti-TRA-1-60-PE anticorpi per 2 x 10 6 cellule. </li><li> Mescolare bene e incubare a 4 ° C per 10 min. </li><li> Lavare le cellule in 1-2 ml di tampone per 2 x 10 6 cellule. Centrifugare per 10 min a 300 x g. Aspirare il surnatante. </li><li> Risospendere le cellule in 80 ml ​​di tampone di colorazione per 2 x 10 6 cellule. Aggiungere 20 ml di microsfere anti-PE etichettati (dal kit) per 2 x 10 6 cellule. Mescolare bene. Incubare per 15 minuti a 4 ° C. </li><li> Aggiungere 1-2 ml di tampone di colorazione per 2 x 10 6 cellule. Centrifugare per 10 min a 300 x g. Aspirare il surnatante. </li><li> Risospendere le cellule in 500 &amp; #956; l di tampone di colorazione. </li><li> Separazione cellulare magnetico: <ol><li> Mettere colonna cell sorter magnetico. Risciacquare colonna con 3 ml di tampone di colorazione. </li><li> Applicare sospensione cellulare dal 6,8 su colonna. </li><li> Collocare un tubo al porto negativo per raccogliere le cellule negative TRA-1-60 anni. </li></ol></li></ol> 7. RNA totale estrazione <ol><li> Lisare le cellule eseguendo i campioni attraverso una colonna microcentrifuga omogeneizzatore mini giro disponibile in commercio progettato per minipreps acidi nucleici. </li><li> Estrarre l&#39;RNA totale da cellule iPS, iPS-RPE e RPE fetale con il kit di estrazione di RNA disponibile in commercio progettato per preservare piccole molecole di RNA 27. </li><li> Determinare le concentrazioni di RNA totale utilizzando uno spettrofotometro NanoDrop. </li></ol> 8. Bioanalyzer e Microarray Assay <ol><li> Controllare l&#39;integrità dell&#39;RNA con Bioanalizzatore in combinazione con kit di qualità RNA disponibile in commercio. </li><li> Incubare 100 ng diRNA totale con fosfatasi intestinale di vitello a 37 ° C per 30 min </li><li> Denaturare l&#39;RNA utilizzando il 100% DMSO a 100 ° C per 5 min. </li><li> Etichettare i campioni con PCP-Cy3 utilizzando T4 ligasi tramite incubazione a 16 ° C per 1 ora. </li><li> Ibridare su un formato 8_x_15K matrice miRNA umani. </li><li> Lavare le matrici secondo le istruzioni del fabbricante e la scansione ad una risoluzione di 5 micron utilizzando uno scanner. </li><li> Acquisire i dati usando la funzione microarray software di estrazione compatibili con il microarray miRNA. </li><li> Elaborare i segnali miRNA per determinare il livello relativo di espressione in ogni campione. </li><li> Confrontare i livelli di espressione di ciascuno miRNA tra i gruppi campione. Selezionare miRNA con espressione differenziale di almeno due volte per ulteriori analisi. </li><li> Utilizzo del software disponibile in commercio per l&#39;analisi dei dati, seguire le istruzioni per generare mappe di calore per la visualizzazione dei miRNA differenzialmente espressi 28. </li></ol> 9. Analisi Pathway <ol><li> Salvare i dati dai miRNA selezionati in 8.9 in formato Excel. </li><li> Accedere al programma online di analisi di RNA percorso. Caricare il file di Excel. Selezionare &quot;Format flessibile&quot; per il formato di file e selezionare &quot;Agilent&quot; dal menu a discesa per il tipo identificativo. </li><li> Alla voce dati grezzi, assegnare &quot;ID&quot; per sondare colonna ID e assegnare &quot;Osservazione 1&quot; e &quot;rapporto log&quot; alla colonna razione log. Selezionare &quot;ignora&quot; per tutte le altre colonne. </li><li> Selezionare i parametri per l&#39;analisi come segue: Fiducia: sperimentalmente osservato solo; comprendere le relazioni dirette e indirette; e comprendono prodotti chimici endogeni; Selezionare il Knowledge base Ingenuity come l&#39;insieme di riferimento. Scegliere il database di molecole di riferimento che include i dati di tutte le specie, tutte le linee di cellule e tessuti, e tutte le mutazioni. </li><li> Rete Esegui e percorso di analisi. </li></ol>

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<li><a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Analysis+of+DNA+or+RNA+using+its+wavelengths%3A+230+nm%2C+260+nm%2C+280+nm%5BTitle%5D)+AND+%22About+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">The Analysis of DNA or RNA using its wavelengths: 230 nm, 260 nm, 280 nm.</a> About Biotechnology. , (2013).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

In conclusione, la relazione descrive i metodi utilizzati per la coltura delle cellule iPS, iPS-RPE e RPE fetale. RPE derivate da iPS sono morfologicamente e funzionalmente simile a RPE fetale. IPS-RPE esprime anche caratteristici geni RPE tra cui RPE65, CRALBP, PEDF, e LRAT 16. Per caratterizzare ulteriormente queste cellule, l&#39;RNA è stato estratto e utilizzato per eseguire analisi microarray per identificare miRNA differenzialmente espressi. Analisi delle intensità di segnale rivelato che è stato rileva...

Le cellule staminali hanno la capacità di replicarsi senza limiti e il potenziale di differenziarsi in qualsiasi tipo di cellula somatica. Lo sviluppo di tecniche per riprogrammare cellule somatiche in cellule staminali pluripotenti ha suscitato grande entusiasmo nella comunità della ricerca e tra i medici, come l&#39;avvento di rigenerazione del tessuto personalizzato è all&#39;orizzonte 1. Induced-staminali pluripotenti (iPS) presentano le stesse caratteristiche di illimitato potenziale replicativo e pluripotenza come staminali embrionali (ES), le cellule che aggirano i dilemmi etici associati con i CES. Inoltre, le cellule staminali del paziente non stimolare una risposta immunitaria, aumentando notevolmente la probabilità di successo applicazioni terapeutiche 2-3. Sotto specifiche condizioni di coltura, le cellule iPS hanno dimostrato di differenziarsi in diversi tipi cellulari in vitro, compresi cardiomiociti, neuroni, cellule beta pancreatiche, epatociti e dell&#39;epitelio pigmentato retinico (RPE) 4-12. La RPE è uno strato specializzato di cellule epiteliali pigmentate situati nella parte posteriore della retina che svolge diverse funzioni che sono essenziali per la salute visiva e funzione come assorbimento della luce diffusa, fagocitosi dei segmenti esterni dei fotorecettori, e l&#39;elaborazione di retinoidi per la produzione di chromophore visiva. Disfunzione del RPE causa di danni o malattia colpisce profondamente la salute dei fotorecettori e la funzione visiva come testimoniano le malattie accecante che sono il risultato della sottostante patologia RPE come la degenerazione maculare legata all&#39;età (AMD), la malattia di Stargardt, e retinite pigmentosa (RP) 13. Trattamenti veramente efficaci che possono ripristinare la visione non sono stati raggiunti, e la sostituzione di RPE malato con sano RPE può essere l&#39;opzione migliore per prevenire la perdita della visione 14-15. RPE derivate da iPS (iPS-RPE) è una possibile fonte di cellule per sostituire il RPE danneggiato. iPS-RPE esprime caratteristiproteine ​​RPE tic LRAT, CRALBP, PEDF e RPE65; visualizza la classica altamente pigmentato esagonale RPE morfologia; e svolge funzioni RPE come la fagocitosi, l&#39;elaborazione retinoidi, e la secrezione di 11 - cis 5,16 retinica. Tuttavia, prima di iPS-RPE può essere utilizzato terapeuticamente, IPS-RPE deve essere accuratamente caratterizzato. Comprensione dei fattori che regolano la differenziazione RPE è necessario per migliorare la resa e la purezza delle cellule da utilizzare per applicazioni cliniche. La differenziazione cellulare è il risultato dell&#39;espressione genica altamente regolato. Rimodellamento epigenetico del genoma e del coordinamento dei fattori di trascrizione sono necessari per le decisioni destino delle cellule che si verificano durante la differenziazione e lo sviluppo 17. Regolamento del messaggio RNA messaggero (mRNA), traduzione di microRNA (miRNA) presenta ancora un altro livello di regolamentazione che riguarda il destino delle cellule 1. MiRNAs sono brevi, ~ 22 nt, lunghezze di nucleotidi che sia la traduzione di soppressione dalegame al 3 &#39;UTR del mRNA bersaglio o l&#39;mRNA per degradazione. MiRNAs sono stati rilevati in quasi tutti i tessuti e ad oggi oltre 2.000 microRNA umani unici sono stati registrati nel database miRBase. Poiché miRNA richiedono complementarità soltanto parziale di legarsi al mRNA bersaglio, un singolo miRNA può potenzialmente legarsi a decine o centinaia di bersagli, e viceversa, cioè un singolo mRNA può essere bersaglio di diversi miRNA diversi. Questa caratteristica vincolante promiscua aumenta notevolmente il livello di complessità della regolamentazione, così come il livello di difficoltà di determinare le funzioni dei singoli miRNA e il ruolo ognuno gioca in funzioni cellulari 18-21. Tuttavia, studi hanno dimostrato che miRNA raffina genica durante il differenziamento influenzando stato di metilazione del DNA 17. In uno studio più specifico al RPE, miR-204/211 ha dimostrato di promuovere il fenotipo epiteliale della RPE 22. Un altro gruppo ha analizzato il profilo di miRNAdi RPE durante il differenziamento di cellule ES e ha rivelato insiemi distinti di miRNA sono espressi durante il processo di differenziazione 23. In realtà, i profili miRNA possono distinguere in modo inequivocabile tipi cellulari, comprese le cellule staminali, cellule precursori e cellule terminalmente differenziate 24,25. Oltre 250 miRNA sono espressi nella retina. Sulla base di questi studi, ipotizziamo che i microRNA svolgono un ruolo importante durante la differenziazione di RPE da iPS. L&#39;obiettivo di questa relazione è quello di descrivere i protocolli per il differenziamento di RPE da IMR90-4 cellule iPS, la raccolta di RNA per l&#39;analisi mediante microarray e l&#39;analisi dei dati di microarray per identificare miRNA che sono differenzialmente espressi fra tre tipi di cellule, le cellule iPS , iPS-RPE e RPE fetale. L&#39;RNA totale è stato estratto da colture di ogni tipo di cellula e ibridato a un microarray miRNA, contenente sonde specifiche per il 1205 miRNA umani e 144 miRNA virali. I risultati microarray sono stati confrontanod per determinare quali miRNA sono differenzialmente espressi tra i diversi tipi cellulari. miRNA con 2 volte o più fold change in espressione sono stati selezionati per ulteriore analisi. Un programma software di analisi miRNA è stato usato per identificare potenziali target dei miRNA differenzialmente espressi e generare reti cellulari regolati dai miRNA selezionati.

<table><tbody><tr><td>Terreni mTeSR1 + 5X integratore</td><td>Stem Cell Technologies</td><td>5850</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>Life Technologies</td><td>11330-032</td><td></td></tr><tr><td>2-&beta;-mercaptoetanolo</td><td>Sigma</td><td>M-7154</td><td></td></tr><tr><td>Aminoacidi non essenziali</td><td>Hyclone(Fisher)</td><td>SH30853.01</td><td></td></tr><tr><td>Sostituzione del siero knockout</td><td>Life Technologies</td><td>10828-028</td><td></td></tr><tr><td>Gentamicina</td><td>Life Technologies</td><td>15750-060</td><td></td></tr><tr><td>MEM media</td><td>Life Technologies</td><td>10370-021</td><td></td></tr><tr><td>N1 integratore</td><td>Sigma</td><td>N-6530-5ML</td><td></td></tr><tr><td>Taurina</td><td>Sigma</td><td>T-8691-25G</td><td></td></tr><tr><td>Idrocortisone</td><td>Sigma</td><td>H0888-1G</td><td></td></tr><tr><td>Siero fetale bovino</td><td>Hyclone(Fisher)</td><td>SH3008803HI</td><td></td></tr><tr><td>Sale sodico di triiodo-l-tironina</td><td>Sigma</td><td>T6397</td><td></td></tr><tr><td>Idrossido di sodio</td><td>Sigma</td><td>S5881</td><td></td></tr><tr><td>Terreni RPE fetali Kit RTEGM</td><td>Life Technologies</td><td>195406</td><td></td></tr><tr><td>Dispase</td><td>Life Technologies</td><td>17105-041</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>BD Biosciences</td><td>354277</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione salina tamponata con fosfato</td><td>Hyclone (Fisher)</td><td>10010-023</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina</td><td>Hyclone(Fisher)</td><td>25200-072</td><td></td></tr><tr><td>Miltenyi Biotec tampone di lavaggio</td><td>StemGent</td><td>130-092-987</td><td></td></tr><tr><td>Miltenyi Biotec tampone di risciacquo</td><td>StemGent</td><td>130-092-222</td><td></td></tr><tr><td>Kit di microsfere Anti-TRA-1-60</td><td>StemGent</td><td>130-095-816</td><td></td></tr><tr><td>Miltenyi Biotec colonna di selezione cellulare</td><td>StemGent</td><td>130-021-101</td><td></td></tr><tr><td>RNeasy micro kit</td><td>Qiagen</td><td>74004</td><td></td></tr><tr><td>Trituratore QIA</td><td>Qiagen</td><td>79654</td><td></td></tr><tr><td>RNA 6000 Pico LabChip kit</td><td>Agilent</td><td>G2938-90046</td><td></td></tr><tr><td>Microarray di miRNA umano v16</td><td>Agilent</td><td>G4471A</td><td></td></tr></tbody></table>

microrna expression profili di cellule ips umane, dell&#39;epitelio pigmentato retinico derivate da ips, e fetale dell&#39;epitelio pigmentato retinico

MicroRNA Expression Profiles of Human iPS Cells, Retinal Pigment Epithelium Derived From iPS, and Fetal Retinal Pigment Epithelium

L&#39;obiettivo di questa relazione è quello di descrivere i protocolli per confrontare il microRNA (miRNA) profili di umana indotta staminali pluripotenti (iPS), dell&#39;epitelio pigmentato retinico (RPE) derivato da cellule iPS umane (iPS-RPE), e RPE fetale. I protocolli includono raccolta di RNA per l&#39;analisi mediante microarray e l&#39;analisi dei dati di microarray per identificare miRNA differenzialmente espressi tra i tre tipi di cellule. I metodi per la coltura di cellule iPS e RPE fetale sono spiegati. Il protocollo utilizzato per la differenziazione di RPE da IP umano è anche descritto. La tecnica di estrazione dell&#39;RNA descriviamo stato selezionato per consentire il recupero massimo molto piccolo RNA per l&#39;uso in un microarray miRNA. Infine, via cellulare e analisi della rete dei dati di microarray è spiegato. Queste tecniche facilitare il confronto dei profili miRNA di tre differenti tipi cellulari.

cellule iPS (Figura 1A) sono state coltivate in condizioni di differenziazione di indurre il differenziamento in cellule iPS-RPE. IPS-RPE esposto classico fenotipo RPE di esagonale morfologia cellulare pigmentato (Figura 1B) simile a RPE fetale (Figura 1C). Per comprendere meglio il ruolo che può svolgere miRNA durante il processo di differenziazione da iPS a iPS-RPE, analisi di microarray di espressione dei miRNA è stata condotta. L&#39;RNA...

I microRNA (miRNA) profili di staminali umane pluripotenti indotte-(iPS), cellule dell&#39;epitelio pigmentato retinico (RPE) derivati ​​da umana indotta staminali pluripotenti (iPS) (iPS-RPE), e RPE fetale, sono stati confrontati.

MicroRNA Expression Profili di cellule iPS umane, dell&#39;epitelio pigmentato retinico derivate da iPS, e fetale dell&#39;epitelio pigmentato retinico

The objective of this report is to describe the protocols for comparing the microRNA (miRNA) profiles of human induced-pluripotent stem (iPS) cells, ...

L'obiettivo generale di questa procedura è confrontare l'espressione di microRNA in cellule staminali pluripotenti indotte. Cellule epiteliali pigmentate retiniche derivate da cellule staminali pluripotenti indotte e cellule epiteliali pigmentate retiniche fetali. Questo viene ottenuto innanzitutto coltivando ed espandendo cellule IPS e RPE fetali.Il secondo passaggio consiste nel differenziare le cellule IPS in RPE. Successivamente, l'RNA viene estratto dalle cellule IPS, dalle cellule I-P-S-R-P-E e dalle cellule RPE fetali. L'ultimo passaggio prevede l'esecuzione di un'analisi mediante microarray per microRNA sui campioni di RNA e l'analisi dei dati.Infine, l'analisi di percorsi e reti viene utilizzata per identificare microRNA differenzialmente espressi che partecipano a molteplici reti cellulari, tra cui la proliferazione e il progresso del ciclo cellulare. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nel campo della ricerca sulla visione, come il ruolo dei microRNA nel regolare la differenziazione in cellule epiteliali pigmentate retiniche mature, il progresso del ciclo cellulare, la proliferazione e la senescenza. Le implicazioni di questa tecnica si estendono alle terapie impiegate nell'epitelio pigmentato retinico derivato da cellule staminali per sostituire l’epitelio pigmentato retinico danneggiato o malato, poiché il numero di passaggi Optima delle cellule utilizzate per la terapia può essere determinato.Sebbene questo argomento possa fornire informazioni sui fattori che regolano la differenziazione delle RRP da IPS, può essere applicato anche ad altri sistemi organici, come la differenziazione di altri tipi cellulari specifici della TC da IPS. Per iniziare questa procedura, piastrare le cellule staminali pluripotenti indotte a circa 350 colonie cellulari per pozzetto su una piastra appena rivestita in mezzo M tester one e lasciare espandere le colonie di IPSL per quattro-cinque giorni in coltura.Poi ogni tre giorni sostituire il mezzo M tesser con quattro millilitri di mezzo di differenziamento e cambiare metà del mezzo con mezzo di differenziamento fresco. Lasciare crescere le aree pigmentate fino a quando non sono abbastanza grandi da poter essere dissezionate manualmente dalla coltura, processo che richiede circa da 40 a 50 giorni. Successivamente, utilizzare una punta di pipetta da 200 microlitri per tagliare attorno alle colonie pigmentate e sollevarle.Raccogliere e unire le colonie dissezionate in un tubo conico da 15 millilitri. Aggiungere cinque millilitri di mezzo DMMF 12 alle cellule RPE unite e centrifugare a 300 GS per cinque minuti. Successivamente, rimuovere il mezzo e risospendere il pellet cellulare in cinque millilitri di mezzo, quindi ripetere la centrifugazione.Rimuovere il mezzo dal pellet cellulare. Quindi preparare una soluzione di singole cellule incubando gli I-P-S-R-P-E raccolti con tripsina 0,25% EDTA per cinque-dieci minuti a 37 gradi Celsius, fino a quando gli aggregati cellulari si dissociano in singole cellule. Lavare le cellule I-P-S-R-P-E con mezzo I-P-S-R-P-E e quindi seminare le cellule raccolte su una nuova piastra rivestita con matrigel in quattro millilitri di mezzo di coltura I-P-S-R-P-E, mantenendo le cellule per tre settimane prima del passaggio e sostituendo il mezzo con mezzo I-P-S-R-P-E fresco ogni tre giorni per l'esperimento.Seeminare le cellule I-P-S-R-P-E a 100.000 cellule per centimetro quadrato e quindi raccogliere le cellule 17 giorni dopo la semina per ottenere cellule staminali iPS indifferenziate. Coltivare le cellule fino a quando si osservano colonie indifferenziate dense al centro. Quando ciò si verifica, lavare le colonie con mezzo D-M-E-M-F 12, quindi dissociare le cellule iPS in cellule singole utilizzando Accutase.Raccogliere le cellule in un tubo conico da 15 millilitri e centrifugare a 300 G per cinque minuti. Aspirare il soprannatante e risospendere il pellet cellulare in due millilitri di mezzo D-M-E-M-F 12 per raccogliere l'epitelio pigmentato retinico fetale; prima risciacquare le colture cellulari dell'epitelio pigmentato retinico fetale con D-M-E-M-F 12. Successivamente, dissociare le colture cellulari in singole cellule utilizzando TRIPSINA-EDTA 0,25% per cinque-dieci minuti a 37 gradi Celsius.Raccogliere le cellule dell'epitelio pigmentato retinico fetale in un tubo conico da 15 millilitri e centrifugare a 300 ×g per cinque minuti. Quindi aspirare il soprannatante e risospendere il pellet cellulare in due millilitri di terreno D-M-E-M-F 12.Raccogliere le cellule I-P-S-R-P-E al giorno 17. Dopo il terzo e il quinto passaggio, lavare le cellule I-P-S-R-P-E due volte in PBS e preparare una sospensione di cellule singole incubando con un millilitro di tripsina 0,25% per cinque-dieci minuti a 37 gradi Celsius. Neutralizzare quindi la tripsina con due millilitri di mezzo I-P-S-R-P-E freddo su ghiaccio e raccogliere le cellule in un tubo conico da 15 millilitri.Centrifugare il tubo per cinque minuti a 300 G e quindi aspirare il surnatante. Risospendere il pellet cellulare in tre millilitri di buffer di marcatura del kit di microperle; centrifugare la sospensione cellulare I-P-S-R-P-E nel buffer di marcatura a 300 G per cinque minuti. Quindi aspirare il surnatante e risospendere.Sospendere il pellet cellulare a una concentrazione di due per 10 alla sesta cellule per 100 microlitri del buffer di marcatura del kit di microperle. Aggiungere 10 microlitri di anticorpo anti TRA uno 60 PE per due per 10 alla sesta cellule. Mescolare accuratamente e quindi incubare a quattro gradi Celsius per 10 minuti.Lavare le cellule con un millilitro di tampone di marcatura per due volte 10 alla sesta cellule. Quindi centrifugare la sospensione cellulare per 10 minuti a 300 ×g. Successivamente, aspirare il soprannatante e risospendere il pellet cellulare in 80 microlitri di tampone di marcatura per due volte 10 alla sesta cellule.Quindi aggiungere 20 microlitri di microperle marcate con anti-PE per due volte 10 alla sesta cellule. Mescolare bene e incubare per 15 minuti a quattro gradi Celsius. Aggiungere un millilitro di buffer di marcatura per due volte 10 alla sesta cellule, centrifugare per 10 minuti a 300 G e aspirare il soprannatante.Sospendere quindi il pellet cellulare in 500 microlitri di buffer per marcatura e separare le cellule negative per TRA-1-60 in un separatore magnetico per cellule come descritto nel protocollo testuale allegato. Lisiare le cellule facendo passare ogni campione attraverso una colonna mini spin per omogeneizzazione in un microcentrifugo disponibile in commercio, progettata per mini-preparazioni di acidi nucleici. Estrarre quindi l'RNA totale dalle cellule IPS, I-P-S-R-P-E e dall'epitelio pigmentato retinico fetale utilizzando un kit commerciale per l'estrazione di RNA, progettato per preservare le molecole di RNA di piccole dimensioni.Utilizzare uno spettrofotometro NanoDrop per determinare le concentrazioni totali di RNA; creare un file Excel con un elenco dei microRNA identificati con livelli di espressione diversi di almeno due volte tra i gruppi di campioni. Successivamente, accedere al programma online di analisi dei percorsi dell'RNA e caricare il file Excel. Selezionare il formato flessibile come formato del file e scegliere Agilent dall'elenco a discesa per l'identificatore.Digitare sotto l'intestazione dei dati grezzi. Assegnare l'ID alla colonna ID della sonda e assegnare osservazione uno e rapporto logaritmico alla colonna rapporto logaritmico. Selezionare ignora per tutte le altre colonne.Selezionare i parametri per l'analisi come segue: confidenza, osservato sperimentalmente, includere solo relazioni dirette e indirette e includere sostanze chimiche endogene. Selezionare la base di conoscenza Ingenuity come insieme di riferimento. Quindi scegliere il database delle molecole di riferimento.Questo include dati provenienti da tutte le specie, tutte le linee cellulari e tessuti e tutte le mutazioni. Dopo aver selezionato tutti i parametri, eseguire l'analisi della rete selezionando reti. Quindi selezionare le reti sovrapposte e successivamente fare clic su una rete di interesse per visualizzare i risultati.Le cellule IPS differenziate in cellule I-P-S-R-P-E hanno mostrato il fenotipo classico delle cellule epiteliali pigmentate retiniche (RPE), caratterizzato da una morfologia esagonale e pigmentata, simile a quello delle cellule RPE fetali. Il confronto del profilo di espressione dei microRNA tra le cellule IPS indifferenziate e le cellule I-P-S-R-P-E ha rivelato un'upregolazione di 47 microRNA e una downregolazione di 36 microRNA, mentre le cellule RPE fetali hanno mostrato un'upregolazione di 61 microRNA rispetto alle cellule I-P-S-R-P-E e una downregolazione di 49 microRNA. L'analisi dei percorsi molecolari effettuata con il software Ingenuity IPA ha indicato che i geni bersaglio dei microRNA espressi in modo differenziale erano coinvolti in processi cellulari quali lo sviluppo cellulare, la crescita e il ciclo cellulare. Tale analisi ha inoltre evidenziato che i microRNA espressi nei tessuti oculari in vivo erano arricchiti nelle cellule I-P-S-R-P-E e nelle cellule RPE fetali rispetto alle cellule IPS. Durante l'esecuzione di questa procedura, è importante ricordare di prevenire la contaminazione e il degrado dei campioni di RNA.Altri metodi, come la R-T-P-C-R, possono essere eseguiti per confermare il livello di espressione di micro RNA in ciascun tipo cellulare dopo il suo utilizzo. Questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo della ricerca sulla visione per esplorare il ruolo del micro RNA nella differenziazione e nel progresso del ciclo cellulare nell'rrp. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come ottenere l'epitelio pigmentato retinico da cellule IPS e confrontare il profilo di espressione del microRNA delle cellule I-P-S-R-P-E con quelle delle cellule IPS e dell'epitelio pigmentato retinico fetale.

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MicroRNA Expression Profili di cellule iPS umane, dellepitelio pigmentato retinico derivate da iPS, e fetale dellepitelio pigmentato retinico (Video) | JoVE Journal

MicroRNA Expression Profili di cellule iPS umane, dell'epitelio pigmentato retinico derivate da iPS, e fetale dell'epitelio pigmentato retinico

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