Uso di Shigella flexneri Per studiare le interazioni autofagia-Citoscheletro

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di studiare i meccanismi intracellulari che controllano la disseminazione batterica durante l'infezione in vitro e in vivo utilizzando cellule di coltura tissutale in larve di pesce zebra. Il metodo in vitro inizia con la preparazione di cha flexner, un patogeno batterico gram-negativo ed enteroinvasivo Heller vengono quindi infettati e vengono utilizzati irna o reagenti farmacologici per manipolare il meccanismo dell'autofagia dell'ospite e il citoscheletro durante l'infezione. Per studiare le interazioni del citoscheletro dell'autofagia causate da cha in vivo, gli embrioni di pesce zebra vengono infettati tre giorni dopo la fecondazione per entrambi i metodi.

Il passaggio finale consiste nell'etichettare i tessuti con marcatori autofagici e citoscheletrici. In definitiva, i risultati forniranno informazioni sui meccanismi necessari per il controllo dell'infezione da parte delle risposte citosoliche dell'ospite. Il vantaggio dell'utilizzo del gel per studiare l'autofagia batterica rispetto ad altri batteri come la listeria, è che l'autofagia mirata al gel può anche essere intrappolata nelle gabbie iniziali.

Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo dell'autofagia, come ad esempio qual è il ruolo del citoscheletro nell'autofagia e qual è il ruolo dell'autofagia nella restrizione o nella promozione dei batteri intracellulari? Le implicazioni di questa tecnica possono estendersi ad altri processi di autofagia, come l'autofagia dei virus o dei mitocondri, e possono anche avere implicazioni terapeutiche per le malattie umane con una componente di settina o autofagia. Queste sono dimostrazioni del pesce zebra.

L'infezione da shige è fondamentale in quanto i passaggi che coinvolgono l'iniezione di batteri nel pesce zebra sono difficili da apprendere perché la preparazione dell'ago e la corretta iniezione richiedono tempo e alta risoluzione. La microscopia dell'infezione da pesce zebra richiede esperienza per questo protocollo. Usa il ceppo di tipo selvatico di cha Flexner M nine DT da un ceppo di glicerolo congelato su piastre di soia trittico Congo Red e incubale a 37 gradi Celsius durante la notte.

Inoltre, seminare le cellule hella in piastre a sei pozzetti in terreni MEM con il 10% di siero fetale di vitello il giorno successivo. Raccogli una singola colonia e coltivala in TCS durante la notte con agitazione a 37 gradi Celsius il giorno successivo. Impostare le sottoculture effettuando una diluizione da uno a 80 in TCS fresco.

Quando la densità ottica delle sottocolture a 600 nanometri è compresa tra 0,3 e 0,6. Raccogli i batteri facendoli girare a 1000 G per cinque minuti. Quindi ricostituire il pellet batterico in MEM alla stessa densità ottica.

Ciao, le cellule dovrebbero essere infettate direttamente con una molteplicità di infezioni da 100 a uno. Aggiungere il chag diluito in MEM alle cellule hella piastrate e portare il volume totale di MEM a due millilitri per pozzetto. Quindi, per massimizzare l'aderenza batterica alle cellule ospiti, centrifugare le piastre a 700 G per 10 minuti ea temperatura ambiente, incubare le piastre per 30 minuti in modo che i batteri possano infettare le cellule dopo il periodo di infezione.

Lavare delicatamente le celle due volte. Utilizzando MEM fresco per eliminare ulteriormente i batteri extracellulari, incubare le cellule in Gentamicina contenenti terreni completi per una o quattro ore sulla base di osservazioni empiriche. Quindi, correggi ed etichetta le cellule infette.

Visualizzarli mediante microscopia epifluorescente o confocale utilizzando un obiettivo 63 x o 100 x per risolvere il cha septin marcato DAPI, le gabbie di cha septin possono essere visualizzate come strutture ad anello di circa 0,6 micron e diametro che circondano i batteri citosolici che polimerizzano l'acton. I batteri all'interno delle gabbie di settina possono anche essere riconosciuti da marcatori autofagici come P 62 e lc tre a TG otto. Concettualmente, l'aspetto più difficile di questa procedura è l'identificazione di gabbie batteriche autofagosomiche e singometriche in vivo e in vitro, che richiede un'attenta microscopia e analisi.

Inoltre, è necessario assicurarsi che venga analizzato il numero corretto di eventi su diverse repliche biologiche e garantire la significatività statistica Dopo aver infettato le cellule hella con chila. Innanzitutto, lascia che i batteri trovino la loro strada verso il citosol per almeno due ore e mezza. Successivamente, il trattamento farmacologico può essere effettuato per trattare il citoscheletro.

Aggiungere da uno a cinque microlitri di stock di farmaco diluito a ciascun due millilitri di terreno con cellule come controllo negativo. Trattare un set di cellule con DMSO in MEM, quindi incubare le cellule per 30 minuti per manipolare il flusso autofagico delle cellule. Utilizzare 20 nanomolari di rapamicina o 160 nanomolari di micina bafi.

Quindi incubare le cellule per quattro-12 ore dopo il trattamento. Correggi ed etichetta le celle come descritto nel protocollo di testo. Questa tecnica modella l'infezione da gel e le interazioni del citoscheletro dell'autofagia in vivo Per iniziare la sottocoltura e raccogliere il gel come descritto in precedenza, lavare i batteri con un XPBS e centrifugarli a 1000 G per 10 minuti.

Quindi risospendere i batteri in 80 microlitri di rosso fenolo allo 0,1% in PBS Conservare questo preparato in ghiaccio. Dovrebbe avere circa 2000 batteri per nanolitro 72 ore prima dell'iniezione prevista. Raccogli gli embrioni dal pesce zebra in riproduzione per rimuovere eventuali contaminanti extracellulari.

Lavare gli embrioni in E two terreno con candeggina allo 0,003% per 10 minuti. Dopo 10 minuti, passare al terreno E due e lavare gli embrioni cinque volte in E due. Successivamente, caricare piatti da 10 centimetri con 50 millilitri di E due e fino a 50 embrioni.

Far crescere un totale di circa 100 embrioni a 28 gradi Celsius, 24 ore dopo la fecondazione. Trattare gli embrioni in via di sviluppo con lo 0,003% e fenotrea in E due per prevenire la mein, che interferisce con la microscopia. Iniziare con l'anestetizzazione delle larve delle 72 ore utilizzando un bagno trica da 200 microgrammi per millilitro in terreno E due.

Quindi, utilizzando un micromanipolatore e una pinzetta sottile, rompere la punta dell'ago per microiniezione e controllare il freno al microscopio. Ora carica prima l'ago, trasferisci una goccia della coltura batterica su un vetrino coprioggetti sul tavolino del microscopio. In secondo luogo, accendi il micro iniettore e la bombola del gas.

Terzo, abbassa la punta dell'ago nella goccia. E quarto, riempire l'ago per valutare la sopravvivenza del pesce zebra durante l'infezione da cha. Utilizzare un'iniezione endovenosa di coddle utilizzando un pennello fine.

Posizionare le larve anestetizzate lateralmente sulla piastra di iniezione con i lati dorsali rivolti verso l'ago. Ora la punta dell'ago deve essere posizionata vicino all'apertura urogenitale rivolta alla vena del coccolo. Quindi perforare la pelle e iniettare un bolo di batteri su cinque nanolitri.

Un'iniezione riuscita nella vena codale è indicata dalla visualizzazione del rosso fenolo che si estende lungo la vena. Tecnicamente, l'infezione della vena codale è l'aspetto più difficile di questa procedura e richiediamo pratica con la larva di pesce zebra. La microscopia confocale può anche essere impegnativa perché le larve richiedono un'adeguata misurazione.

Dopo le iniezioni, trasferire ogni larva infetta individualmente in un pozzetto di una piastra a 24 pozzetti contenente un millilitro di terreno E due. Incubare la piastra a 28 gradi Celsius e monitorare quotidianamente gli embrioni. Visualizzare il reclutamento di marcatori di septina e autofagia.

Iniettare Ella in siti localizzati come il muscolo della coda. Prepararsi a iniettare le larve come mostrato nella sezione precedente. Orienta il pesce zebra lateralmente e posiziona l'ago sopra il muscolo.

I somiti quindi perforano lo spazio tra due somiti e iniettano circa un nanolitro di Ella. Un'iniezione riuscita nei muscoli della coda mostrerà che l'acaro iniettato si colora di rosso. Come conseguenza del tampone rosso fenolo, hanno preparato agarosio a basso punto di fusione allo 0,1% in E due mezzi a 37 gradi Celsius.

Aggiungere singolarmente le gocce di agarro in un piatto con fondo di vetro. Trasferire le larve iniettate con un volume minimo di soluzione nelle gocce di agarro. Orientateli a piacere e lasciate solidificare l'agarro.

Quindi, coprire l'intero piatto con LMA seguito da E due con trica. Quindi prendi Zacks ogni due minuti per diverse ore. Nelle cellule di coltura tissutale infette, la shaila fuoriesce dal fagosoma al citosol, dove il citoscheletro ospite può riorganizzare e compartimentare i batteri all'interno di strutture simili a gabbie di septin.

I batteri e intrappolati nelle gabbie di septin sono riconosciuti da marcatori di autofagia come P 62 e lc tre. Il pesce zebra rappresenta un nuovo prezioso ospite per lo studio in vivo dell'infezione da CHA. A seconda della dose infettiva, il pesce zebra può eliminare o assumere una dose bassa entro 48 ore dall'infezione o, nel caso di una dose elevata, soccombere all'infezione.

La trasparenza ottica del ventricolo destro zebrato consente la visualizzazione in vivo delle gabbie di septin e risultati che non sono stati eseguiti utilizzando altri modelli di vertebrati per integrare l'evidenza che le gabbie di septin e intrappolano i batteri bersaglio dell'autofagia. GFP lc tre pesci zebra transgenici sono stati infettati per osservare il reclutamento di lc tre autofagosoma positivo a cha intracellulare in vivo in tempo reale per caratterizzare l'autofagia P 62 morfo sono state iniettate con il controllo chala. Le larve di Morpho mostravano normali strutture di gabbia di septin.

Tuttavia, nelle larve trattate con morfo P 62, il reclutamento della septina nel chala è stato ridotto, indicando che P 62 è un componente essenziale del meccanismo dell'autofagia, una volta padroneggiata l'infezione, la larva PHI può essere eseguita in uno o due quando viene eseguita correttamente Seguendo questa procedura. Altri metodi, come l'editing del genoma con il sistema crisp perca, possono essere utilizzati per manipolare il genoma del pesce zebra. Inoltre, la generazione di una nuova linea di zebrafish fluorescente può essere ingegnerizzata per seguire le dinamiche del citoscheletro dell'autofagia in tempo reale durante l'infezione da gel utilizzando l'imaging dal vivo dopo la sua scoperta.

La gabbia Chaga Septin è stata utilizzata per studiare le interazioni tra autofagia e citoscheletro e ha aperto la strada ai ricercatori nel campo delle infezioni e della biologia cellulare per illuminare nuovi ruoli per il citoscheletro nell'autofagia. Non dimenticare che lavorare con Ella può essere estremamente pericoloso e che durante l'esecuzione di questa procedura è necessario prendere sempre precauzioni come lavorare in un ambiente di laboratorio di livello due.