Name: Uso di Shigella flexneri Per studiare le interazioni autofagia-Citoscheletro (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-09-09T18:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 52 s
Description: Esplora le interazioni autofagia-citoscheletro durante l'infezione da Shigella flexneri utilizzando cellule HeLa e larve di zebrafish. Questo metodo permette di studiare i meccanismi di restrizione batterica attraverso le gabbie di septina e i marcatori autofagici come p62 e LC3 in tempo reale.

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Il lavoro in laboratorio SM è supportato da un Wellcome Trust Research Career Development Fellowship [WT097411MA].

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<li>Mostowy, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Septins+regulate+bacterial+entry+into+host+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Septins regulate bacterial entry into host cells.</a> PLoS One. 4 (15), (2009).</li>
<li>Mostowy, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Septin+11+restricts+InlB-mediated+invasion+by+Listeria%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Septin 11 restricts InlB-mediated invasion by Listeria.</a> J Biol Chem. 284, 11613-11621 (2009).</li>
<li>Phan, Q. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+endothelial+cell+Septin+7+in+the+endocytosis+of+Candida+albicans%5BTitle%5D)+AND+%22mBio%22%5BJournal%5D)">Role of endothelial cell Septin 7 in the endocytosis of Candida albicans.</a> mBio. 4 (e00542-13), (2013).</li>
<li>Mostowy, S., Cossart, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Septins+as+key+regulators+of+actin+based+processes+in+bacterial+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Septins as key regulators of actin based processes in bacterial infection.</a> Biol Chem. 392, 831-835 (2011).</li>
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<li>Mostowy, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autophagy+and+bacterial+clearance%3A+a+not+so+clear+picture%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Autophagy and bacterial clearance: a not so clear picture.</a> Cell Microbiol. 2 (12063), (2012).</li>
<li>Mostowy, S., Cossart, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+autophagy%3A+restriction+or+promotion+of+bacterial+replication%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Bacterial autophagy: restriction or promotion of bacterial replication.</a> Trends Cell Biol. 22, 283-291 (2012).</li>
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<li>Mostowy, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+zebrafish+as+a+new+model+for+the+in+vivo+study+of+Shigella+flexneri+interaction+with+phagocytes+and+bacterial+autophagy%5BTitle%5D)+AND+%22Plos+Path%22%5BJournal%5D)">The zebrafish as a new model for the in vivo study of Shigella flexneri interaction with phagocytes and bacterial autophagy.</a> Plos Path. 9, e1003588(2013).</li>
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</ol>

Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari in competizione.

Durante il monitoraggio autofagia e il citoscheletro in vitro utilizzando cellule di coltura tissutale, i protocolli descritti nelle sezioni 1 e 2 possono essere applicati a una vasta gamma di tipi di cellule di coltura di tessuti. Inoltre, per seguire autofagia (ad esempio, ATG8 / LC3 + ve autophagosomes) e citoscheletro (ad es., Le code di actina, gabbie Septin) dinamiche in tempo reale durante l&#39;infezione da Shigella utilizzando l&#39;imaging dal vivo, le cellule di coltura tissutale possono essere trasfettate con GFP, costrutti RFP- o CFP-targhette come descritto in precedenza 7,8. Per aumentare la percentuale di cellule infettate da Shigella (vale a dire, in genere auspicabile per l&#39;analisi in tempo reale se si considera che Shigella può invadere 5-30% delle cellule HeLa a 100:. 1 MOI), aggiungere direttamente 400 ml di Shigella (OD 600 = 0.3 -0.6) alle cellule in 2 ml di MEM (siero-fame) e attendere almeno 1,5 ore dopo l&#39;infezione batterica sufficiente per l&#39;ingresso, la fuga dalla phagosome, replica, auriconoscimento tophagy e Septin ingabbiamento. In alternativa, si può usare il ceppo Shigella M90T Afai che esprime la adesina AfaE e sono molto più alte capacità di invasione nelle cellule epiteliali rispetto al ceppo M90T 28. Da segnalare, il ceppo M90T Afai non è ancora stato testato in vivo utilizzando zebrafish. Lastre di colonie Shigella possono essere mantenuti a 4 ° C per 2-3 giorni e utilizzati per diversi esperimenti. Tuttavia, nel corso del tempo, colonie di Shigella che hanno perso il plasmide di virulenza può anche assorbire il Congo rosso e sembra aver mantenuto il loro plasmide di virulenza. Per questo motivo si consiglia di utilizzare ceppi batterici freschi quando possibile. Quando il monitoraggio della biologia cellulare di infezione in vivo, i protocolli descritti nelle sezioni 3 e 4, uso la linea di tipo selvatico AB zebrafish. Per monitorare Shigella interazioni -leukocyte, linee di zebrafish transgenici possono essere utilizzate, ad esempio, mpx: GFP o lyz: DsRed a Visualize neutrofili 19,29,30 o mpeg1: mCherry per visualizzare macrofagi 19,31. Per visualizzare l&#39;autofagia in vivo, la GFP-Lc3 zebrafish linea transgenica 19,24 può essere utilizzato come descritto nella sezione 3.8. Per perturbare l&#39;autofagia in vivo, la dose efficace morfolino oligonucleotidi deve essere valutata sperimentalmente in base alla sua efficienza di inibire la trascrizione splicing o la traduzione della proteina. Si consiglia di eseguire un esperimento di titolazione e per confermare l&#39;esaurimento mediante RT-PCR (per splice morfolino oligonucleotidi) o mediante SDS-PAGE (per traslazionale morfolino oligonucleotidi) 32. RNA isolamento da embrioni di zebrafish o larve può essere effettuata utilizzando l&#39;estrazione guanidina tiocianato-fenolo-cloroformio. Per estrarre proteine ​​da larve di zebrafish (da 8 a 15 larve / tubo), omogeneizzare meccanicamente con un pestello in 200 microlitri tampone di lisi (1 M Tris, NaCl 5 M, 0,5 M EDTA, 0,01% ottilfenolo ossido di etilene condensate, e inibitore della proteasi). Tubi centrifugare a 19.000 xg a 4 ° C per 15 minuti e trasferire il surnatante in una nuova provetta. Aggiungere tampone Laemmli e riscaldare il campione a 95 ° C per 15 min. Lisati possono essere conservati a -80 ° C fino al momento, e possono essere valutati mediante Western blotting come descritto nella sezione 2.3. Il pesce zebra è un modello eccellente per applicazioni in vivo di droga. Analisi mediante oligonucleotidi morpholino può essere integrata con farmaci stabiliti per manipolare autofagia (ad esempio, rapamicina e bafilomycin). Larve non infette e / o infetti può essere trattata con rapamicina (1,5 mM) o bafilomycin (80 nM) diluito in E2 e flusso autofagica può essere valutata mediante Western blotting come descritto in 25,33. La conseguenza della manipolazione autofagia sul risultato dell&#39;infezione e la sopravvivenza delle larve infetto può essere valutata come descritto nella sezione 3.5. Oltre allo studio della cellula ospitedeterminanti, in vitro ed in vivo protocolli possono essere applicati per valutare i determinanti batterici necessari per il riconoscimento autofagia, utilizzando ceppi mutanti batterici che sono differenzialmente riconosciute da autofagia, ad es., Shigella ΔicsA (la proteina Shigella IcsA recluta N-WASP e poi Arp2 / 3 per actina coda e formazione gabbia Septin, in sua assenza, non ci possono essere code di actina, senza gabbie Septin) e ShigellaΔicsB (Shigella evita la risposta autofagica tramite la proteina batterica ICSB effettrici, che impedisce l&#39;assunzione di macchinari autofagia per IcsA, in sua assenza ci possono essere più gabbie Septin, più autofagia) 7,8. Shigella non è un patogeno naturale di zebrafish e cresce in modo ottimale a 37 ° C. Tuttavia, il lavoro ha dimostrato che i fattori di virulenza necessari per Shigella invasione, fuggire dal vacuolo di fagocitosi e la replica nel cytosol può essere espresso e sono funzionali in larve di zebrafish a 28 ° C 19. 28 ° C è la temperatura più comunemente usato per l&#39;allevamento zebrafish e temperatura standard per garantire lo sviluppo di zebrafish normale 23. Sorprendentemente, i principali eventi patogenetici che portano alla shigellosi negli esseri umani (cioè, la morte cellulare dei macrofagi, invasione e moltiplicazione all&#39;interno delle cellule epiteliali, la diffusione cellula-cellula, distruzione infiammatoria del dell&#39;epitelio ospitante) sono fedelmente riprodotti nel modello di zebrafish di infezione da Shigella 19. Autofagia e citoscheletro geni sono espressi ubiquitariamente e hanno una vasta gamma di funzioni biologiche. Studi hanno dimostrato che mouse knockout di autofagia essenziali 26 o Septin geni 5 sono embrionale letale, ed è probabile che alcuni di questi geni sarà anche essenziale per lo sviluppo di zebrafish (anche se questo problema può essere ridotto dal fatto che il pesce zebra hanno molteplicigeni paraloghi 33). Se è così, ci sono diverse alternative per superare questo problema, tra cui (i) l&#39;uso di reagenti farmacologiche per regolare l&#39;autofagia e il citoscheletro, (ii) Morpholinos possono essere titolati in basso, (iii) knockout di geni può essere progettato solo per specifica cella tipi, e / o (iv) geni coinvolti nel riconoscimento autofagica che non sono essenziali per lo sviluppo degli animali (ad es., P62) possono essere mirati. Mentre il pesce zebra è un sistema modello ideale per studiare l&#39;autofagia e il citoscheletro durante l&#39;infezione Shigella, strumenti molecolari attualmente mancano. Il campo ha bisogno di generare nuovi strumenti e cellulare in auto specifica espressione delle proteine ​​di interesse. Per abbattere l&#39;espressione di geni dell&#39;autofagia / citoscheletro, nuove sequenze morpholino sono necessari, e di nuovi metodi per l&#39;ingegneria del genoma (ad esempio, TALEN, CRISPR / Cas9) possono anche essere utilizzati. Nel frattempo, diversi strumenti precedentemente generati per gli studi umani o del mousepossono ugualmente funzionare per zebrafish. I batteri intracellulari S. flexneri è emerso come un organismo modello eccezionale per affrontare le questioni fondamentali in biologia, tra cui la capacità dei batteri di essere riconosciuto dal 1,2 del sistema immunitario. La cellula ospite impiega septins per limitare la motilità di S. flexneri e la loro destinazione ad autofagia, una componente critica di cellule dell&#39;immunità autonoma 7,8. Queste osservazioni suggeriscono un nuovo quadro molecolare per studiare l&#39;autofagia e la sua capacità di degradare batteri citosolici. Una questione importante è ora quello di decifrare pienamente gli eventi molecolari e cellulari alla base, e per convalidare questi eventi analizzati in vitro durante l&#39;infezione batterica in vivo su modelli animali pertinenti. A tal fine, il pesce zebra è stato stabilito come un nuovo ospite prezioso per l&#39;analisi di S. infezione flexneri 19. Le interazioni tra batteri e cellule ospiti possono essere esposte ad alta risoluzione, eil modello di zebrafish dovrebbe rivelarsi utile per comprendere la biologia cellulare di infezione Shigella in vivo. Larve Zebrafish può essere utilizzato per studiare il ruolo dell&#39;autofagia batterica in difesa ospite, e il lavoro ha dimostrato che la perturbazione di autofagia può influenzare negativamente la sopravvivenza di accoglienza in risposta alle infezioni Shigella 19. Le osservazioni generate dallo studio di Shigella, Septin ingabbiamento e autofagia in vitro utilizzando colture cellulari e in vivo utilizzando larve di zebrafish potrebbe fornire progressi fondamentali nella comprensione difesa ospite. Si potrebbe anche suggerire lo sviluppo di nuove strategie volte a combattere le malattie infettive. Un obiettivo fondamentale di questo rapporto è quello di dare un senso degli eventi molecolari e cellulari analizzati in vitro (cioè, l&#39;autofagia, code di actina, Septin ingabbiamento) durante l&#39;infezione batterica in vivo, nel contesto di un entorganismo ire, utilizzando larve di zebrafish. Se non ha familiarità con la biologia e la manipolazione zebrafish, si può fare riferimento ai protocolli di profondità per un corretto allevamento zebrafish 23 e in analisi in vivo di infezione zebrafish 19,35.

Shigella flexneri, un batterio enteropatogena invasivo Gram-negativi, può sfuggire phagosomes al citosol, e polimerizzare il citoscheletro di actina host per eludere le risposte immunitarie citosoliche e promuovere intra e intercellulare movimento 1,2. Nonostante la comprensione della motilità actina-base in vitro 3,4, i meccanismi che limitano la diffusione dei batteri in vivo non sono state completamente definite. Questo è fondamentale per una comprensione più completa di immunità innata e difesa ospite. Septins, una famiglia altamente conservata di proteine ​​tra i metazoi, sono guanosina trifosfato (GTP) -binding proteine ​​che si assemblano in complessi etero-oligomeriche e formano filamenti polari che si associano con le membrane cellulari e il citoscheletro 5,6. Studi recenti hanno scoperto che le cellule ospiti infette possono impedire Shigella motilità actina base da batteri compartimentazione mirati a autophFOXG dentro &quot;gabbie Septin&quot;, rivelando il primo meccanismo cellulare che contrasta la motilità actina base 7,8. Un campo spalancato di indagine ora si trova in &#39;biologia Septin e infezioni&#39;. Montaggio Septin, indotta da una varietà di agenti patogeni (ad esempio, Listeria monocytogenes 7,9,10, Mycobacterium marinum 7,8, Candida albicans 11), potrebbe emergere come una questione chiave in difesa ospite 5,12. L&#39;autofagia, un processo di degradazione intracellulare altamente conservata, è visto come una componente chiave della immunità cellulo-autonoma a causa della sua capacità di fornire i batteri citosol al lisosoma 13,14. Tuttavia, il ruolo dell&#39;autofagia batterica in vivo per limitare o promuovere la replicazione batterica rimane poco compresa 15,16. Il pesce zebra (Danio rerio) è emerso come un modello vertebrato per lo studio delle infezioni perché è otticamente accessibilinelle fasi larvali quando il sistema immunitario innato è già funzionante 17,18. Un recente lavoro ha caratterizzato la suscettibilità delle larve di zebrafish a S. flexneri, un paradigma per autofagia batterica 15, ed ha utilizzato il modello di infezione -zebrafish Shigella per studiare la manipolazione di autofagia per la terapia antibatterica in vivo 19. Questo rapporto fornisce nuovi strumenti e saggi per studiare S. interazioni flexneri con autofagia e il citoscheletro. In una prima fase, i protocolli per monitorare le interazioni autofagia-citoscheletro vengono descritte utilizzando infezione Shigella della linea di cellule epiteliali umane HeLa. Per valutare il ruolo delle interazioni autofagia-citoscheletro sul processo di infezione Shigella in vitro, i metodi per manipolare l&#39;autofagia e componenti del citoscheletro (utilizzando siRNA o reagenti farmacologici) sono forniti. Nuovo lavoro ha dimostrato che utilizzando Shigella infezione of larve zebrafish, saggi simili può essere applicato per studiare la biologia cellulare di infezione in vivo. Protocolli per la preparazione e infettare zebrafish larve sono dettagliati, e di valutare la risposta dell&#39;ospite alle infezioni Shigella in vivo, i protocolli per determinare la sopravvivenza host e carica batterica delle larve infette sono forniti. Metodi per monitorare l&#39;assunzione di Septin e autofagia marcatori per Shigella (utilizzando larve di zebrafish fisso o vivente) e metodi per testare il ruolo di questi processi in vivo [utilizzando oligonucleotidi morpholino (iniettati in 1-4 embrioni stadio delle cellule) o reagenti farmacologici ( aggiunto direttamente all&#39;acqua del bagno zebrafish)] vengono anche discussi. Questo programma di lavoro dovrebbe fornire informazioni sui meccanismi necessari per il controllo dell&#39;infezione da risposte ospitanti citosolici.

<table><tbody><tr><td>Bafilomicina A1</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B1793&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Blebbistatin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B0560</td><td></td></tr><tr><td>Microcapillari in vetro borosilicato&nbsp;</td><td>Harvard Apparatus</td><td>30038</td><td></td></tr><tr><td>Manipolatore manuale grossolano&nbsp;</td><td>Narishige</td><td>M-152</td><td></td></tr><tr><td>Citocalasina D</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C6762</td><td></td></tr><tr><td>4',6-diamidino-2-fenilindolo (DAPI)</td><td>Sonde molecolari</td><td>D1306</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #5 pinzette fini</td><td>Strumenti di scienza fine</td><td>11254-20</td><td></td></tr><tr><td>Forchlorfeneuron&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>32974</td><td></td></tr><tr><td>Sonde molecolari</td><td>anticorpali IgG (H+L) anti-topo di capra</td><td>N/A&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo IgG (H+L) di capra formica-coniglio</td><td>Sonde molecolari</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Reagente di trasfezione JetPEI</td><td>Trasfezione Polyplus</td><td>101-01N</td><td></td></tr><tr><td>Latrunculina B</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L5288</td><td></td></tr><tr><td>LC3 anticorpo</td><td>Novus Biologicals</td><td>NB100-2220</td><td></td></tr><tr><td>Agarosio a basso punto di fusione</td><td>Promega</td><td>V2111</td><td></td></tr><tr><td>MatTek piatto con fondo in vetro</td><td>MatTek corporation</td><td>P35G-1.0-14</td><td></td></tr><tr><td>MEM plus L-alanil-L-glutammina&nbsp;</td><td>GIBCO</td><td>41090028</td><td></td></tr><tr><td>MEM soluzione di aminoacidi non essenziali</td><td>GIBCO</td><td>11140-035</td><td></td></tr><tr><td>Microiniettore&nbsp;</td><td>Narishige</td><td>IM-300</td><td></td></tr><tr><td>Dispositivo estrattore per micropipette&nbsp;</td><td>Sutter Instrument Co., Novato,</td> <td>P-87&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Olio minerale</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P35G-1.0-14</td><td></td></tr><tr><td>Anti-tubulina monoclonale, anticorpo acetilato&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T6793</td><td></td></tr><tr><td>Nocodazolo</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M1404</td><td></td></tr><tr><td>N-feniltiourea&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7629</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldeide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>158127</td><td></td></tr><tr><td>falloidina&nbsp;</td><td>Sonde molecolari</td><td>A12379</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione di rosso fenolo</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P0290</td><td></td></tr><tr><td>Cocktail di inibitori della proteasi</td><td>Roche</td><td>4693116001</td><td></td></tr><tr><td>p62/SQSTM1 anticorpo</td><td>Cliniscience</td><td>PM045</td><td></td></tr><tr><td>Rapamicina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R8781</td><td></td></tr><tr><td>Piruvato di sodio</td><td>GIBCO</td><td>11360039</td><td></td></tr><tr><td>Reagente di trasfezione</td><td>Life Technologies</td><td>12252-011</td><td></td></tr><tr><td>Terreno di montaggio rigido Vectashield contenente DAPI&nbsp;</td><td>Laboratori vettoriali</td><td>H-1500&nbsp;</td><td></td></tr></tbody></table>

uso di<em&gt; shigella flexneri</em&gt; per studiare le interazioni autofagia-citoscheletro

Use of Shigella flexneri to Study Autophagy-Cytoskeleton Interactions

Shigella flexneri è un patogeno intracellulare che può sfuggire da phagosomes per raggiungere il citosol, e polimerizzare l&#39;host citoscheletro di actina per promuovere la sua motilità e la diffusione. Nuovo lavoro ha dimostrato che le proteine ​​coinvolte nella motilità base di actina-sono anche legati ad autofagia, un processo di degradazione intracellulare cruciale per l&#39;immunità delle cellule autonome. Sorprendentemente, cellule ospiti possono impedire a base actina-motilità di S. flexneri da compartimenti batteri all&#39;interno Septin &#39;gabbie&#39; e mira a autofagia. Queste osservazioni indicano che una comprensione più completa di septins, una famiglia di proteine ​​leganti il ​​GTP filamentosi, fornirà nuove intuizioni nel processo di autofagia. Questo rapporto descrive i protocolli per monitorare le interazioni autofagia-citoscheletro causate da S. flexneri in vitro utilizzando cellule di coltura di tessuti e in vivo utilizzando larve di zebrafish. Questi protocolli consentono indagini di mechanis intracellularims che controllano la diffusione batterica a livello dell&#39;organismo molecolare, cellulare, e tutto.

Su infezione di cellule di coltura dei tessuti in vitro, S. flexneri può fuoriuscire dalla phagosome e invadere il citosol. Nel citosol, cellule ospiti possono impedire la motilità actina-base di Shigella da compartimenti batteri all&#39;interno gabbie Septin (Figura 1A). I batteri intrappolati da gabbie Septin possono anche essere etichettati con marcatori autofagia p62 (Figura 1B) e LC3 (Figura 1C). Queste osservazioni mettono in luce un nuovo meccanismo di difesa dell&#39;ospite che limita la diffusione di agenti patogeni invasivi, e rivelano anche nuovi collegamenti tra autofagia e il citoscheletro. Sorprendentemente, l&#39;esaurimento dei marcatori autofagia riduce significativamente Septin ingabbiamento di batteri (Figura 2A), e il lavoro ha anche dimostrato che la deplezione di Septin ingabbiamento riduce significativamente l&#39;assunzione di marcatori di autofagia 8. Così, almeno nel caso di Shigella, Septin gruppo telaio e formatio dell&#39;autofagosoman può essere visto come processi interdipendenti. Altri requisiti cellulari per compartimentalizzazione di Shigella da gabbie Septin includono polimerizzazione e l&#39;attività actomiosina (Figura 2B). Non esiste un modello naturale topo di shigellosi, e ricerca di Shigella patogenesi, Septin biologia e autofagia batterica in vivo possono beneficiare di un nuovo modello animale di infezione, le larve zebrafish 19. E &#39;possibile infettare larve zebrafish iniettando batteri in varie sedi anatomiche come iniezioni endovenose caudale per esperimenti di sopravvivenza, e iniezioni muscolari coda per microscopia in vivo (Figura 3A). A seconda della dose, S. flexneri iniettato in larve di zebrafish può o essere cancellata entro 48 ore dopo l&#39;infezione, o può provocare una infezione progressiva e infine fatale (Figure 3B - 3D). Shigella virulenza factors sono espresse a 28 ° C, la temperatura di crescita ottimale di zebrafish, e l&#39;infezione da Shigella zebrafish è strettamente dipendente il proprio sistema di secrezione di tipo III (T3SS) 19, un determinante virulenza essenziale nella malattia umana. Nel loro insieme, queste osservazioni indicano che la larva zebrafish rappresenta un nuovo host valido per l&#39;analisi in vivo di infezione da Shigella. L&#39;accessibilità ottica di larve di zebrafish permette la visualizzazione di Septin ingabbiamento in vivo (Figura 4A), un risultato che non è mai stato realizzato utilizzando modelli ospitanti mammiferi. Per completare la prova che le gabbie Septin intrappolano i batteri mirati per autofagia in vivo, si può infettare larve di zebrafish transgenici che esprimono GFP-Lc3 e osservare marcatore autofagia reclutamento Shigella (Figura 4B). Per l&#39;analisi ultrastrucutral di autofagosomi Shigella in vivo, ELmicroscopia ECTRON può essere usato per mostrare chiaramente il sequestro citosolica dei batteri da vacuoli doppia membrana 19. L&#39;autofagia è visto come una componente chiave della immunità cellulo-autonomo e un meccanismo fondamentale di difesa contro i batteri intracytosolic 14-16. Per caratterizzare la funzione autofagia in vivo, P62 morfolino trattati con larve di zebrafish può essere utilizzato. A differenza delle macchine nucleo autofagia [ad es., 36 autofagia relative proteine ​​(ATGS) 26], P62 non è essenziale per lo sviluppo dei vertebrati 27 e quindi larve di zebrafish può svilupparsi normalmente prima infezione. Sorprendentemente, larve P62-impoverito inoculati con S. risultato flexneri in modo significativo aumento della mortalità e aumento della carica batterica 19. In accordo con il lavoro in vitro dimostrano che l&#39;assemblaggio della gabbia Septin è interdipendente con la formazione dell&#39;autofagosoma 7,8, Septin reclutamento di Shigella è chiaramente ridotta in larve p62-impoverito ( <strong&gt; Figura 4C). Questi dati dimostrano che la sopravvivenza zebrafish dipende da p62-mediata autofagia per controllare l&#39;infezione batterica intracellulare. <img alt="Figura 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51601/51601fig1highres.jpg" width="500" /> Figura 1 La gabbia Septin in vitro. (A) cellule HeLa sono state infettate con S. flexneri per 4 ore 40 min, fisso, etichettato con anticorpi anti SEPT9 e falloidina, e ripreso da microcopy confocale. Bar Scala, 1 micron. (B), le cellule HeLa sono state infettate con S. flexneri per 4 ore 40 min, fisso, etichettato con anticorpi anti-p62 e SEPT2, e ripreso al microscopio ottico a fluorescenza. Bar Scala, 1 micron. Cellule (C) HeLa sono state trasfettate con GFP-ATG8 / LC3, infettati con S. flexneri per 4 ore 40 min, fisso, marcato con anticorpi anti SEPT2, e ripreso da Mi fluorescentimicroscopia. Bar Scala, 1 micron. Questi dati sono stati modificati da Mostowy et al 7. <img alt="Figura 2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51601/51601fig2highres.jpg" width="500" /> Figura 2. requisiti cellulari per Shigella formazione gabbia -septin. (A) cellule HeLa sono stati trattati con il controllo (CTRL), p62, ATG5, ATG6 o ATG7 siRNA. Lisati Whole-cellulari di siRNA-trattate sono state immunoblotted per GAPDH, p62, ATG5, ATG6, o ATG7 per mostrare l&#39;efficienza dei siRNA esaurimento (in alto). cellule trattate con siRNA sono stati infettati con S. flexneri per 4 ore 40 min, fisso, ed etichettati per la microscopia quantitativa. Grafici (in basso) rappresentano la media ± SEM% di Shigella dentro gabbie SEPT2 da n ≥3 esperimenti per il trattamento. (B) cellule HeLa sono state infettate con S. flexneri, trattati con DMSO, citocalasina D (CytD), latrunculin B (LATB), nocodazole (Noco), o blebbistatin (Bleb) e dopo 4 ore 40 minuti sono stati fissati ed etichettati per la microscopia quantitativa. I grafici rappresentano la media ± SEM% di Shigella dentro gabbie SEPT2 da due esperimenti indipendenti per ogni trattamento. Questi dati sono stati modificati da Mostowy et al 7. <img alt="Figura 3" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51601/51601fig3highres.jpg" width="500" /> Figura 3 Il modello di zebrafish di infezione Shigella. (A) Immagini per illustrare l&#39;orientamento della larva di zebrafish allo stereomicroscopio. (Pannello di sinistra) Zebrafish larve 72 ore dopo la fecondazione sono stati posizionati lateralmente nella piastra di iniezione con il loro lato dorsale rivolta verso l&#39;ago di iniezione. Infezione (pannello centrale) Flusso sanguigno è stata eseguita da injette i batteri (soluzione rossa) nella vena caudale, posteriormente all&#39;apertura urogenitale. (Pannello di destra) Infezione nel muscolo coda è stata eseguita iniettando i batteri (soluzione rossa) nel corso di un somite. (B) Le curve di sopravvivenza di 72 ore dopo la fecondazione larve iniettati con varie dosi di S. flexneri e incubato a 28 ° C per 48 ore dopo l&#39;infezione. L&#39;inoculo efficace è stato classificato come basso (&lt;10 3 CFU, cerchi aperti), medio (~ 4 x 10 3 CFU, triangoli aperti) o alto (~ 10 4 CFU, piazze). Media% ± SEM (barre orizzontali) da n ≥3 esperimenti per classe inoculo. (C) Enumerazione di batteri vivi in omogenati da larve individuo in tempi diversi dopo l&#39;infezione rilevata dalla placcatura su LB. Nota, solo le larve sopravvissute l&#39;infezione sono inclusi nell&#39;analisi di enumerazione. Media ± SEM (barre orizzontali) anche mostrato. (D) Distribuzione di GFP Shigella determinato daimmagini dal vivo utilizzando uno stereomicroscopio a fluorescenza in vari momenti dopo l&#39;infezione con un basso, medio, o inoculo ad alte dosi (iniezioni endovenose caudale). Sovrapposizione immagine di trasmissione (grigio) e fluorescenza GFP (verde) (B) di -. (D) Questi dati sono stati modificati da Mostowy et al 19. <img alt="Figura 4" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51601/51601fig4highres.jpg" width="500" /> Figura 4 La biologia cellulare di infezione Shigella in vivo. (A) larve Zebrafish sono stati infettati nel muscolo coda con GFP Shigella (basso dosaggio) per 24 ore, fissa, marcato con anticorpi contro SEPT7 (rosso) e di GFP (green ), e ripreso al microscopio confocale. Bar Scala, 5 micron. (B) GFP-Lc3 larve di zebrafish sono stati infettati con mCherry- Shigella (media della dose) per4 ore, fissa, marcato con anticorpi contro mCherry (rosso) e di GFP (verde), e ripreso al microscopio confocale. . Bar Scala, 1.5 micron (C) larve Zebrafish trattati sia con controllo (CTRL; immagine a sinistra) o p62 (immagine a destra) Morpholinos sono stati infettati con GFP Shigella per 4 ore (media della dose), fissa, marcato con anticorpi contro SEPT7 ( rosso) e per GFP (verde), e ripreso al microscopio confocale. Le frecce evidenziano alcuni esempi di Shigella intrappolate in gabbie Septin (CTRL) o non (p62 esaurita) un post infezione 4 ore. Bar Scala, 5 micron. Questi dati sono stati modificati da Mostowy et al 19.

Per contrastare la diffusione degli agenti patogeni, le cellule ospiti riorganizzano il loro citoscheletro a compartimenti stagni batteri e indurre l&#39;autofagia. Utilizzando Shigella infezione di cellule di coltura di tessuti, di accoglienza e di determinanti patogeni alla base di tale processo sono identificati e caratterizzati. Utilizzando modelli di zebrafish di infezione Shigella, il ruolo di molecole e meccanismi scoperti sono indagato in vivo.

Uso di<em&gt; Shigella flexneri</em&gt; Per studiare le interazioni autofagia-Citoscheletro

Shigella flexneri is an intracellular pathogen that can escape from phagosomes to reach the cytosol, and polymerize the host actin cytoskeleton to promote ...

L'obiettivo generale di questo procedimento è studiare i meccanismi intracellulari che controllano la disseminazione batterica durante l'infezione in vitro e in vivo, utilizzando cellule in coltura tissutale e larve di pesce zebra. Il metodo in vitro inizia con la preparazione di *Shigella flexneri*, un patogeno batterico gram-negativo ed enteroinvasivo. Successivamente, le cellule vengono infettate e vengono utilizzati reagenti RNA o farmacologici per manipolare la macchina dell'autofagia e il citoscheletro dell'ospite durante l'infezione. Per studiare le interazioni tra autofagia e citoscheletro indotte da *Shigella* in vivo, gli embrioni di pesce zebra vengono infettati tre giorni dopo la fecondazione; questa procedura si applica a entrambi i metodi.L'ultimo passaggio consiste nell'etichettare i tessuti con marcatori dell'autofagia e del citoscheletro. In definitiva, i risultati forniranno informazioni sui meccanismi necessari per il controllo dell'infezione mediante risposte citosoliche dell'ospite. Il vantaggio dell'utilizzo di gel per lo studio dell'autofagia batterica rispetto ad altri batteri come Listeria è che l'autofagia indirizzata al gel può essere intrappolata anche in gabbie iniziali.Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nel campo dell'autofagia, come qual è il ruolo del citoscheletro nell'autofagia e qual è il ruolo dell'autofagia nella restrizione o promozione di batteri intracellulari? Le implicazioni di questa tecnica possono estendersi ad altri processi di autofagia, come l'autofagia di virus o mitocondri, e possono avere anche ricadute terapeutiche per malattie umane caratterizzate da un coinvolgimento dei settini o dell'autofagia. Questi sono esempi di pesce zebra.L'infezione da shige è fondamentale poiché i passaggi che prevedono l'iniezione di pesci zebra con batteri sono difficili da apprendere, in quanto la preparazione dell'ago e l'esecuzione corretta dell'iniezione richiedono tempo e alta precisione. L'osservazione al microscopio dell'infezione nei pesci zebra richiede esperienza per questo protocollo. Utilizzare il ceppo di tipo selvatico di cha Flexner M nine DT partendo da una coltura madre congelata in glicerolo, seminare i batteri su piastre di agar triptico-soia al Rosso Congo e incubare le piastre a 37 gradi Celsius per tutta la notte.Inoltre, il giorno successivo seminare le cellule hella in piastre a sei pozzetti in terreno MEM contenente 10% di siero fetale bovino. Il giorno seguente, selezionare una singola colonia e coltivarla in terreno TCS durante la notte con agitazione a 37 gradi Celsius. Preparare sottocolture effettuando una diluizione da uno a 80 in terreno TCS fresco.Quando la densità ottica delle sotto-colture a 600 nanometri è compresa tra 0,3 e 0,6, raccogliere i batteri centrifugandoli a 1000 ×g per cinque minuti. Successivamente, risospendere il pellet batterico in MEM fino a raggiungere la stessa densità ottica.Ciao, le cellule devono essere infettate con una multiplicità di infezione di 100 a 1 direttamente. Aggiungere il CHAG diluito in MEM alle cellule Hella piastrate e portare il volume totale di MEM a due millilitri per pozzetto. Successivamente, per massimizzare l'adesione batterica alle cellule ospiti, centrifugare le piastre a 700 ×g per 10 minuti e incubare le piastre a temperatura ambiente per 30 minuti, in modo che i batteri possano infettare le cellule dopo il periodo di infezione.Lavare delicatamente le cellule due volte. Utilizzando MEM fresco per eliminare ulteriormente i batteri extracellulari, incubare le cellule in un mezzo completo contenente Gentamicina per un periodo compreso tra uno e quattro ore, in base a osservazioni empiriche. Successivamente, fissare ed etichettare le cellule infette.Visualizzarle mediante microscopia a fluorescenza in epifluorescenza o confocale utilizzando un obiettivo da 63x o 100x per risolvere le gabbie di settina marcate con DAPI, che possono essere osservate come strutture ad anello di circa 0,6 micron di diametro che circondano batteri citosolici che polimerizzano l'actina. I batteri all'interno delle gabbie di settina possono inoltre essere riconosciuti da marcatori dell'autofagia come p62 e LC3. Dal punto di vista concettuale, l'aspetto più complesso di questa procedura è l'identificazione in vivo e in vitro degli autofagosomi batterici e delle gabbie di settina, che richiede un'analisi microscopica accurata.Inoltre, è necessario assicurarsi che venga analizzato il numero appropriato di eventi su diverse repliche biologiche e garantire la significatività statistica dopo aver infettato le cellule HeLa con Chila. Per prima cosa, lasciare che i batteri impieghino almeno due ore e mezza per raggiungere il citosol. Successivamente, è possibile effettuare il trattamento farmacologico per agire sul citoscheletro.Aggiungere da uno a cinque microlitri di soluzione madre del farmaco diluita a ogni due millilitri di terreno con cellule come controllo negativo. Trattare un gruppo di cellule con DMSO in MEM, quindi incubare le cellule per 30 minuti per modulare il flusso autofagico delle cellule. Utilizzare 20 nanomolari di rapamicina o 160 nanomolari di bafimicina.Quindi incubare le cellule per quattro-dodici ore dopo il trattamento. Fissare ed etichettare le cellule come descritto nel protocollo testuale. Questa tecnica modella in vivo le interazioni tra infezione da gel e citoscheletro dell'autofagia. Per iniziare il sottocoltura e raccogliere il gel come precedentemente descritto, lavare i batteri con un XPBS e centrifugare a 1000 G per 10 minuti.Quindi risospendere i batteri in 80 microlitri di fenolo rosso 0,1% in PBS. Mantenere questa preparazione sul ghiaccio. Dovrebbe contenere circa 2000 batteri per nanolitro 72 ore prima dell'iniezione programmata. Raccogliere gli embrioni da zebrafish in deposizione per rimuovere eventuali contaminanti extracellulari.Lavare gli embrioni nel mezzo E due con ipoclorito allo 0,003% per 10 minuti. Dopo 10 minuti, sostituire con mezzo E due e lavare gli embrioni cinque volte nel mezzo E due. Successivamente, caricare piastre da 10 centimetri con 50 millilitri di mezzo E due e fino a 50 embrioni.Coltivare un totale di circa 100 embrioni a 28 gradi Celsius, 24 ore dopo la fecondazione. Trattare gli embrioni in via di sviluppo con 0,003% di fenotiazina in mezzo E2 per prevenire la pigmentazione, che interferisce con la microscopia. Iniziare anestetizzando le larve a 72 ore utilizzando un bagno di tricaina a 200 microgrammi per millilitro in mezzo E2.Quindi, utilizzando un micromanipolatore e pinzette fini, rompere la punta dell'ago da microiniezione e verificare la rottura al microscopio. Caricare ora l'ago, trasferire una goccia della coltura batterica su un vetrino posto sul portacampioni del microscopio. In secondo luogo, accendere il microiniettore e la bombola del gas.In terzo luogo, abbassare la punta dell'ago nella goccia. E in quarto luogo, riempire l'ago per valutare la sopravvivenza dei zebrafish durante l'infezione da cha. Utilizzare un'iniezione endovenosa con il supporto di un pennello fine.Posizionare i larve anestetizzati lateralmente sulla piastra di iniezione con il lato dorsale rivolto verso l'ago. A questo punto, la punta dell'ago deve essere posizionata vicino all'apertura urogenitale, mirando alla vena coddle. Quindi, perforare la pelle e iniettare una bolla di un quinto di nanolitro di batteri.Un'iniezione riuscita nella vena caudale è indicata dalla visualizzazione del rosso fenolo che si estende lungo la vena. Da un punto di vista tecnico, l'iniezione nella vena caudale rappresenta l'aspetto più difficile di questa procedura, e richiede esercitazione su larve di zebrafish. Anche la microscopia confocale può risultare impegnativa poiché le larve necessitano di un'adeguata ing.Dopo le iniezioni, trasferire ogni larva infetta singolarmente in una pozzetta di una piastra a 24 pozzette contenente un millilitro di mezzo E due. Incubare la piastra a 28 gradi Celsius e monitorare gli embrioni quotidianamente. Per visualizzare il reclutamento di settina e marcatori dell'autofagia.Iniettare Ella in siti localizzati come il muscolo della coda. Prepararsi a iniettare le larve come mostrato nella sezione precedente. Posizionare il pesce zebra in posizione laterale e posizionare l'ago sopra il muscolo.I somiti quindi perforano lo spazio tra due somiti e iniettano circa un nanolitro di Ella. Un'iniezione riuscita nei muscoli della coda mostrerà che il somite iniettato si colora di rosso. A causa del tampone rosso fenolo, è stato preparato agarosio allo 0,1% a basso punto di fusione in mezzo E due a 37 gradi Celsius.Aggiungere gocce di agarro a una piastra con fondo in vetro singolarmente. Trasferire le larve iniettate con un volume minimo di soluzione sulle gocce di agarro. Orientarle come desiderato e lasciare solidificare l'agarro.Successivamente, coprire l'intera piastra con LMA seguito da E due con trica. Poi somministrare Zacks ogni due minuti per diverse ore. In colture cellulari di tessuto infetto, shaila fuoriesce dal fagosoma nel citosol, dove il citoscheletro dell'ospite può riorganizzarsi e compartimentalizzare i batteri all'interno di strutture simili a gabbie di settina.I batteri intrappolati nelle gabbie di settina vengono riconosciuti da marcatori dell'autofagia come p62 e LC3. Il pesce zebra rappresenta un nuovo ospite prezioso per lo studio in vivo dell'infezione da CHA. A seconda della dose infettiva, il pesce zebra può eliminare l'infezione a bassa dose entro 48 ore dal contagio, oppure, nel caso di una dose elevata, soccombere all'infezione.La trasparenza ottica del pesce zebra RV consente la visualizzazione in vivo delle gabbie di settina, un risultato che non è stato ottenuto utilizzando altri modelli vertebrati, a integrazione delle evidenze secondo cui le gabbie di settina intrappolano batteri destinati all'autofagia. Pesci zebra transgenici GFP-LC3 sono stati infettati per osservare in tempo reale il reclutamento di autofagosomi positivi per LC3 attorno a *Chai* intracellulari al fine di caratterizzare l'autofagia. Larve trattate con morpholino sono state iniettate con *chala* come controllo. Le larve trattate con morpholino hanno mostrato strutture normali delle gabbie di settina.Tuttavia, nelle larve trattate con P 62, il reclutamento della settina alla chala era ridotto, indicando che P 62 è un componente essenziale del meccanismo di autofagia. Una volta controllata l'infezione, la larva PHI può essere eseguita in uno o due giorni se il procedimento viene effettuato correttamente seguendo questa procedura. Altri metodi, come la modifica del genoma mediante il sistema CRISPR/Cas, possono essere utilizzati per manipolare il genoma del pesce zebra. Inoltre, la generazione di nuove linee di pesci zebra fluorescenti mirate può essere progettata per seguire in tempo reale la dinamica dell'autofagia e del citoscheletro durante l'infezione da gel mediante imaging in vivo dopo la sua scoperta.La gabbia di settina di Chaga è stata utilizzata per studiare le interazioni tra autofagia e citoscheletro e ha aperto la strada ai ricercatori nel campo dell'infettivologia e della biologia cellulare per chiarire nuovi ruoli del citoscheletro nell'autofagia. Non dimenticare che lavorare con Ella può essere estremamente pericoloso e che precauzioni, come operare in un ambiente di laboratorio di livello due, devono sempre essere adottate durante l'esecuzione di questa procedura.

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Immunology and Infection

Immunologia e Infezioni

L'autofagia è un processo onnipresente che permette alle cellule di degradare e riciclare le proteine ​​e organelli. Applichiamo la microscopia a fluorescenza avanzata per visualizzare e quantificare il piccolo, ma, cambiamenti fisici essenziali connessi con l'induzione di autofagia, tra cui la formazione e la distribuzione di autophagosomes e lisosomi, e la loro fusione in autolysosomes.

Analisi quantitativa di autofagia usando 3D avanzato microscopia a fluorescenza

Si descrive un metodo per l'inseguimento della rottura endomembrane suscitato dai batteri...

Misure singole cellule di Rottura Vacuolar causate da patogeni intracellulari

Time-lapse microscopia di marcatori autofagia fluorescente permette il monitoraggio della risposta autofagia dinamica con alta risoluzione temporale. Utilizzando l'autofagia specifico e marcatori di organelli in una combinazione di 3 colori diversi, siamo in grado di seguire il contributo di una proteina di formazione dell'autofagosoma in un contesto spaziale e temporale robusto.

Imaging cellulare dal vivo dei primi autofagia Eventi: Omegasomes e oltre

Sepsi sperimentale può essere indotta in topi usando la legatura del cieco e puntura metodo (CLP). Attuali protocolli per valutare autofagia in vivo nel contesto della sepsi CLP-indotta sono presentati qui: Un protocollo per misurare autofagia utilizzando topi (GFP)-LC3, e un protocollo per misurare formazione dell'autofagosoma mediante microscopia elettronica.

Cecal legatura e la puntura indotta da sepsi come modello per studiare autofagia nei topi

Presentato qui sono due tecniche di ricerca di interazione proteina-proteina anticorpo-basato: immunofluorescenza e immunoprecipitazione. Queste tecniche sono adatte per lo studio delle interazioni fisiche tra le proteine per la scoperta di nuovi componenti delle vie di segnalazione cellulare e per la dinamica di proteina di comprensione.<br...

Studio delle interazioni proteina-proteina nella ricerca di autofagia

Qui, presentiamo protocolli per visualizzare le risposte di calcio (Ca2 +) indotte dalle cellule HeLa infettate da Shigella. Ottimizzando i parametri di infezione batterica e di imaging con sonde Ca2 + fluorescenti, atipico globali e locali Ca2 + segnali indotti da batteri sopra una vasta gamma di cinetica di infezione sono caratterizzati.

Ca2 + risposte di imaging durante l'infezione delle cellule epiteliali Shigella

Presentiamo un protocollo per studiare la distribuzione di mitocondri e reticolo endoplasmico in intere cellule dopo la modificazione genetica utilizzando la microscopia elettronica di luce e volume correlata, tra cui l'ascorbate perossidasi 2 e la colorazione della perossidia di rafano, sezionamento seriale di cellule con e senza il gene bersaglio nella stessa sezione e imaging seriale tramite microscopia elettronica.

Mitocondri e reticulum imaging endoplasmico di microscopia elettronica di luce correlata e volume

È stato presentato un protocollo per l'imaging dei microtubuli dinamici in vivo utilizzando una proteina legante finale etichettata fluorescentemente. Abbiamo descritto i metodi per etichettare, immaginare e analizzare i microtubuli dinamici nel neurone del microtubulo laterale posteriore (PLM) di C. elegans.

In vivo Valutazione della dinamica e dell'orientamento dei microtubuli nei neuroni della caenorhabditis elegans

Qui, presentiamo un protocollo per la microscopia elettronico-leggera correlativa ottimizzata in sezione basata sulla marcatura endogena e fluorescente come strumento per studiare la localizzazione di proteine rare in relazione all'ultrastruttura cellulare. La potenza di questo approccio è dimostrata dalla localizzazione ultrastrutturale di LC3 endogena in cellule affamate senza trattamento con bafilomicina.

Localizzazione ultrastrutturale di LC3 endogena mediante microscopia elettronico-ottica correlativa in sezione

Il presente protocollo descrive saggi di infezione per interrogare l'aderenza, l'invasione e la replicazione intracellulare di Shigella utilizzando linee cellulari epiteliali in vitro .

Analisi delle infezioni delle cellule epiteliali con Shigella

Questo protocollo descrive un meccanismo per l'utilizzo della microscopia ottica ed elettronica correlativa per visualizzare l'interazione di mitocondri e lisosomi marcati rispettivamente con mEosEM e APEX2.

Microscopia correlativa a luce ed elettronica a due colori per la visualizzazione delle interazioni tra mitocondri e lisosomi

Esplora le interazioni autofagia-citoscheletro durante l'infezione da Shigella flexneri utilizzando cellule HeLa e larve di zebrafish. Questo metodo permette di studiare i meccanismi di restrizione batterica attraverso le gabbie di septina e i marcatori autofagici come p62 e LC3 in tempo reale.

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