Name: Preparazione di montaggio schermo per losservazione e lanalisi di zebrafish campioni macchiato da Whole Monte In situ Ibridazione (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-07-17T16:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 36 s
Description: Impara a preparare montaggi piatti di embrioni di zebrafish colorati con WISH per migliorare la visualizzazione delle strutture embrionali. Questa tecnica rimuove il vitello per ottenere immagini dorsali chiare e facilita lo studio dell'organogenesi.

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Questo lavoro è stato in parte sostenuto da un finanziamento a RAW da ciascuno dei seguenti: sovvenzioni NIH K01 DK083512, DP2 OD008470 e R01 DK100237; March of Dimes Basil O&#39;Connor Starter Scholar concessione di una sovvenzione # 5-FY12-75; avvio di fondi presso l&#39;Università di Notre Dame College of Science e del Dipartimento di Scienze Biologiche. Vorremmo in particolare ringraziare Elizabeth e Michael Gallagher, insieme con tutta la famiglia Gallagher, che ha impartito un dono generoso alla University of Notre Dame di promuovere ricerca sulle cellule staminali. I finanziatori hanno avuto alcun ruolo nel disegno dello studio, la raccolta e l&#39;analisi dei dati, la decisione di pubblicare, o preparazione del manoscritto. Ringraziamo il personale del Dipartimento di Scienze Biologiche per il loro supporto, e il Centro per la Ricerca Zebrafish a Notre Dame per la loro straordinaria dedizione nella cura e nel benessere della nostra colonia zebrafish. Infine, ringraziamo i membri del nostro laboratorio di ricerca per i loro commenti, discussioni e approfondimenti su questo lavoro, comecosì come Marigold (Maripooka) e Zinnia Wingert per fornire naturalmente capannone baffi felini per rendere più eccellenti strumenti sferza per la nostra ricerca.

<ol><li>Laale, H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+biology+and+use+of+zebrafish%2C+Brachydanio+rerio+in+fisheries+research.+A+literature+review%5BTitle%5D)+AND+%22J+Fish+Biol%22%5BJournal%5D)">The biology and use of zebrafish, Brachydanio rerio in fisheries research. A literature review.</a> J Fish Biol. 10, 121-173 (1977).</li>
<li>Lieschke, G. J., Currie, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Animal+models+of+human+disease%3A+zebrafish+swim+into+view%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">Animal models of human disease: zebrafish swim into view.</a> Nat Rev Genet. 8, 353-367 (2007).</li>
<li>Goldsmith, J. R., Jobin, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Think+small%3A+zebrafish+as+a+model+system+of+human+pathology%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomed+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Think small: zebrafish as a model system of human pathology.</a> J Biomed Biotechnol. 2012, (2012).</li>
<li>Howe, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+zebrafish+reference+genome+sequence+and+its+relationship+to+the+human+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The zebrafish reference genome sequence and its relationship to the human genome.</a> Nature. 496, 498-503 (2013).</li>
<li>Drummond, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kidney+development+and+disease+in+the+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Soc+Nephrol%22%5BJournal%5D)">Kidney development and disease in the zebrafish.</a> J Am Soc Nephrol. 16, 299-304 (2005).</li>
<li>Wingert, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cdx+genes+and+retinoic+acid+control+the+positioning+and+segmentation+of+the+zebrafish+pronephros%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet+3%22%5BJournal%5D)">The cdx genes and retinoic acid control the positioning and segmentation of the zebrafish pronephros.</a> PLoS Genet 3. , (1922).</li>
<li>Wingert, R. A., Davidson, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+nephrogenesis+involves+dynamic+spatiotemporal+expression+changes+in+renal+progenitors+and+essential+signals+form+retinoic+acid+and+irx3b%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Dyn%22%5BJournal%5D)">Zebrafish nephrogenesis involves dynamic spatiotemporal expression changes in renal progenitors and essential signals form retinoic acid and irx3b.</a> Dev Dyn. 240, 2011-2027 (2011).</li>
<li>Santoriello, C., Zon, L. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hooked%21+Modeling+human+disease+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Hooked! Modeling human disease in zebrafish.</a> J Clin Invest. 122, 2337-2343 (2012).</li>
<li>Tamplin, O. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small+molecule+screening+in+zebrafish%3A+swimming+in+potential+drug+therapies%5BTitle%5D)+AND+%22WIREs+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Small molecule screening in zebrafish: swimming in potential drug therapies.</a> WIREs Dev Biol. 1, 459-468 (2012).</li>
<li>Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWesterfield%2C+M+%22The+Zebrafish+Book.+3rd+ed%22">The Zebrafish Book. 3rd ed</a>. , University of Oregon Press. Eugene. (2000).</li>
<li>Kimmel, C. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stages+of+embryonic+development+of+the+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Dyn%22%5BJournal%5D)">Stages of embryonic development of the zebrafish.</a> Dev Dyn. 203, 253-310 (1995).</li>
<li>Thisse, C., Thisse, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+in+situ+hybridization+to+whole-mount+zebrafish+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">High-resolution in situ hybridization to whole-mount zebrafish embryos.</a> Nat Protoc. 3, 59-69 (2008).</li>
<li>Moens, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole+mount+RNA+in+situ+hybridization+on+zebrafish+embryos%3A+probe+synthesis%5BTitle%5D)+AND+%22CSH+Protoc.+3%2C+DOI%3A+10.1101%2Fpdb.prot5036%22%5BJournal%5D)">Whole mount RNA in situ hybridization on zebrafish embryos: probe synthesis.</a> CSH Protoc. 3, DOI: 10.1101/pdb.prot5036. , (2008).</li>
<li>Moens, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole+mount+RNA+in+situ+hybridization+on+zebrafish+embryos%3A+hybridization%5BTitle%5D)+AND+%22CSH+Protoc.+3%2C+DOI%3A+10.1101%2Fpdb.prot5037%22%5BJournal%5D)">Whole mount RNA in situ hybridization on zebrafish embryos: hybridization.</a> CSH Protoc. 3, DOI: 10.1101/pdb.prot5037. , (2008).</li>
<li>Moens, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole+mount+RNA+in+situ+hybridization+on+zebrafish+embryos%3A+mounting%5BTitle%5D)+AND+%22CSH+Protoc.+3%2C+DOI%3A+10.1101%2Fpdb.prot5038%22%5BJournal%5D)">Whole mount RNA in situ hybridization on zebrafish embryos: mounting.</a> CSH Protoc. 3, DOI: 10.1101/pdb.prot5038. , (2008).</li>
<li>Machluf, Y., Levkowitz, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+of+mRNA+expression+in+the+zebrafish+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Visualization of mRNA expression in the zebrafish embryo.</a> Methods Mol Biol. 714, 83-102 (2011).</li>
<li>Brend, T., Holley, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+whole+mount+high-resolution+double+fluorescent+in+situ+hybridization%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Zebrafish whole mount high-resolution double fluorescent in situ hybridization.</a> J Vis Exp. 25 (25), (2009).</li>
<li>Lauter, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-color+fluorescent+in+situ+hybridization+in+the+embryonic+zebrafish+brain+using+differential+detection+systems%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Two-color fluorescent in situ hybridization in the embryonic zebrafish brain using differential detection systems.</a> BMC Dev Biol. 11 (43), 1-11 (2011).</li>
<li>Lauter, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multicolor+fluorescent+in+situ+hybridization+to+define+abutting+and+overlapping+gene+expression+in+the+embryonic+zebrafish+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Neural+Dev%22%5BJournal%5D)">Multicolor fluorescent in situ hybridization to define abutting and overlapping gene expression in the embryonic zebrafish brain.</a> Neural Dev. 6 (10), 1-13 (2011).</li>
<li>Lagendijk, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Revealing+details%3A+whole+mount+microRNA+in+situ+hybridization+protocol+for+zebrafish+embryos+and+adult+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Biol+Open%22%5BJournal%5D)">Revealing details: whole mount microRNA in situ hybridization protocol for zebrafish embryos and adult tissues.</a> Biol Open. 1, 566-569 (2012).</li>
<li>Haffter, P., Nüsslein-Volhard, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large+scale+genetics+in+a+small+vertebrate%2C+the+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Large scale genetics in a small vertebrate, the zebrafish.</a> Int J Dev Biol. 40, 221-227 (1996).</li>
<li>Galloway, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loss+of+Gata1+but+not+Gata2+converts+erythropoiesis+to+myelopoiesis+in+zebrafish+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">Loss of Gata1 but not Gata2 converts erythropoiesis to myelopoiesis in zebrafish embryos.</a> Dev Cell. 8, 109-116 (2005).</li>
<li>Barrallo-Gimeno, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+crest+survival+and+differentiation+in+zebrafish+depends+on+mont+blanc%2Ftfap2a+gene+function%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Neural crest survival and differentiation in zebrafish depends on mont blanc/tfap2a gene function.</a> Development. 131, 1463-1477 (2003).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Zebrafish hanno dimostrato di essere un organismo modello estremamente prezioso per tutta la comunità di ricerca negli ultimi anni. Zebrafish esporre un notevole grado di conservazione genetica con quella dei vertebrati superiori, ed i vantaggi relativi alla loro anatomia, l&#39;allevamento, e il ciclo di vita rendono questa specie molto suscettibili di analisi sperimentali. Inoltre, il progresso delle tecniche molecolari applicabili alla zebrafish ha ulteriormente promosso l&#39;uso di questo organismo modello nella ricerca scientifica. Ad esempio, una grande varietà di linee di zebrafish transgenici sono stati generati per studiare la progressione della malattia e di rispondere a molte domande fondamentali che sono alla base dei meccanismi fondamentali dello sviluppo, tra cui organogenesi. Pertanto, basato sull&#39;uso dinamica di zebrafish sia malattia e ricerca evolutiva, metodologie di etichettatura cella e segnale quantificazione sono un aspetto cruciale di analisi dati. Mentre i metodi che utilizzano un fluorescentetibodies possono essere utilizzati per rilevare l&#39;espressione proteica in zebrafish transgenico, ricercatori tipicamente si basano su procedure standard come WISH 12-16 per esaminare la localizzazione spazio-temporale dei trascritti genici in un campione zebrafish non transgenico fisso. Infatti, WISH è una delle tecniche più utilizzate in biologia 16, ed è uno strumento fondamentale utilizzato per caratterizzare il fenotipo di mutazioni genetiche e perturbazioni genetiche chimici. Tuttavia, WISH è associato a un numero di potenziali insidie ​​e sfide. Per confermare la specificità del ribroprobe antisenso, riboprobes senso possono essere usate come controllo per valutare la specificità di antisenso riboprobe pattern di colorazione. Mentre le sezioni 4 e 5 sono presentati nell&#39;ordine di etichettatura e il rilevamento di una sonda marcata con digossigenina seguita dalla sonda marcato con fluoresceina, questo ordine può essere invertito. In genere, i segnali più deboli (geni con livelli di espressione più bassi) sono meglio rilevate con le sonde digossigenina marcato e questa macchiasviluppato prima con un substrato viola, seguito da rilevamento e colorazione del segnale più forte (gene più abbondantemente espressa) utilizzando il substrato rosso. Tuttavia, se le reazioni a due colori stanno per essere eseguita, si raccomanda di varie combinazioni di etichette e substrati sono testati per trovare la procedura che è più adatto per la raccolta e l&#39;analisi dei dati. Inoltre, i tempi previsti il ​​blocco, l&#39;incubazione degli anticorpi e lavaggio fornite nelle sezioni 4-5 sono su misura per gli embrioni di età inferiore a 24 ore dopo la fecondazione; lunghi intervalli di questi stessi passi con embrioni anziani possono portare a un accumulo di sale sul campione. Suggerimenti per la risoluzione Ampie embrione WISH zebrafish norma sono già stati documentati in letteratura 12-16. Probabilmente il dilemma più comune è elevato background. Si consiglia di aumentare il numero di lavaggi MABT nel passaggio 4,7 a 15-20 lavaggi in caso di necessità, però, nella nostra esperienza l&#39;aggiunta del pernottamento MABT &#39;super-wash&#39;dà ottimi risultati se usato in combinazione con 10 o più brevi lavaggi MABT prima di procedere al passaggio 4.8. Un altro esempio dilemma è scarsa infiltrazione sonda, che può verificarsi con riboprobes lunghe. Tosatura la riboprobe seguente Passo 3.6 tramite idrolisi alcalina può neutralizzare questo. Nella nostra esperienza con i giovani campioni, la sonda taglio non è in genere necessaria. Tuttavia, si dovrebbe tenere a mente che parametri come questo può essere fattori che contribuiscono al risultato di un esperimento WISH, e noi suggerire l&#39;esame di queste istruzioni per la risoluzione dei problemi utili già a disposizione del pubblico nella comunità come necessario per affinare i parametri sperimentali per volontà nel proprio di ricerca 12. Oltre alle tecniche tradizionali WISH 12-16, vi è stato un continuo emergere di progressi nelle metodologie desiderio e protocolli alternativi che sono stati formulati. Questi includono nuovi modi di rilevazione del segnale, ad esempio attraverso l&#39;uso di fluorescenza 17-19, a metodi che consentono la localizzazione dei microRNA 20. Anche così, nonostante i molti miglioramenti che sono stati fatti per i metodi di etichettatura cella corrente, l&#39;efficacia di queste procedure sono negato se la macchia (s) non può essere facilmente visualizzato all&#39;interno del campione di interesse in un punto desiderato. Questa limitazione è problematico per i ricercatori soprattutto quando si riferisce alle prime fasi embrionali di ontogenesi zebrafish, che potrebbe potenzialmente portare a lacune nella nostra comprensione dei vari processi di sviluppo che si presentano in questi periodi. Durante il normale sviluppo zebrafish, il sacco vitellino progressivamente diminuire di dimensioni come le età embrioni 11. Pertanto, in queste fasi di sviluppo successive (&gt; 24 ore dopo la fecondazione), WISH colorazione è abbastanza semplice da analizzare perché l&#39;embrione è più grande rispetto al suo adiacente sacco vitellino. Tuttavia, questo non è il caso dalla fase di gemma coda ai primi somitogenesis (quando l&#39;embrionalemassa è posizionato intorno al tuorlo) dove il sacco vitellino opaco volte può oscurare la visualizzazione della macchia. Di conseguenza, il metodo di montaggio piatto è stato concepito per contribuire ad alleviare i problemi di imaging e di analisi dei dati associati alla caratterizzazione dei campioni iniziali zebrafish (schematizzate in Figura 1 e Figura 2), ed è stato ampiamente utilizzato in quanto la fenotipizzazione sistematica di mutazioni genetiche isolate dai primi larga scala schermi genetici 21. Dal momento che l&#39;avvento della tecnica di montaggio piatta, l&#39;analisi dei primi stadi di sviluppo è stato notevolmente migliorato. Una volta che il tuorlo viene rimosso dall&#39;embrione, è possibile appoggiare la embrione su un vetrino con l&#39;orientamento desiderato per l&#39;imaging. Questa posizione bidimensionale permette di visualizzare l&#39;intero embrione in una volta, che elimina la necessità di ruotare il campione. Numerosi tessuti sono situati in ampi settori dell&#39;embrione, comei precursori che formano il sangue e reni. Inoltre, uno può avere bisogno di confrontare i diversi tessuti in via di sviluppo diversi in una sola volta. Montaggio piatta consente al ricercatore di visualizzare contemporaneamente l&#39;intero dominio di questi gruppi di cellule, e, quindi, può essere di grande aiuto quantificazioni come una misura zona per un tessuto o di cellule conteggi. Questa tecnica ha infine contribuito a portare a molte scoperte riguardanti una serie di importanti meccanismi di sviluppo alla base emopoiesi, neurogenesi e organogenesi. Così, una volta padroneggiato, le applicazioni di questa semplice tecnica per i ricercatori sono abbastanza sostanziali. Ad esempio, in uno studio che analizza scelta lignaggio durante emopoiesi, pianeggiante montare le preparazioni di embrioni di zebrafish nelle fasi somite 14 e 18 (ss) sono stati utilizzati per illustrare i cambiamenti che si sono verificati nel modello di espressione del fattore di trascrizione PU.1 dito di zinco tra wild-type e GATA1 morpholino iniettato embrioni 22.Questo metodo ha permesso la rilevazione di un dominio PU.1 espanso a 18 ss, indicando che GATA1 è più probabile regolazione dell&#39;espressione di PU.1 nella massa cellulare intermedia (ICM) intorno a questo punto di tempo. Embrioni montati forfettaria aggiuntiva colorate per i diversi geni eritroidi tra cui gtpbp1 e epsin dimostrato una perdita di espressione di questi geni in mutanti VLT che erano GATA1 - / -. Ulteriori analisi hanno mostrato alcun cambiamento nell&#39;espressione dei geni erythoid come biklf e testhymin che erano noti per essere indipendente dall&#39;attività gata. Pertanto, in combinazione con altri loro risultati sperimentali, è stato rivelato che GATA1 è essenziale nella regolazione del differenziamento delle cellule all&#39;interno lineage mielo-eritroide. In uno studio di sviluppo della cresta neurale, monta piatti sono stati usati per esaminare l&#39;espressione Crestin in mont blanc (mob M610) mutanti in uno studioesaminando i ruoli di mont blanc e la funzione del gene tfap2a 23. Alle 10 e 20 ss, espressione Crestin è stato interamente abrogato in testa ed era diminuita nella regione del tronco di mob mutanti M610 rispetto al normale espressione wild-type, in ultima analisi aiutare questo gruppo per concludere sull&#39;importanza del Monte Bianco e tfap2a regolamento durante la formazione cresta neurale. Inoltre, in termini di organogenesi, supporti piane hanno permesso la scoperta della presenza di domini distinti nel campo progenitore renale fase iniziale dello sviluppo del rene embrionale zebrafish, noto come i pronephros. L&#39;embrione zebrafish fornisce un sistema conservati e ancora anatomicamente semplice per studiare come progenitori renali provocano le unità funzionali nefrone che compongono i pronephros, un processo noto come nefrogenesi 6,7 (Figura 4). Appartamento analisi montare è stata utile per domini dei documenti di riprogenitori nali e per analizzare l&#39;esito delle variazioni del segnalamento RA durante pronephros patterning 6,7 (Figura 5), che in precedenza era sconosciuto. Presi insieme, questi esempi suggeriscono che ci sono davvero molte applicazioni di massima per questo appartamento montare protocollo nello studio dei diversi processi che si verificano durante il normale sviluppo e gli stati malati. Concettualmente, questa procedura piatto di montaggio è abbastanza semplice nel complesso. Tuttavia, le manipolazioni e il grado di finezza necessarie per padroneggiare questo metodo può essere molto impegnativo da padroneggiare, in assenza di dimostrazione visiva. Pertanto, questo protocollo è stato compilato per consentire ai ricercatori, soprattutto quelli nuovi al modello di zebrafish, con la possibilità di capire meglio come eseguire questa tecnica e condividere i nostri consigli sui reattivi in ​​grado di ottimizzare la gestione dei tessuti. Ci auguriamo che questo protocollo consentirà in ultima analisi altri nella comunità per perfezionare le condizioni del campione più ideale per essere used per il premio di imaging, analisi dei dati e la comunicazione dei loro risultati nelle pubblicazioni. In definitiva, questo dovrebbe consentire ai ricercatori di superare gli ostacoli anatomici del zebrafish durante l&#39;embriogenesi iniziale, che può oscurare la presentazione dei risultati sperimentali, e risolvere questi attraverso l&#39;uso di questa tecnica semplice ma significativo.

Il zebrafish, Danio rerio, è diventata un organismo ampiamente utilizzato nello studio della biologia dello sviluppo. Zebrafish sono un tropicali, specie d&#39;acqua dolce vertebrati appartenenti alla famiglia dei ciprinidi. Zebrafish sono stati inizialmente utilizzati per la ricerca ambientale per ottenere informazioni sui pericoli di potenziali sostanze inquinanti dell&#39;acqua, come erano facilmente reperibili, poco costoso e facile da mantenere 1. Negli ultimi 30 anni, il pesce zebra è stato riconosciuto come un docile geneticamente sistema modello vertebrato per una serie di motivi. Zebrafish mostrano un alto livello di conservazione anatomica e fisiologica con vertebrati superiori inclusi mammiferi 2,3. Recenti sequenza annotazione del genoma ha rivelato che circa il 70% dei geni umani hanno almeno una controparte zebrafish 4. Ad esempio, molti geni ortologhi che svolgono un ruolo importante durante lo sviluppo renale sono state riscontrate tra queste specie 5-7. Questo dramatic grado di conservazione per quanto riguarda la biologia cellulare e molecolare ha permesso ai ricercatori di creare modelli per una vasta gamma di malattie umane in zebrafish 8, e zebrafish sono diventati uno strumento prezioso per identificare potenziali terapie farmacologiche utilizzando schermi genetici chimiche 9. Inoltre, il modello zebrafish è in grado non solo di ricapitolare una serie di complessi processi di sviluppo e stati di malattia che si vedono negli esseri umani, ma diversi attributi aggiuntivi anche aumentare il suo appeal come organismo modello per gli studi embriologici. Zebrafish sono ovipari e si riproducono attraverso la deposizione delle uova di trasmissione, che fornisce ai ricercatori un facile accesso agli embrioni dall&#39;inizio della fecondazione 10. Altri vantaggi includono la dimensione dell&#39;embrione, la trasparenza, e rapido, sviluppo esterno 10. Inoltre, gli adulti di zebrafish possesso di elevata fecondità e di solito producono relativamente grandi dimensioni della covata che può variare tra 200-500a settimana, in ultima analisi, consentendo ai ricercatori di condurre esperimenti di throughput elevato, come ad esempio gli schermi chimici fenotipo based, con facilità 9. Anche così, nonostante la pletora di vantaggi che vengono esposti dal modello zebrafish, ci sono sfide che riguardano l&#39;analisi e la comunicazione dei risultati sperimentali ottenuti da primi stadi di sviluppo. In alcuni casi, l&#39;anatomia intrinseca del zebrafish potrebbe oscurare la visualizzazione dei dati propri. Dopo la fecondazione, la cellula iniziale subisce più eventi scissione progredire dello sviluppo 11. Seguendo gastrulation, l&#39;asse embrionale emerge nella fase tailbud (10 HPF) tale che è avvolto intorno al tuorlo 11. Come successivo sviluppo procede attraverso il periodo di segmentazione, il tronco crescerà in massa e anche allungare da allungamento assiale tale che una coda con una porzione del sacco vitellino si estendono dalla massa tuorlo centrale11. Tra il tailbud e 20 stage somite (19 HPF), i tentativi di osservare le caratteristiche specifiche di sviluppo dopo l&#39;utilizzo di diversi protocolli di colorazione, come WISH, può essere difficile sia per visualizzare e fotografare a causa della geometria dell&#39;embrione e l&#39;opacità del il sacco vitellino. Un modo per eliminare questi problemi è quello di rimuovere il tuorlo e poi appiattire l&#39;embrione in un campione bidimensionale che può essere analizzato in modo più semplice. Le seguenti risorse di protocollo e video, forniscono una guida per come deyolk successo e TV montare un embrione seguente fissazione e colorazione, utilizzando l&#39;esempio di uno o due colori WISH colorazione. WISH è una tecnica largamente usata che consente il rilevamento di specifici acidi nucleici in campioni conservati e permette per il sito (s) di espressione genica da rilevare all&#39;interno dei tessuti così. Tecniche WISH sono state ampiamente descritte, e può essere eseguita con vari substrati colori nonché l&#39;influenzasistemi di rilevamento orescent 12-20. Qui forniamo il nostro protocollo WISH modificato utilizzato per gli embrioni di zebrafish tra le tailbud e segmentazione fasi di sviluppo. Protocolli WISH alternativi, tuttavia, sono compatibili con la procedura di montaggio piatto qui descritto, come rilevato in via preliminare del protocollo di seguito. Inoltre, montaggio piatto potrebbe essere utilizzato in combinazione con qualsiasi numero di tecniche di visualizzazione esistenti, come tutta la immunoistochimica mount, o linea cellulare etichette di monitoraggio, che non sono descritti in questo protocollo. Nel complesso, la tecnica di montaggio flat può consentire una migliore analisi superiore e la presentazione dei dati ottenuti da esperimenti con le prime fasi di sviluppo embrionale in zebrafish.

<table><tbody><tr><td>50 X E3</td><td></td><td></td><td>250 mM NaCl, 8,5 mM KCl, 16,5 mM CaCl2, 16,5 mM MgSO4 in acqua distillata. Integrare con blu di metilene (1 x 10-5 M) (Sigma M9140) per inibire la contaminazione.</td></tr><tr><td>1 X E3</td><td></td><td></td><td>Diluire 50 X E3 in acqua distillata.</td></tr><tr><td>Colino da tè a rete</td><td>English Tea Store</td><td>SKU #ASTR_KEN, MPN#1705</td><td></td></tr><tr><td>Piatto di incubazione embrionale</td><td>Falcon</td><td>35-1005</td><td></td></tr><tr><td>Pipetta di trasferimento</td><td>Samco</td><td>202, 204</td><td></td></tr><tr><td>Provetta per microcentrifuga a fondo piatto</td><td>VWR</td><td>87003-300; 87003-298</td><td></td></tr><tr><td>Fiala di vetro</td><td>Wheaton</td><td>225012</td><td></td></tr><tr><td>1x PBST</td><td></td><td></td><td>Detergente Tween-20 allo 0,1% in 1x PBS, ottenuto diluendo 10x PBS in acqua distillata.</td></tr><tr><td>Tween-20 stock</td><td>American Bioanalytical</td><td>AB02038</td><td></td></tr><tr><td>10x PBS</td><td>American Bioanalytical</td><td>AB11072</td><td></td></tr><tr>Servizi <td>di microscopia elettronica</td><td>con paraformaldeide</td><td>19210</td><td></td></tr><tr><td>4% PFA/1X PBS</td><td></td><td></td><td>Sciogliere il 4% di PFA (p/v) in 1x PBS, portare a ebollizione su una piastra calda in una cappa aspirante. Raffreddare e congelare le aliquote per la conservazione a -20 °C. Scongelare appena prima dell'uso e non ricongelare le scorte.</td></tr><tr><td>Unità di sterilizzazione</td><td>con filtro Corning</td><td>430516</td><td>sistema di filtraggio da 1 L, 0,45 &; m CA</td></tr><tr><td>MeOH</td><td>Sigma</td><td>34860-4L</td><td></td></tr><tr><td>Proteinasi K</td><td>Roche</td><td>03-115-879-001</td><td>Sciogliere in acqua distillata per ottenere la proteinasi K stock (10 mg/ml) e conservare le aliquote a -20 °C.</td></tr><tr><td>HYB+</td><td></td><td></td><td>50% formammide, 5x SSC, 0,1% Tween-20, 5 mg/ml di RNA di torula di lievito, 50 &mu; g/&mu; l</td></tr>. <tr><td>ribosonda marcata con eparina DIG/FLU in vitro reagenti per reazioni di trascrizione</td><td>Roche</td><td>11175025910; 11685619910</td><td>Fare riferimento alle istruzioni del produttore.</td></tr><tr><td>SP6 RNA polimerasi</td><td>Roche</td><td>11487671001</td><td></td></tr><tr><td>T7 RNA polimerasi</td><td>Roche</td><td>10881775001</td><td></td></tr><tr><td>T3 RNA polimerasi</td><td>Roche</td><td>11031171001</td><td></td></tr><tr><td>Inibitore della RNasi 1</td><td>Roche</td><td>3335399001</td><td></td></tr><tr><td>Inibitore della DNasi 1, 10x DNasi 1 tampone</td><td>Roche</td><td>4716728001</td><td></td></tr><tr><td>Glicogeno</td><td>Roche</td><td>10901393001</td><td></td></tr><tr><td>Etanolo (EtOH)</td><td>Sigma</td><td>E7023</td><td>Aliquotare 50 ml di aliquote di 100% EtOH e 70% EtOH (diluito con acqua di grado molecolare) e conservare a -20 °C.</td></tr><tr><td>Acqua distillata di grado molecolare</td><td>Mediatech</td><td>25-055-CM</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Waterbath Thermo 51221073</td><td></td><td>Modello 2831</td></tr><tr><td>Nanodrop</td><td>Thermo</td><td>ND-2000c</td><td></td></tr><tr><td>Formamide</td><td>American Bioanalytical</td><td>AB00600</td><td>Store a -20 &deg;C.</td></tr><tr><td>20x SSC</td><td>American Bioanalytical</td><td>AB13156</td><td></td></tr><tr><td>formula MAB</td><td></td><td></td><td>2 L: in 1,5 L di acqua distillata, miscelare 23,2 g di acido maleico, 17,5 g di NaCl, 55,0 g di base Trisma, quindi aggiungere 8 ml di 1M Tris-HCl pH 9,5 e quindi riempire fino a 2 L. Autoclave.</td></tr><tr><td>MABT</td><td></td><td></td><td>MAB + 0,1</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td>% (v/v) Soluzione di blocco Tween-20 <td>Produciamo in 50 ml di aliquote fresche: 10 ml di BSA (da stock di laboratorio al 10%), 5 ml di FCS (da stock) e 35 ml di MABT. Salva il blocco inutilizzato a 4 gradi C da utilizzare per la soluzione anticorpale. Nota: scongelare le azioni BSA e FCS a 37 gradi C&ndash; Se si scongela a una temperatura più alta diventano un gel denso (non utilizzare).</td></tr><tr><td>FCS (siero fetale di vitello) scorta</td><td>Invitrogen</td><td>16140089</td><td>Aliquot in porzioni da 5 o 10 ml e conservare a -20 °C.</td></tr><tr><td>Stock BSA (albumina sierica bovina)</td><td>American Bioanalytical</td><td>AB00448</td><td>Preparare un brodo al 10% diluito in MAB sciogliendo i fiocchi di BSA a temperatura ambiente con agitazione rapida, quindi conservare 10 ml di aliquote a -20 °C. Conservare i fiocchi di BSA non disciolti a 4 °C.</td></tr><tr><td>Anticorpo anti-digossigenina</td><td>Roche</td><td>11-093-274-910</td><td>Conservare a 4 &deg;C.</td></tr><tr><td>Anticorpo anti-fluoresceina</td><td>Roche</td><td>11-426-338-910</td><td>Conservare a 4 °C.</td></tr><tr><td>piastra di colorazione a 12 pozzetti</td><td>BD-Falcon</td><td>35-3225</td><td></td></tr><tr><td>Tampone</td><td></td><td></td> di precolorazione <td>100 mM Tris pH 9,5, 50 mM MgCl2, 100 mM NaCl, 0,1% (v/v) Tween-20. Prepara sempre fresco: precipiterà nel corso di pochi giorni.</td></tr><tr><td>Soluzione colorante-viola</td><td></td><td></td><td>Per ogni 10 ml necessari: aggiungere 45 &#956; l di NBT e 35 &#956; l di BCIP al tampone di pre-colorazione fresco (non utilizzato su campioni di embrioni).</td></tr><tr><td>Soluzione colorante-rosso</td><td></td><td></td><td>Per ogni 10 ml necessari: aggiungere 31,5 &#956; l di INT e 35 &#956; l di BCIP al tampone di pre-colorazione fresco (non utilizzato su campioni di embrioni).</td></tr><tr><td>Azioni NBT</td><td>Sigma</td><td>N6876</td><td>Memorizzato a -20 &deg; C; polvere diluita 50 mg/ml in DMF al 70%, acqua al 30%.</td></tr><tr><td>Magazzino INT</td><td>Sigma</td><td>I8377</td><td>Conservato a -20 &deg; C; polvere diluita 55 mg/ml in DMF al 70%, acqua al 35%.</td></tr><tr><td>Azioni BCIP</td><td>Sigma</td><td>B8503</td><td>Memorizzato a -20 &deg; C; polvere diluita 50 mg/ml in DMF al 100%.</td></tr><tr><td>DMF (dimetilformaldeide)</td><td>American Bioanalytical</td><td>AB00450</td><td></td></tr><tr><td>Glicina</td><td>Sigma</td><td>G8898</td><td>0,1 M glicina, pH 2,2</td></tr><tr><td>Piccola capsula di Petri</td><td>in plastica Corning</td><td>430589, 430588</td><td></td></tr><tr><td>Glicerolo</td><td>Sigma</td><td>G7893</td><td></td></tr><tr><td>Pincipe fine</td><td>Roboz</td><td>RS-1050</td><td>Dumont Pinzette Modello #55</td></tr><tr><td>Strumento</td><td></td> per ciglia<td></td><td>Costruito applicando una ciglia adatta a un puntale per pipetta (possono essere utilizzate dimensioni comprese tra P10 e P1000) utilizzando la supercolla. Usiamo ciglia umane naturalmente perse, baffi di animali o peli di pelliccia ispidi o ciglia naturali o sintetiche acquistate dal reparto estetico di una farmacia o di un negozio al dettaglio (le ciglia extra lunghe sono più suscettibili di un montaggio stabile sulla punta della pipetta). Il puntale della pipetta è fissato su un'asta diritta (8-10 cm di lunghezza) come un portaaghi (ad es, Fisher 08-965-A) per una facile manipolazione. Vedi Figura 3 per le immagini di questi strumenti fatti in casa.</td></tr><tr><td>Vetrino</td><td>Thermo-Fisher</td><td>4445</td><td>Bianco Frost</td></tr><tr><td>Vetrino coprioggetti</td><td>Thermo-Fisher</td><td>12-540A</td><td>18 x 18 mm</td></tr><tr><td>Argilla da modellare</td><td>Hasbro</td><td>Playdoh</td><td>Altri prodotti artigianali in argilla da modellare possono essere sostituiti.</td></tr><tr><td>Supporto per vetrini</td><td>Thermo-Fisher</td><td>12-587-10</td><td>Vassoio in cartone per riporre i vetrini in piano.</td></tr><tr><td>Stereomicroscopio</td><td>Nikon</td><td>SMZ645, SMZ1000</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio composto</td><td>Nikon</td><td>80i, 90i</td><td></td></tr></tbody></table>

preparazione di montaggio schermo per l&#39;osservazione e l&#39;analisi di zebrafish campioni macchiato da whole monte<em&gt; in situ</em&gt; ibridazione

Flat Mount Preparation for Observation and Analysis of Zebrafish Embryo Specimens Stained by Whole Mount In situ Hybridization

L&#39;embrione zebrafish è oggi comunemente utilizzato per la ricerca di base e biomedica per studiare il controllo genetico dei processi di sviluppo e di modellare anomalie congenite. Durante il primo giorno di vita, l&#39;embrione di zebrafish progredisce attraverso molte fasi di sviluppo, tra cui la fecondazione, segmentazione, gastrulazione, la segmentazione, e l&#39;organogenesi di strutture come il rene, cuore e sistema nervoso centrale. L&#39;anatomia di un giovane embrione di zebrafish presenta diverse sfide per la visualizzazione e l&#39;analisi dei tessuti coinvolti in molti di questi eventi, perché l&#39;embrione si sviluppa in associazione con una massa tuorlo round. Così, per l&#39;analisi accurata e di imaging di fenotipi sperimentali in campioni embrionali fissi tra il tailbud e 20 somiti stadio (10 e 19 ore dopo la fecondazione (HPF), rispettivamente), come quelli colorati con tutta montare ibridazione in situ (WISH), essa è spesso desiderabile rimuovere l&#39;embrione dal tuorlo besaurito e posizionarlo piatto su un vetrino. Tuttavia, l&#39;esecuzione di una procedura piatto di montaggio può essere noioso. Pertanto, efficace ed efficiente piano di montaggio preparazione è notevolmente facilitata attraverso la dimostrazione visiva della tecnica dissezione, e anche aiutato da utilizzando reagenti che aiutano nella gestione ottimale dei tessuti. Qui, forniamo il nostro protocollo augurio per il rilevamento di uno o due colori dell&#39;espressione genica nell&#39;embrione zebrafish, e dimostrare come la procedura di montaggio piatta può essere eseguita su questo esempio di un campione fisso colorato. Questo protocollo di montaggio piatta è ampiamente applicabile allo studio di molte strutture embrionali che emergono durante primo sviluppo zebrafish, e può essere implementata in combinazione con altri metodi di colorazione eseguite su campioni embrionali fissi.

La procedura di montaggio piatta protocollo comporta la trasformazione di zebrafish dalla sua anatomia normale, in cui l&#39;asse del corpo è avvolto intorno ad un pallone tuorlo in posizione centrale, in una bidimensionale preparazione (Figura 1A). Montare tutto l&#39;imaging del giovane zebrafish è limitata dalla natura di come l&#39;asse embrionale è avvolto intorno al tuorlo. Come risultato, viste laterali o dorsali intero monte esemplari embrionali colorata possono acquisire solo una parte dell&#39;asse o tessuti particolari oscuri (Figura 1B). In confronto, deyolking e appiattimento dell&#39;embrione consente all&#39;intera asse embrionale da visualizzare contemporaneamente (Figura 1B). Queste limitazioni sono dimostrate esaminando un desiderio embrione macchiato che è stato etichettato con riboprobes antisenso per rilevare irx3b (viola), che segna un sottoinsieme dei progenitori renali adiacenti ai metameri 7 a 13, e myod1 (rosso), che etichetta ilsomiti (figura 1b). Il campo di irx3b + progenitori renali è oscurata in tutto il monte vista laterale perché trascrizioni irx3b sono abbondanti nel sistema nervoso centrale, rendendo il campo renale praticamente impossibile da visualizzare con l&#39;angolazione laterale; Inoltre, il campo di irx3b + progenitori renali è solo parzialmente visibile quando l&#39;embrione viene ruotato in una telecamera dorsale perché il campo è avvolto intorno al tuorlo (Figura 1B). Tuttavia, una vista dorsale dello stesso embrione seguente montaggio piatta consente l&#39;intero campo di irx3b + progenitori renali da analizzare in modo semplice rispetto ai somiti lungo il tronco e altre strutture embrionali (Figura 1B). Così, elaborati domini spaziali possono essere idealmente documentati con questo metodo. Diversi passaggi importanti sono coinvolti nella corretta esecuzione della procedura piatto monte. Per eseguire questa technique, la palla tuorlo deve essere prima staccato dall&#39;embrione corretta (Figura 2A), che può essere fatto con strumenti pregiati come un paio di pinze sottili mentre l&#39;embrione è visualizzato utilizzando uno stereomicroscopio. Dopo la rimozione greggio della palla tuorlo, uno strumento di ciglia multa viene utilizzato per raschiare via granuli di tuorlo che sono rimasti attaccato per l&#39;embrione (Figura 2B). La rimozione dei rimanenti granuli tuorlo contribuisce a facilitare la visualizzazione dei tessuti embrionali. Infine, l&#39;embrione deyolked è manipolato per posizionarlo stabilmente su un vetrino (Figura 2C), che permette l&#39;osservazione e aiuti documentazione del campione utilizzando software di imaging e una telecamera collegata al microscopio. Gli strumenti di ciglia sono dispositivi fatti in casa che possono essere costruiti mediante apposizione di una frustata adatto per un puntale utilizzando colla, che possono essere montati su un manico se lo si desidera (Figura 3A, tavolo Materials). Diversi campioni ciglia possono essere prelevati per produrrelash strumenti con caratteristiche leggermente diverse in termini di lunghezza e cono (Figura 3B), che ogni utente può avere diverse predilezioni per una volta che iniziano a sperimentare la procedura di piano di montaggio. Esempi di campioni ciglia sono naturalmente capannone ciglia umani, naturalmente capannone capelli o baffi ispidi animali, e, infine, di varietà sintetiche di ciglia disponibili in commercio trovati nei reparti di vendita al dettaglio di cosmetici. La zona circostante e contenente il campione (s) posizionato su un (Figura 4A) vetrino può essere ripreso per l&#39;analisi ad alta risoluzione. Una combinazione di sonde sono stati usati per etichettare i progenitori renali in via di sviluppo che danno origine al rene nel tipo di embrione selvaggio nelle prime fasi di sviluppo con due colori WISH, e poi pianeggiante montare i preparativi sono stati effettuati per visualizzare i campioni (figura 4B, 4C ). Durante le fasi iniziali somite, progenitori renali sono delimitate in un modello a forma di U da Th.EIR espressione dei trascritti (viola) pax2a circondano il mesoderma parassiale che esprime in concomitanza delta C (DLC) (red) (colonna di sinistra, Figura 4B) 6,7. In confronto, quando trascritti DLC sono stati rilevati con un substrato viola, e sono stati etichettati in combinazione con il Krox20 marcatore hindbrain (rosso), un sottodominio rostrale dei progenitori renali è stata visualizzata che esprime DLC (colonna destra, Figura 4B), come osservato in precedenza 6,7. Montare preparati piatti possono essere utilizzati in modo simile a studiare somitogenesis fasi successive. Nella fase somite 14, abbiamo analizzato l&#39;espressione di marcatori renali pax2a, slc4a4, e SLC12A3 (viola) con smyhc1 (rosso), che segna i somiti (Figura 4C). Queste combinazioni consentono la mappatura dell&#39;intero dominio progenitore renale con pax2a, mentre rivela che un sottogruppo di cellule in un sottodominio expr rostraleessed slc4a4a e si distinguevano per una caudale sottodominio non sovrapposizione dei progenitori renali che hanno espresso SLC12A3. WISH due colori e la preparazione montare piatto sono anche utili per lo studio dei domini cellulari durante l&#39;organogenesi in zebrafish con mutazioni genetiche o altre perturbazioni della esposizione ambientale a piccole molecole 6,7 (Figura 5). NLS zebrafish e mutanti lib presentano mutazioni in aldeide deidrogenasi 1a2 (aldh1a2, precedentemente noto come raldh2), che codifica un enzima necessario per la biosintesi dell&#39;acido retinoico (RA). RA è essenziale per il corretto sviluppo di molti tipi di cellule renali tra cui la formazione di cellule podociti che contribuiscono a rendere il filtro sangue del rene embrionale, noto come glomerulo 6,7. WISH è stato eseguito per etichettare i progenitori podociti con wt1a in concomitanza con la delimitazione delle tha lo sviluppo di somiti con smyhc1 e hindbrain con Krox20 in embrioni di tipo selvatico, NLS embrioni mutanti, embrioni lib mutanti, e gli embrioni trattati con un inibitore chimico ALDH, DEAB (Figura 5). Embrioni con l&#39;espressione aldh1a2 carente mostrato espressione wt1a ridotto rispetto al tipo di embrioni selvatici, mentre gli embrioni DEAB-trattati hanno mostrato una abrogazione delle trascrizioni wt1a (Figura 5, colonna di destra). Presi insieme, questi risultati rappresentativi dimostrano come la tecnica del piatto supporto può essere utilizzato per analizzare e documentare le differenze anatomiche con precisione in embrione, e quindi essere implementato per studi di sviluppo importanti. <img alt="Figura 1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51604/51604fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51604/51604fig1.jpg" /> Figura 1. Panoramica del montaggio preparazione piattarazione per gli embrioni di zebrafish. A) La procedura di montaggio piatta permette la visione simultanea dei tessuti lungo l&#39;asse embrionale perché la massa tuorlo centrale viene rimosso e l&#39;embrione stabilmente posizionato su una superficie piana. B) Immagini di un intero monte WISH embrione tinto in viste laterali e dorsali, e poi, dopo una preparazione piatto di montaggio è stata condotta. L&#39;embrione è stato colorato con sonde antisenso per rilevare trascritti del gene che codifica per irx3b (viola) e myod1 (rosso). <img alt="Figura 2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51604/51604fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51604/51604fig2.jpg" /> Figura 2. Schema della procedura di montaggio appartamento in embrioni di zebrafish. A) L&#39;embrione viene prima grossolanamente deyolked per rimuovere la maggior parte della massa tuorlo, poi (B) la superficie ventrale è finemente deyolked per rimuovere i rimanenti granuli tuorlo, edopo aver lavato l&#39;embrione è (C) montato lato dorsale su un vetrino per l&#39;analisi visiva e / o dell&#39;immagine fotografica. <img alt="Figura 3" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51604/51604fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51604/51604fig3.jpg" /> Figura 3. Fotografie di esempio strumenti di ciglia rispetto a pinza sottile. A) strumenti sferza fatti in casa sono stati ripresi insieme a un paio di serie di una pinza sottile, posizionato accanto a un righello metrico per fornire un riferimento. B) Visualizzazione ingrandita della sferza strumenti accanto alle belle pinze, con il riferimento millimetrica prevista lungo la parte superiore della vista . Due diversi strumenti di ciglia vengono mostrati, con l&#39;asterisco (*) utilizzato per contrassegnare la sferza ottenuto da un capannone naturalmente ciglio umano, e doppio asterisco (**) utilizzato per contrassegnare una frustata che è stato ottenuto da un capannone naturalmente felino baffo e tagliata per fare una fine un po &#39;ottuso. In ogni case, la sferza è stato infilato attraverso la punta della pipetta e apposto con vari strati di colla per creare progressivamente una forte tenuta per stabilizzare / ancorare la sferza alla pipetta collegato a un dispositivo di movimentazione. <img alt="Figura 4" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51604/51604fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51604/51604fig4.jpg" /> Figura 4. Caratterizzazione dei cambiamenti evolutivi in campo progenitore renale nel wild type embrione di zebrafish. A) Far scorrere schematica che indica l&#39;area ripreso per analisi in (B, C). B) tipo selvatico embrioni a 1, 3, e 5 somiti fase erano macchiati da due colori WISH per valutare la composizione del campo progenitore renale che dà salire al rene embrionale, o pronephros. (Colonna a sinistra) trascrizioni di codifica il fattore di trascrizione pax2a (tinto in viola) segnano diverse popolazioni nell&#39;embrione, tra cui il p renalecampo rogenitor che emerge dal mesoderma intermedio. Trascrizioni di codifica Notch legante dlc segnano i somiti che si formano dal mesoderma parassiale (tinto in rosso). (Colonna di destra) Quando l&#39;espressione di trascritti DLC (colorati in viola) e hindbrain rhombomere marcatore Krox20 (tinto in rosso) sono esaminati negli stessi embrioni, espressione dlc può essere osservato in un sottodominio rostrale dei progenitori renali adiacenti ai somites 1-5, che è stato oscurato durante la co-colorazione di DLC con pax2a. C) embrioni di tipo selvatico allo stadio 14 somite erano doppia o tripla tinto con una combinazione di un marcatore renale (viola), il marcatore smyhc1 somite (red) , e il hindbrain rhombomere marcatore Krox20 (anche rosso). (Pannello superiore) In questa fase, le trascrizioni pax2a continuano a delimitare i progenitori renali. (Middle, pannelli inferiori) Nel territorio progenitore renale, un sottodominio rostrale è contrassegnatada slc4a4 e trascritti che codificano SLC12A3 segnare un sottodominio caudale. <img alt="Figura 5" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51604/51604fig5highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51604/51604fig5.jpg" /> Figura 5. L&#39;uso di preparati montati piatti a caratterizzare i fenotipi causati da mutazioni genetiche o perturbazioni genetiche chimici che modulano la biosintesi dell&#39;acido retinoico. WISH Il modello di espressione allo stadio 15 somite di wt1a (viola) e smyhc1/krox20 (rosso) è stato confrontato tra i tipi selvatici e gli embrioni con anomalie in acido retinoico (RA) la produzione a causa di difetti di aldeide deidrogenasi 1a2 (NLS e mutazioni lib) o l&#39;inibizione chimica di retinaldehyde deidrogenasi con dietilaminobenzaldehide (DEAB). La riduzione della produzione di RA in lib è leggermente più grave di nls, taleche gli embrioni lib esprimono leggermente ridotta colorazione delle trascrizioni wt1a di simile in scena nls embrioni mutanti, mentre il trattamento DEAB dei tipi selvatici è associata a completa abrogazione di espressione wt1a.

L&#39;embrione zebrafish è un ottimo modello per la ricerca biologia dello sviluppo. Durante l&#39;embriogenesi, zebrafish sviluppare con una massa tuorlo, che presenta sfide tridimensionali per l&#39;osservazione e l&#39;analisi del campione. Questo protocollo descrive come creare bidimensionali montaggio preparazioni semplici di tutto il monte in situ (WISH) colorati esemplari embrioni di zebrafish.

Preparazione di montaggio schermo per l&#39;osservazione e l&#39;analisi di zebrafish campioni macchiato da Whole Monte<em&gt; In situ</em&gt; Ibridazione

The zebrafish embryo is now commonly used for basic and biomedical research to investigate the genetic control of developmental processes and to model ...

L'obiettivo generale di questa procedura è migliorare la visualizzazione di embrioni di pesce zebra fissati e colorati nei primi stadi di sviluppo. Questo risultato si ottiene innanzitutto colorando l'embrione di pesce zebra mediante ibridazione in situ con sonda marcatrice. Successivamente, si seleziona un embrione per il montaggio piatto ed un'incisione centrale viene praticata nel tuorlo con una pinzetta fine; quindi, si utilizzano strumenti adatti per raschiare delicatamente e rimuovere i granuli residui di tuorlo.Infine, l'embrione viene montato in glicerolo su un vetrino per consentire l'acquisizione di immagini adeguate del campione. In definitiva, il montaggio piatto permette una migliore visualizzazione degli embrioni colorati in vista dorsale, rimuovendo il tuorlo e posizionando l'embrione in una preparazione bidimensionale. Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti, come l'acquisizione di immagini di embrioni integri in stadi di sviluppo più giovani, è che il montaggio piatto elimina la sacca vitellina, consentendo di osservare l'intero embrione.Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nel campo dello sviluppo, ad esempio caratterizzando l'ambito del campo renale pre-gonadico in un embrione. Generalmente, le persone alle prime armi con questa tecnica incontrano difficoltà perché richiede una manipolazione delicata dell'embrione e perché imparare la pressione appropriata necessaria per rimuovere il sacco vitellino può richiedere tempo. A dimostrare questa procedura sarò io, Zoe, e Amanda, che siamo studenti laureate nel laboratorio di Winger.Dopo aver raccolto, fissato e colorato gli embrioni, secondo il protocollo descritto nel testo, selezionare un embrione per il montaggio in piano con una X-P-B-S-T. Trasferire l'embrione in una piastra di Petri di plastica o vetro. Quindi, con la piastra sotto un microscopio stereoscopico, utilizzare pinzette fini per ruotare l'embrione in modo da ottenere una vista laterale in cui siano visibili l'estremità cefalica e caudale.Successivamente, utilizzare pinzette fini per tenere fermo l'embrione e un secondo paio per praticare un'incisione nel tuorlo in una posizione centrale tra la testa e la coda dell'embrione. Quindi, con le pinzette fini, rimuovere il tuorlo dalla cavità della cellula dell'embrione. Utilizzare un X-P-B-S-T per risciacquare il tuorlo residuo dall'embrione, usando una o due gocce di XPBS.Trasferire l'embrione su un vetrino piano. Trascinare l'embrione fino al bordo del buffer in modo che rimanga in posizione piatta contro il vetrino. Mentre si fissa l'embrione, utilizzare uno strumento a pinzetta per raschiare delicatamente la superficie ventrale ed eliminare i granuli di tuorlo.Se la soluzione PBST diventa troppo piena di tuorlo in eccesso o inizia a evaporare, aggiungere una o due gocce fresche e spostare l'embrione in questo tampone fresco. Dopo che il tuorlo &egrave; stato rimosso in modo soddisfacente, trasferire delicatamente l'embrione nuovamente in una piastra di Petri contenente PBST per un ultimo risciacquo. Successivamente, trasferire l'embrione in una piastra di Petri contenente glicerolo al 100% e incubare per cinque minuti.Per montare l'embrione su un vetrino, trasferirlo su un vetrino pulito. Aggiungere una o due gocce di glicerolo al 100% e posizionare l'embrione con il lato ventrale del tuorlo rivolto verso il vetrino. Utilizzando uno strumento a pinzetta, spostare l'embrione verso il bordo della goccia di glicerolo in modo che rimanga in posizione piatta contro il vetrino.Se l'asse embrionale è curvo, utilizzare la pinzetta fine per praticare delicatamente piccole incisioni nel tuorlo residuo al fine di alleviare la tensione, in modo che possa essere posizionato in piano sul vetrino. Posizionare piccole punte di argilla modellabile sui quattro angoli di un coprioggetto di vetro da 18 per 18.Posizionare lentamente il coprioggetto sull'embrione, inclinandolo in modo da ridurre al minimo le bolle d'aria nella glicerolo. Infine, aggiungere un'ulteriore goccia di glicerolo al 100% lungo il bordo del coprioggetto per riempire lo spazio tra il vetrino e prevenire spostamenti; utilizzare un microscopio stereoscopico o un microscopio a luce trasmessa per l'acquisizione dell'immagine mostrata qui. È stata utilizzata una combinazione di sonde insieme a una marcatura a due colori per etichettare i progenitori renali in via di sviluppo che danno origine al rene, e gli embrioni sono stati montati in piano nella fase iniziale.Pertanto, negli stadi di so-mite, i progenitori renali sono delimitati in un modello a forma di U dall'espressione dei trascritti di PAX two A che circondano il mesoderma pariale che esprime contemporaneamente delta C, mostrato in rosso. Quando delta C è stato co-etichettato con C crox 20, è stato rivelato un sottodominio rostrale dei progenitori renali che esprime delta C; analizzando l'espressione di PAX two A, SLC four A four, SLC 12 A three e S-M-Y-H-C one allo stadio di 14 so-mite, è stato possibile mappare l'intero dominio dei progenitori renali mediante PAX two A e si è rivelato che un sottoinsieme di cellule nel sottodominio rostrale esprimeva SLC four A four.che non si sovrapponeva al sottodominio coddle dei progenitori renali che esprimevano SLC12A3. In questa figura, embrioni con mutazioni nel gene Retinolo deidrogenasi 2, necessario per la biosintesi dell'acido retinoico, o embrioni trattati con DEAB, un inibitore della ALDH, si sono sviluppati con espressione ridotta o abolita rispettivamente di WT1A, dimostrando che la tecnica two color WISH con preparazione in whole mount è utile per lo studio dei domini cellulari durante l'organogenesi. In zebrafish con mutazioni genetiche o esposti chimicamente a molecole di piccole dimensioni, una volta padroneggiata, questa tecnica può richiedere da 10 a 15 minuti se eseguita correttamente.Al termine di questa procedura, possono essere eseguiti altri metodi, come l'analisi mediante imaging, per rispondere a ulteriori domande, ad esempio sulla localizzazione dei confini dei segmenti renali. Dopo aver visionato il video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come eseguire un montaggio in piano di un embrione di pesce zebra colorato, al fine di visualizzare meglio le strutture desiderate rimuovendo il tuorlo.

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Montare tutto ibridazione in situ è ​​una delle tecniche più utilizzate in biologia dello sviluppo. Qui, presentiamo una ad alta risoluzione doppio fluorescente in protocollo ibridazione in situ per analizzare il modello preciso espressione di un singolo gene e per determinare la sovrapposizione dei domini di espressione di due geni. Includiamo un propidio ioduro nucleare contro-macchia per evidenziare l'organizzazione dei tessuti.

Zebrafish intero monte ad alta risoluzione doppia fluorescente In Situ Ibridazione

Questo articolo descrive un metodo per montare embrioni vivi di pesce zebra per l'imaging a lungo termine. Questo metodo è economico e facile da eseguire utilizzando le normali piastre di microscopia con fondo di vetro per l'imaging al microscopio invertito. Il montaggio viene eseguito in strati di agarosio a diverse concentrazioni.

Montaggio di agar stratificato: preparazione di embrioni vivi di pesce zebra per l'imaging a lungo termine con un microscopio invertito

Questo video descrive passo dopo passo le istruzioni su come montare embrioni vivi di zebrafish su una piastra a 6 pozzetti utilizzando agarosio a basso punto di fusione. Fornisce inoltre il processo per acquisire immagini di embrioni vivi e analizzarle utilizzando un software.

Montaggio dell'agar: un metodo di base per montare embrioni vivi di pesce zebra per l'imaging a lungo termine

Il pesce zebra, un piccolo pesce tropicale, è diventata un modello importante per studiare la funzione del gene durante lo sviluppo dei vertebrati e la malattia. L'espressione temporale e spaziale dei geni bersaglio può essere...

Alta Risoluzione intero monte<em&gt; In Situ</em&gt; Ibridazione in embrioni di zebrafish per studiare l&#39;espressione genica e la funzione

Processi di sviluppo quali la proliferazione, il modello, la differenziazione, e la guida degli assoni possono essere facilmente modellati nel midollo spinale zebrafish. In questo articolo, si descrive una procedura di montaggio per gli embrioni di zebrafish, che ottimizza la visualizzazione di questi eventi.

Dissezione e laterale Montaggio di embrioni di zebrafish: analisi dello sviluppo del midollo spinale

Lo sviluppo di zebrafish può essere seguita nel giorni con microscopio foglio leggero, quando gli embrioni sono inserite in tubi polimerici otticamente trasparenti con bassa concentrazione di agarosio.

Multistrato di montaggio per lungo termine foglio leggero Microscopia di Zebrafish

Qui, presentiamo un metodo di montaggio versatile che consente l'imaging time-lapse a lungo termine dello sviluppo posteriore del corpo di embrioni vivi di pesce zebra senza perturbare il normale sviluppo.

Un metodo di montaggio versatile per il lungo termine Imaging di sviluppo Zebrafish

Sviluppo di ciglia è vitale per l'organogenesi corretto. Questo protocollo descrive un metodo ottimizzato per etichettare e visualizzare le cellule ciliate di zebrafish.

Visualizzazione di cellule Multiciliated in Zebrafish attraverso un protocollo combinato di tutta Monte fluorescente ibridazione In Situ e immunofluorescenza

Questo articolo descrive un metodo per montare fragili embrioni di pesce zebra per la microscopia confocale time-lapse estesa. Questo metodo a basso costo è facile da eseguire utilizzando normali piatti di microscopia con fondo di vetro per l'imaging su qualsiasi microscopio invertito. Il montaggio viene eseguito in strati di agarose a diverse concentrazioni.

Un metodo di montaggio a strati per la microscopia confocale Time-Lapse estesa di embrioni di pesci zebra interi

Qui presentiamo un protocollo per il rilevamento fluorescente mediato da anticorpi di proteine in interi preparati di embrioni e larve di pesce zebra.

Intero Monte Immunohistochimica in Embrioni e Larve di pesce zebra

Viene descritta una strategia di preparazione del campione per l'imaging di embrioni precoci di zebrafish all'interno di un corion intatto utilizzando un microscopio a foglio luminoso. Analizza i diversi orientamenti che gli embrioni acquisiscono all'interno del corion al 70% degli stadi di epibolia e gemma e descrive in dettaglio le strategie di imaging per ottenere una risoluzione su scala cellulare in tutto l'embrione utilizzando il sistema light-sheet.

Imaging al microscopio a foglio leggero e strategie di montaggio per embrioni precoci di zebrafish

Impara a preparare montaggi piatti di embrioni di zebrafish colorati con WISH per migliorare la visualizzazione delle strutture embrionali. Questa tecnica rimuove il vitello per ottenere immagini dorsali chiare e facilita lo studio dell'organogenesi.

Preparazione di montaggio schermo per losservazione e lanalisi di zebrafish campioni macchiato da Whole Monte In situ Ibridazione (Video) | JoVE Journal

Preparazione di montaggio schermo per l'osservazione e l'analisi di zebrafish campioni macchiato da Whole Monte

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