Preparazione di montaggio schermo per l'osservazione e l'analisi di zebrafish campioni macchiato da Whole Monte In situ Ibridazione

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di visualizzare meglio gli embrioni di pesce zebra fissati colorati nei primi momenti di sviluppo. Ciò si ottiene colorando prima l'embrione di pesce zebra utilizzando l'ibridazione domestica in C due. Successivamente, un embrione viene selezionato per il montaggio piatto e viene praticata un'incisione centrale nel tuorlo con un paio di pinze sottili, quindi gli strumenti per ciglia vengono utilizzati per raschiare delicatamente e rimuovere i granuli di tuorlo rimanenti.

Infine, l'embrione viene montato in glicerolo su un vetrino per consentire l'imaging appropriato del campione. In definitiva, il montaggio piatto consente una migliore visualizzazione degli embrioni colorati da una vista dorsale rimuovendo il tuorlo e posizionando l'embrione in una preparazione bidimensionale. Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti come l'imaging di embrioni intatti nelle fasi di sviluppo più giovani è che il montaggio piatto rimuove il sacco vitellino, consentendo di visualizzare l'intero embrione.

Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo dello sviluppo, come la caratterizzazione del dominio del campo pre-genere renale in un embrione. In generale, le persone che non conoscono questo metodo hanno difficoltà perché questa tecnica richiede una manipolazione delicata dell'embrione e anche perché l'apprendimento della quantità appropriata di pressione necessaria per rimuovere il sacco vitellino può richiedere tempo. A dimostrare questa procedura saremo io, Zoe e Amanda, che siamo studenti laureati nel laboratorio di winger.

Dopo aver raccolto, fissato e colorato gli embrioni, secondo il protocollo di testo, selezionare un embrione per il montaggio piatto con un X-P-B-S-T. Trasferisci l'embrione in una capsula di Petri di plastica o di vetro. Quindi, con la piastra sotto uno stereomicroscopio, utilizzare una pinza fine per arrotolare l'embrione in modo da ottenere una vista laterale con le estremità della testa e della coda visibili.

Successivamente, utilizzare una pinza fine per tenere fermo l'embrione e una seconda serie per praticare un'incisione nel tuorlo in una posizione situata centralmente tra la testa e la coda dell'embrione. Quindi, con una pinza fine, estrarre il tuorlo dalla cavità della cella di quercia. Usa un X-P-B-S-T per sciacquare il tuorlo randagio dall'embrione usando una o due gocce di un XPBS.

Trasferire l'embrione su un vetrino piano. Trascinare l'embrione fino al bordo del tampone in modo che rimanga in posizione piatta contro il vetrino. Durante l'ancoraggio dell'embrione, utilizzare uno strumento per ciglia per raschiare delicatamente la superficie ventrale per rimuovere i granuli di tuorlo.

Se la soluzione PBST si ingombra di tuorlo in eccesso o inizia ad evaporare, aggiungi una o due gocce fresche e trascina l'embrione in questo tampone fresco. Dopo che il tuorlo è stato rimosso in modo soddisfacente, trasferire delicatamente l'embrione in una capsula di Petri di PBST per un risciacquo finale. Quindi trasferire l'embrione in una capsula di Petri contenente glicerolo al 100% e incubare per cinque minuti.

Per montare l'embrione su un vetrino, trasferirlo in un bicchiere pulito. Far scivolare una o due gocce di glicerolo al 100% e posizionarlo con il lato del tuorlo ventrale rivolto verso il vetrino. Usando uno strumento per ciglia, trascina l'embrione sul bordo della goccia di glicerolo in modo che rimanga in posizione piatta contro il vetrino.

Se l'asse embrionale è curvo, usa la pinza sottile per praticare delicatamente piccole incisioni nel tuorlo rimanente per alleviare la tensione in modo che possa essere posizionato in piano. Sulla diapositiva. Posiziona piccoli divot di argilla da modellare sui quattro angoli di un vetrino di vetro 18 per 18.

Posizionare lentamente il vetrino coprioggetti sull'embrione, inclinandolo per ridurre al minimo le bolle d'aria nel glicerolo. Infine, aggiungere un'ulteriore goccia di glicerolo al 100% sul lato del vetrino coprioggetti per riempire lo spazio tra il vetro e per eliminare la deriva, utilizzare un microscopio stereo o composto per l'immagine mostrata qui. È stata utilizzata una combinazione di sonde insieme a due colori per etichettare i progenitori renali in via di sviluppo che danno origine al rene e gli embrioni sono stati montati in piano all'inizio.

Quindi gli stadi degli acari, i progenitori renali sono delimitati in un modello a forma di U dalla loro espressione di PAX due trascritti A che circondano il mesoderma pariale che esprime contemporaneamente delta C mostrato in rosso. Quando il delta C è stato co-marcato con C crox 20, è stato rivelato un sottodominio rostrale dei progenitori renali che esprime il delta C analizzando l'espressione di PAX due a, SLC quattro A quattro, SLC 12 A tre e S-M-Y-H-C uno a 14. Quindi lo stadio dell'acaro consente la mappatura dell'intero dominio progenitore renale con PAX due A e ha rivelato che un sottoinsieme di cellule nel sottodominio rostrale esprimeva SLC quattro A quattro.

Ciò non si sovrapponeva al sottodominio delle coccole dei progenitori renali che esprimevano SLC 12 A tre. In questa figura embrioni con mutazioni nel gene Retin Retinaldehyde dehydrogenasi due necessari per la biosintesi dell'acido retinoico o embrioni trattati con DEAB e inibitori di ALD H sviluppati con espressione ridotta o abrogata rispettivamente di WT uno A, dimostrando che il desiderio a due colori con la preparazione flat mount è prezioso per lo studio dei domini cellulari durante l'organogenesi. Nel pesce zebra con mutazioni genetiche o quando esposto chimicamente a piccole molecole Una volta padroneggiata, questa tecnica può richiedere dai 10 ai 15 minuti se eseguita correttamente.

Dopo questa procedura, è possibile eseguire altri metodi come l'imaging per rispondere a ulteriori domande, come la posizione dei confini dei segmenti renali. Dopo aver visto il video, dovresti avere una buona comprensione di come montare in piano un embrione di pesce zebra macchiato per visualizzare meglio le strutture desiderate dalla rimozione del tuorlo.