Estrazione di Venom Venom e Gland Microdissections da Spiders per proteomica e analisi trascrittomica

L'obiettivo generale di questa procedura è estrarre il veleno e sezionare le ghiandole velenifere dai ragni per studi trascrittomici e proteomici, ciò si ottiene preparando prima l'attrezzatura e i reagenti necessari per raccogliere il veleno mediante stimolazione elettrica. Il secondo passo consiste nell'immobilizzare un ragno anestetizzante con una pinza al microscopio da dissezione. Successivamente, il ragno viene pulsato con corrente e il veleno rilasciato viene raccolto con un micro tubo capillare.

Il passaggio finale consiste nel sezionare le ghiandole velenifere del ragno due o tre giorni dopo. In definitiva, la spettrometria di massa o altre analisi proteomiche del veleno vengono utilizzate per mostrare le sequenze delle proteine costituenti il veleno. La dimostrazione visiva di questo metodo è fondamentale in quanto le fasi di raccolta del veleno sono difficili da apprendere perché comportano una sequenza di azioni coordinate che devono essere eseguite rapidamente, ma con attenzione.

Per iniziare, collegare il cavo di alimentazione di un elettrostimolatore a una presa e collegare il pedale esterno a un ingresso di segnale esterno. Quindi, assicurarsi che l'interruttore di polarità sia in modalità normale e collegare l'elettrodo positivo al terminale di uscita rosso sull'elettrostimolatore e collegare l'elettrodo negativo al terminale di uscita nero. Quindi impostare lo stimolatore sulle seguenti impostazioni iniziali consigliate.

Testare l'uscita dell'elettrodo collegando le clip a coccodrillo ai puntali del voltmetro positivo e negativo. Quindi accendere l'interruttore di alimentazione dello stimolatore ed erogare corrente con il pedale. Preparare la pinza leggera come una piuma rivestendo un polo con plastica liquida e attendere quattro ore affinché il rivestimento si asciughi dopo che la plastica si è asciugata, avvolgere strettamente 15 millimetri della punta del polo opposto AP con un singolo strato di filo per cucire di cotone e fissare il filo legando l'estremità in un nodo.

Successivamente, usando delle forbici affilate, taglia la punta di un ago ipodermico smussato, abbastanza piccolo da non danneggiare il ragno, ma abbastanza grande da evitare l'intasamento. Lisciare l'apertura con carta vetrata e collegare l'ago a un sifone per rifiuti. Quindi posizionare le pinze peso piuma orizzontalmente in una posizione ben chiusa utilizzando un morsetto a due punte rivestito in vinile fissato a una base magnetica sotto il campo visivo di un microscopio da dissezione con il polo rivestito in plastica in alto e il polo rivestito in filo sul fondo.

Quindi, collegare una clip a coccodrillo con elettrodo positivo al polo inferiore a monte del filo e collegare una clip a coccodrillo negativa all'ago a vuoto in metallo smussato. Quindi posizionare l'elettrocatetere positivo sul polo della pinza tra il filo e la clip a coccodrillo e l'elettrocatetere negativo sull'ago smussato per l'aspirapolvere. Per testare la corrente del circuito del voltmetro, premere il pedale per assicurarsi che venga rilevata una corrente sufficiente e rimuovere i cavi indossando occhiali protettivi.

Preparare diversi tubi micro capillari per la raccolta del veleno. Quindi, posizionare una striscia di mastice di montaggio in una capsula di Petri e appoggiare i micro capillari sulla striscia. Con una mano guantata tenere un singolo tubo microcapillare a un'estremità e tenere l'altra estremità con una pinza metallica sterile sopra la fiamma di un bruciatore bunsen e allontanare l'estremità dalla fiamma per creare una punta allungata tenendo l'altra estremità in posizione stazionaria, esaminare le estremità micro capillari al microscopio da dissezione e creare una piccola apertura smussata all'estremità tirata con una pinza metallica sterilizzata.

Chiudere i tubi e metterli sul ghiaccio. Per iniziare l'immobilizzazione del ragno, accendere il gas della camera di CO2. Quindi trasferire il ragno con una lunga pinza metallica dalla fiala di raccolta in plastica chiusa nella camera di CO2.

Tenere il ragno nella camera per cinque-10 minuti e controllare che il ragno non si muova più. Pungolandolo delicatamente con una lunga pinza. Quindi utilizzare una pipetta di trasferimento con soluzione salina per bagnare il filo sulla pinza.

Quindi, recupera il ragno anestetizzato dalla camera di CO2 raccogliendolo per le zampe anteriori. Usando una pinza da dissezione smussata e le mani guantate, sposta il ragno anestetizzato sull'apparecchio della pinza peso piuma. Quindi separare i rebbi delle pinze chiuse e posizionare il thax cefalico dei ragni tra i rebbi.

Lasciare che i rebbi si chiudano per assicurarsi che il ragno sia tenuto saldamente in posizione ma non venga schiacciato Assicurarsi rapidamente che il ragno sia posizionato con il lato dorso del carpace rivolto verso il basso, appoggiato sul polo rivestito con filettatura, e che il lato ventrale dell'auto sia rivolto verso il rivestimento di plastica mentre l'elettrodo positivo rimane attaccato al polo inferiore. Quindi, regolare la messa a fuoco dell'ingrandimento del microscopio da dissezione e la sorgente luminosa fino a quando i ragni e le zanne non sono chiaramente visibili. Per iniziare la raccolta del veleno, accendi l'aspirapolvere e spruzza acqua nella miniera di ragno.

Utilizzando un secondo ago per siringa a punta smussata, aspirare l'acqua con un ago a vuoto per rimuovere le impurità. Quindi, toccare l'ago del vuoto con l'elettrodo negativo sul rostro del ragno e rilasciare un impulso con il pedale. Le zampe del ragno si contrarranno e il veleno sarà visibile sotto forma di goccioline chiare che emergono dalle zanne.

Aspirare, rigurgitare se necessario. Quindi raccogliere le goccioline di veleno con la punta micro capillare e trasferire la punta capillare in un tubo da 0,5 millilitri con acqua, che verrà aspirata nel capillare. Evitare di perforare il ragno con il capillare e di contaminare il capillare con seta e colla dai piedi.

Quindi, collegare la siringa di trasferimento con l'adattatore per tubo al micro capillare all'estremità opposta alla punta di raccolta e dispensare nuovamente la soluzione di veleno nel tubo e posizionare il tubo sul veleno del ghiaccio contenente tubi a meno 80 gradi Celsius. Al termine, al termine della raccolta del veleno, posizionare una fiala di raccolta di plastica aperta insieme al tappo vicino al ragno. Per un trasferimento rapido, afferrare con cura le zampe del ragno con una pinza da dissezione smussata tenuta in una mano e aprire con cura la pinza leggera con l'altra mano.

Quindi far scorrere il ragno nella fiala di raccolta con una pinza smussata. E chiudere rapidamente il tappo due o tre giorni dopo la raccolta del veleno, anestetizzare il ragno in una camera di CO2, quindi riempire un vettore di azoto liquido e posizionarlo accanto a un microscopio da dissezione. Pulire l'area di dissezione e la pinza con l'RNA.

Quindi riempire una piccola capsula di Petri con un citrato di sodio salino e posizionarla sotto il microscopio da dissezione. Quindi, trasferisci il ragno dalla camera di CO2 alla capsula di Petri e usa una pinza per separare rapidamente il thax cefalico dall'addome. Quindi tenere il thax cefalico sotto il microscopio da dissezione con una pinza e posizionare la miniera nel campo visivo.

Utilizzare le estremità affilate di un secondo paio di pinze per tagliare lateralmente la cuticola che unisce la carabase agli aspetti laterali della miniera. Afferrare la miniera con il secondo paio di pinze e tirare delicatamente avanti e indietro fino a quando le ghiandole velenifere non vengono estratte. Non ci vogliono più di 15 minuti.

Separare le ghiandole dalla miniera e trasferirle in un tubo criogenico da 0,5 millilitri. Posizionare la provetta chiusa in azoto liquido, integrando tecniche di spettrometria di massa con database di sequenze generati dalla ghiandola velenifera CD NA. Le librerie hanno permesso l'identificazione delle proteine del veleno. Il peptide laro inetto era una delle 36 proteine identificate dal veleno della vedova nera utilizzando la spettrometria di massa.

Non dimenticare che lavorare con ragni come le vedove nere può essere estremamente pericoloso e che durante l'esecuzione di questa procedura è necessario prendere sempre precauzioni come indossare guanti protettivi.