Estrazione di Venom Venom e Gland Microdissections da Spiders per proteomica e analisi trascrittomica

L'obiettivo generale di questo procedimento è estrarre il veleno e dissezionare le ghiandole velenifere dai ragni per studi trascrittomici e proteomici; ciò viene realizzato preparando innanzitutto l'equipaggiamento e i reagenti necessari per raccogliere il veleno mediante stimolazione elettrica. Il secondo passaggio consiste nell'immobilizzare un ragno anestetizzato con pinzette sotto un microscopio stereoscopico. Successivamente, il ragno viene sottoposto a impulsi di corrente e il veleno rilasciato viene raccolto con una pipetta capillare.

L'ultimo passaggio consiste nell'isolare le ghiandole velenifere del ragno due o tre giorni dopo. Alla fine, lo spettrometria di massa o altre analisi proteomiche del veleno vengono utilizzate per determinare le sequenze delle proteine costitutive del veleno. La dimostrazione visiva di questo metodo è fondamentale poiché le fasi di raccolta del veleno sono difficili da apprendere, in quanto richiedono una serie di azioni coordinate da eseguire rapidamente, ma con attenzione.

Per iniziare, collegare il cavo di alimentazione di uno stimolatore elettrico a una presa e attaccare il pedale esterno a un ingresso di segnale esterno. Successivamente, assicurarsi che l'interruttore di polarità sia in modalità normale e collegare l'elettrodo positivo al terminale di uscita rosso dello stimolatore elettrico e l'elettrodo negativo al terminale di uscita nero. Quindi impostare lo stimolatore sui seguenti parametri iniziali consigliati.

Verificare l'uscita dell'elettrodo collegando le pinze a coccodrillo ai terminali positivo e negativo del voltmetro. Quindi accendere l'interruttore di alimentazione dello stimolatore ed erogare la corrente mediante la pedana a pedale. Preparare la pinzetta leggerissima rivestendo un rebbio con plastica liquida e attendere quattro ore affinché il rivestimento si asciughi; dopo che la plastica si è asciugata, avvolgere strettamente 15 millimetri della punta del rebbio opposto dell'AP con un singolo strato di filo di cotone da cucito e fissare il filo annodandone l'estremità.

Successivamente, utilizzando forbici affilate, tagliare la punta di un ago ipodermico smussato, di dimensioni sufficientemente piccole da non arrecare danno al ragno, ma abbastanza grandi da evitare intasamenti. Levigare l'apertura con carta vetrata e collegare l'ago a un trappola per vuoto. Quindi posizionare le pinzette leggerissime in posizione orizzontale, tenute saldamente chiuse, mediante una pinza bivalente rivestita in vinile fissata a una base magnetica, all'interno del campo visivo di un microscopio stereoscopico, con la punta rivestita in plastica nella parte superiore e quella rivestita in filo nella parte inferiore.

Successivamente, collegare un morsetto a coccodrillo dell'elettrodo positivo alla punta inferiore a monte del filo, e collegare un morsetto a coccodrillo negativo all'ago metallico smussato della pompa a vuoto. Quindi posizionare il cavo positivo sulla punta della pinzetta, tra il filo e il morsetto a coccodrillo, e il cavo negativo sull'ago smussato della pompa a vuoto. Per verificare la corrente del circuito del voltmetro, premere il pedale a pressione per assicurarsi che venga rilevata una corrente sufficiente, quindi rimuovere i cavi indossando occhiali protettivi.

Preparare diversi tubicini capillari per la raccolta del veleno. Successivamente, posizionare una striscia di pasta adesiva in una piastra di Petri e appoggiarvi sopra i tubicini capillari. Con una mano guantata, afferrare un singolo tubicino capillare da un'estremità e tenere l'altra estremità con pinzette metalliche sterili sopra la fiamma di un becco Bunsen; quindi allontanare lentamente l'estremità dalla fiamma per creare una punta allungata, mantenendo l'altra estremità ferma. Esaminare le estremità dei tubicini capillari al microscopio stereoscopico e creare un piccolo foro smussato all'estremità allungata utilizzando pinzette metalliche sterili.

Chiudere i tubi e metterli sul ghiaccio. Per iniziare l'immobilizzazione del ragno, accendere il gas della camera a CO₂. Successivamente, trasferire il ragno con pinze metalliche lunghe dalla provetta di raccolta chiusa alla camera a CO₂.

Mantenere il ragno nella camera per cinque-dieci minuti e verificare che non si stia più muovendo, spingendolo delicatamente con pinze lunghe. Quindi utilizzare una pipetta di trasferimento con soluzione salina per inumidire il filo sulle pinze.

Successivamente, recuperare il ragno anestetizzato dalla camera a CO2 prendendolo per le zampe anteriori. Utilizzando pinze da dissezione smussate e mani guantate, spostare il ragno anestetizzato sull'apparecchio con pinze leggere. Quindi separare i rebbi delle pinze leggere chiuse e posizionare il torace cefalico del ragno tra i rebbi.

Lasciare che i rebbi si chiudano per assicurarsi che il ragno sia saldamente fermo senza essere schiacciato. Posizionare rapidamente il ragno con il carapace rivolto verso il basso, appoggiato sul rebbio rivestito di filo, in modo che la parte ventrale sia rivolta verso il rivestimento in plastica mentre l'elettrodo positivo rimane attaccato al rebbio inferiore. Successivamente, regolare l'ingrandimento, la messa a fuoco e la sorgente luminosa del microscopio stereoscopico finché cerchi e zanne del ragno non siano chiaramente visibili. Per iniziare il prelievo del veleno, accendere l'aspiratore e spruzzare acqua sulla ghiandola velenifera del ragno.

Utilizzando un secondo ago da siringa con punta smussata, aspirare l'acqua con un ago a vuoto per rimuovere le impurità. Successivamente, toccare l'ago a vuoto, collegato all'elettrodo negativo, con il rostro del ragno ed erogare un impulso tramite il pedale. Le zampe del ragno si contrarranno e il veleno sarà visibile come goccioline trasparenti che fuoriescono dai canini.

Aspirare il rigurgito, se necessario. Quindi raccogliere le gocce di veleno con la punta della micropipetta e trasferire la punta in un tubo da 0,5 millilitri contenente acqua, che verrà aspirata nella micropipetta. Evitare di forare il ragno con la micropipetta e di contaminare la micropipetta con seta e colla provenienti dai filamenti.

Successivamente, collegare la siringa di trasferimento con l'adattatore per tubo al microcapillare all'estremità opposta rispetto alla punta di raccolta ed espellere la soluzione di veleno nuovamente nel tubo; quindi posizionare il tubo sul ghiaccio e conservare i tubi contenenti il veleno a meno 80 gradi Celsius. Al termine della raccolta del veleno, posizionare una provetta di raccolta in plastica aperta insieme al suo tappo vicino al ragno. Per un trasferimento rapido, afferrare con cura le zampe del ragno con pinze anatomiche smussate tenute in una mano e aprire con attenzione le pinze leggere con l'altra mano.

Quindi far scivolare il ragno nel vial di raccolta con pinzette smussate. E chiudere rapidamente il tappo. Due o tre giorni dopo il prelievo del veleno, anestetizzare il ragno in una camera a CO2, quindi riempire un contenitore di azoto liquido e posizionarlo accanto a un microscopio stereoscopico. Pulire l'area di dissezione e le pinzette con RNA away.

Quindi riempire una piccola piastra di Petri con una x saline sodium citrate e posizionarla sotto il microscopio stereoscopico. Successivamente, trasferire il ragno dalla camera a CO2 alla piastra di Petri e utilizzare pinzette per separare rapidamente il torace cefalico dall'addome. Quindi tenere il torace cefalico sotto il microscopio stereoscopico con le pinzette e posizionare la colla nella zona visibile.

Utilizzare le estremità appuntite di una seconda paia di pinzette per tagliare la cuticola che unisce il carapace agli aspetti laterali del collare lateralmente. Afferrare il collare con la seconda paia di pinzette e tirare delicatamente avanti e indietro fino a quando le ghiandole del veleno non vengono estratte. L'operazione non deve richiedere più di 15 minuti.

Separare le ghiandole dalla miniera e trasferirle in un tubo criogenico sicuro da 0,5 millilitri. Posizionare il tubo chiuso in azoto liquido, integrando tecniche di spettrometria di massa con database di sequenze generati dal CD NA della ghiandola del veleno. Le librerie hanno permesso l'identificazione delle proteine del veleno. Il peptide Laro inept era una delle 36 proteine identificate dal veleno della vedova nera mediante spettrometria di massa.

Non dimenticare che lavorare con ragni come la vedova nera può essere estremamente pericoloso, e precauzioni come l'uso di guanti protettivi devono sempre essere adottate durante l'esecuzione di questa procedura.