Isolamento dei neonatale extraepatico colangiociti

L'obiettivo generale di questa procedura è isolare e coltivare colangiociti extraepatici neuronali neonatali. Questo viene ottenuto innanzitutto esponendo chirurgicamente gli organi addominali per consentire l'accesso al fegato e ai dotti biliari. Il secondo passaggio della procedura consiste nell'asportare con attenzione il tessuto connettivo e i grassi che circondano i dotti biliari e la cistifellea.

I dotti biliari e la cistifellea puliti vengono quindi posizionati su gel di collagene spessi e coltivati per tre settimane. I colangiociti migreranno dai dotti e verranno suddivisi su gel di collagene sottili per ulteriori colture. Alla fine, i risultati mostrano monocapati di colangiociti puri mediante microscopia a immunofluorescenza.

Generalmente, le persone nuove a questa tecnica incontrano difficoltà a causa di problemi tecnici legati alla tecnica di dissezione e alla pulizia dei piccoli dotti biliari. Per questa procedura, preparare un tavolo chirurgico per topi vicino alla cappa a flusso laminare e all'incubatore. Posizionare tutti gli strumenti chirurgici sterilizzati in un becher contenente etanolo al 70%.

Posizionare tre piastre da 60 millimetri cariche di mezzo di coltura sul ghiaccio. Sono necessarie due piastre al tavolo operatorio, ma mantenere gli altri materiali nella cappa. Il collagene deve essere tenuto sul ghiaccio.

Posizionare innanzitutto un topo neonato di età compresa tra zero e tre giorni, precedentemente eutanasizzato, in posizione supina sulla tavola di dissezione. Effettuare un piccolo taglio orizzontale lungo la linea mediana in prossimità del bacino. Estendere il taglio bilateralmente, creando una linguetta a forma di U ed esporre gli organi.

Ora spostare con attenzione gli intestini a destra dell'addome. Per visualizzare il fegato e il dotto biliare, estendere le incisioni cutanee per allargare il lembo, se necessario. Sotto la lente di ingrandimento per dissezione, identificare e pulire con cura il dotto biliare comune.

Rimuovere il tessuto connettivo e il grasso circostante. Successivamente, ripetere la stessa operazione. Per pulire la colecisti, asportare il dotto biliare e la colecisti stessa, quindi posizionarli in uno dei piatti preparati a tale scopo.

Massaggiare le strutture utilizzando pinzette non graduate per rimuovere ulteriore tessuto connettivo ed espellere la bile. Successivamente, trasferire i tessuti puliti nella seconda piastra. Ripetere questo procedimento fino a quando il tessuto non è stato raccolto esattamente da cinque neonati.

Iniziare preparando un gel di collagene spesso. Prepararlo sempre fresco per primo. Riunire tutte le soluzioni sterili su ghiaccio.

Calcolare i volumi necessari per due milligrammi di collagene per millilitro di una XPBS. Aggiungere 0,023 parti di idrossido di sodio per ogni parte di collagene. Mescolare gli aliquote insieme a temperatura ambiente mediante pipettaggio.

È essenziale mescolare l'idrossido di sodio in PBS e acqua distillata prima di aggiungere il collagene. Il collagene deve essere l'ultimo componente aggiunto al gel e la soluzione finale deve essere prelevata con una pipetta. Questo impedisce al collagene di formare grumi.

Quando la soluzione inizia ad assumere una consistenza simile a un gel, incorporare immediatamente i tessuti isolati, quindi trasferire i tessuti incorporati nell'incubatrice per 30 minuti affinché si solidifichino. Una volta solidificati, ricoprire il gel con 3,5 millilitri di mezzo BEC e proseguire l'incubazione. Cambiare il mezzo BEC tre volte alla settimana. Entro tre settimane, si formeranno lamine di cellule con nuclei grandi che si estendono dai dotti incorporati.

Queste sono le colangiociti. Se la piastra presenta una popolazione significativa di fibroblasti, a meno che non possano essere rimossi con un taglio, la piastra deve essere scartata. Preparare ora sottili gel di collagene con un milligrammo di collagene per millilitro di PBS, rivestire un millilitro su una piastra da 100 millimetri e distribuire uniformemente il collagene, quindi attendere 10 minuti.

Dopo 10 minuti, coprire la piastra con sette millilitri di DM EMF 12 e incubare per 10 minuti. Al termine dell'incubazione breve, lavare rapidamente il collagene con un XPBS. Rimuovere tutto il PBS per aspirazione, quindi aggiungere un secondo strato di collagene esattamente come fatto per costruire il primo strato.

Dopo che è solidificato, sovrapporre alla piastra il DMF 12 e incubare per 30 minuti. A questo punto, separare le cellule dai gel spessi. Per prima cosa, utilizzando una spatola o un raschietto, staccare delicatamente il collagene dalla piastra in modo che galleggi.

Successivamente, preparare una soluzione filtrata di collaghenasi e aggiungere un millilitro in ciascuna piastra da 60 millimetri contenente collagene spesso. Quindi trasferire le piastre nell'incubatore. Dopo un'incubazione di 30 minuti, rimuovere tutta la soluzione contenente le cellule e trasferirla in un tubo da 15 millilitri.

Centrifugare il tubo ed eliminare il soprannatante per aspirazione. Ri-sospendere il pellet in 4,5 millilitri di terreno DMEM/F12 e centrifugare nuovamente. Ri-sospendere il pellet in tre millilitri di tripsina al 0,5% e incubare le cellule a 37 gradi Celsius per cinque minuti, durante i quali le lamelle cellulari si distaccheranno.

Dopo cinque minuti, far passare gli aggregati attraverso una pipetta da cinque o dieci millilitri fino a quando non si disgregano. Quindi aggiungere cinque millilitri di mezzo BEC e centrifugare le cellule. Una terza risospensione.

Sospendere il pellet nel mezzo DMM F12 come passaggio di lavaggio e centrifugare nuovamente le cellule. A questo punto, risospendere le cellule nel mezzo BEC e seminarle sul sottile strato preparato. I gel di collagene fanno crescere le cellule e dividerle sui gel di collagene secondo necessità.

Utilizzando il protocollo descritto, è stata isolata una popolazione di colangiociti extraepatici di topo neonato con eccellente purezza e colorata mediante immunofluorescenza per K 19. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come isolare una popolazione pura di colangiociti extraepatici di topo neonato mediante una combinazione di accurata dissezione del dotto e crescita su gel di collagene spessi.