Proton Transfer e conformazione proteica Dynamics in proteine ​​fotosensibili da Time-risolto Step-scan trasformata di Fourier Infrared Spectroscopy

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di sondare la dinamica della protonazione e i cambiamenti di conferma di due proteine di membrana fotosensibili utilizzando l'oscopia spettroscopica FTIR STEP scan risolta nel tempo. Ciò si ottiene formando prima un film proteico idrato il cui assorbimento infrarosso sarà sondato in una configurazione di riflessione totale attenuata per l'opsina batterica o in una configurazione di trasmissione per il canale Rodin due. Il secondo passo consiste nell'eccitare il campione con un flash laser a nanosecondi di lunghezza d'onda adeguata per avviare una reazione fotociclica nella proteina rilevando i cambiamenti risolti nel tempo nell'intensità della luce infrarossa che interagisce con il campione.

Successivamente, il processo di cui sopra viene ripetuto in posizioni discrete dello specchio mobile di un interferometro che controlla la differenza di percorso ottico tra due fasci divisi fino a quando non viene registrato un interferogramma completo risolto nel tempo. Il passo finale consiste nel trasformare l'interferogramma risolto nel tempo in uno spettro di assorbimento della differenza IR risolto nel tempo utilizzando la trasformata di Fourier e la legge della birra di Lambert. In definitiva, viene ispezionata l'evoluzione temporale dei divieti, specialmente in quella MI e nelle regioni carbossiliche a doppio legame CO per ottenere dinamiche di conferma e cambiamenti di protonazione nella proteina.

Il vantaggio principale della tecnica della maggior parte dei metodi sperimentali esistenti è che risolve i cambiamenti transitori di protonazione nelle proteine. Inoltre, lo fa su scale temporali di micro e millisecondi, l'intervallo di tempo più rilevante per sondare la funzionalità delle proteine. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della biofisica molecolare e della scienza delle proteine, come ad esempio quali residui del pronato e quando lo fanno durante il meccanismo funzionale di una proteina o quando avvengono importanti cambiamenti nelle proteine.

La dimostrazione della procedura sarà effettuata da Victor Ria, ricercatore associato del mio laboratorio: prima montatura, la riflettanza totale attenuata o un accessorio TR nel vano campioni dello spettrometro FTIR. Misura uno spettro di energia ad ampio raggio a quattro centimetri inversi. Risoluzione della superficie dell'elemento di riflessione interno pulito mediante spettroscopia FTIR a scansione rapida convenzionale coprire la superficie dell'A TR con 20 microlitri del tampone ad alta forza ionica utilizzato successivamente per reidratare il campione.

Quindi misurare l'assorbimento IR del tampone. Successivamente, rimuovere il tampone e sciacquare la superficie con acqua senza toccarla. Rimuovere il liquido residuo mediante un intenso flusso d'aria diffuso circa tre microlitri di una soluzione proteica da sei milligrammi per millilitro di batteri Rodin in membrana viola sulla parte superiore della superficie.

Asciugare la sospensione proteica sotto un leggero flusso di aria secca fino a ottenere un film. Quindi misurare lo spettro di assorbimento del film secco. Successivamente, aggiungere delicatamente da 20 a 40 microlitri di tampone ad alta forza ionica per reidratare il film secco.

Coprire il supporto A TR con un coperchio per evitare l'evaporazione dell'acqua, misurare e lo spettro assorbente. Stimare la percentuale di campione che rimane vicino alla superficie dopo la reidratazione del film sottraendo lo spettro di assorbimento del tampone. A questo punto, aggiungere 10 microlitri di canale opsina due disciolti in dec alside in un tampone a bassa forza ionica al centro di una finestra di fluoruro di bario di 20 millimetri di diametro.

Distribuire la soluzione con l'aiuto della punta della micropipetta a un diametro da sei a otto millimetri utilizzando un flusso delicato di aria secca, una pellicola calda e omogenea che ha un diametro che corrisponde all'incirca alle dimensioni del raggio IR all'apertura più grande. Quindi, utilizzare un O-ring piatto in silicone di un millimetro di spessore. Idratare il film aggiungendo da tre a cinque microlitri di una miscela di glicerolo e acqua distribuita in tre o cinque gocce attorno al film secco e chiuderlo ermeticamente con una seconda finestra.

Inserire le finestre a sandwich di fluoruro di bario in un supporto. Quindi posizionare il supporto nello scomparto del campione. Misurare uno spettro di assorbimento.

Verificare che l'assorbimento massimo nella regione ammidica uno sia compreso tra 0,6 e 1,0 per la configurazione A TR. Utilizzare una fibra ottica posizionata sopra il coperchio A TR per accoppiare il laser al campione. Regolare la densità di energia del laser sul campione a due o tre millijoule per centimetro quadrato per impulso.

Utilizzando un misuratore di potenza o gli esperimenti di trasmissione, utilizzare specchi per portare il laser al campione e, se necessario, lenti per fascicolare o deviare il raggio laser a un diametro leggermente superiore alla dimensione della pellicola del campione. Sincronizzare l'impulso laser con la registrazione dei dati utilizzando l'interruttore Q. Sincronizza l'impulso TTL dell'elettronica del laser al granato di alluminio dell'atrio al neodimio per attivare il convertitore analogico-digitale dello spettrometro.

Impostare la velocità di eccitazione del laser per eseguire il tempo risolto. Misure di scansione a gradini nell'intervallo spettrale da 1800 a 850 centimetri inversi. Posizionare un filtro ottico passa-basso nel percorso ottico opaco superiore a 1.950 centimetri inversi e con una buona trasmissione inferiore a 1800 centimetri inversi.

Quindi cambiare il rilevatore dalla modalità accoppiata CA a quella CC. A questo punto, portare a zero il livello CC dell'INTERFEROGRAMMA applicando una polarizzazione di corrente al rivelatore. Riregolare il guadagno elettronico per sfruttare al meglio la gamma dinamica del convertitore analogico/digitale.

Successivamente, avviare il menu di scansione passo dello spettrometro FTIR. Impostare la larghezza di banda spettrale target per la misurazione della scansione a gradini su un ottavo del numero d'onda del laser al neon elio. Impostare la risoluzione spettrale e di fase rispettivamente su otto centimetri inversi e 64 centimetri inversi.

Selezionare una funzione appe. Quindi impostare la modalità di acquisizione dell'INTERFEROGRAMMA su un lato in avanti. Impostare la frequenza di campionamento del convertitore analogico/digitale al massimo disponibile nello spettrometro.

Imposta il trigger per l'esperimento su esterno. Quindi impostare il numero di punti dati linearmente distanziati da registrare, inclusi 100 punti trigger pret. Quindi, imposta il numero di co-edizioni o il numero di medie della reazione fotografica per posizione dello specchio e avvia l'esperimento.

Infine, ripetere l'esperimento 10 volte per i batteri, redsin e 35 volte su tre diversi film campione per il canale redsin due per avere circa 200 aggiunte di CO per posizione dello specchio I divieti caratteristici delle vibrazioni dell'amito del legame peptidico sono distinguibili nello spettro di assorbimento della schiuma secca di redsin dei batteri. Quando si utilizzano tamponi a bassa forza ionica, il film si espande eccessivamente riducendo la quantità di proteina sondata dal campo evanescente. L'esatta dipendenza tra il rigonfiamento del film e la forza ionica tampone dipenderà, tra gli altri fattori, dalla natura dei lipidi.

Il rigonfiamento del film dopo l'idratazione richiede tempo per raggiungere la stabilizzazione per i batteri della dosina. Nella membrana viola, il processo è mono esponenziale con una costante di tempo di 12 minuti. Un grafico 3D da una scansione a gradini risolta nel tempo tipico, esperimento FDIR sui batteri.

Redsin è mostrato qui. Gli spettri possono essere estratti in momenti specifici. Ad esempio, quando si prevede che gli stati intermedi nel ciclo fotografico della rossina batterica raggiungano la loro popolazione più alta.

Nel tempo di fotociclo del bastoncello dei batteri Dossin, tracce di assorbanza cambiano a 1.762 centimetri inversi. Rapporti sulla dinamica della deprotonazione dell'aspartato 85 e a 1.741 centimetri inversi sulle variazioni del legame idrogeno e sulla dinamica della riproduzione della deprotonazione dell'acido aspartico.96. Il tempo scorre a 1.670 e 1.555 centimetri inversi.

Segnala i cambiamenti nelle vibrazioni MI 1 e 2, che sono entrambe sensibili alla conferma della spina dorsale peptidica. Seguendo questo metodo, è possibile eseguire altre tecniche come la neurogenesi sito-specifica o la spettroscopia enzimatica retinica per assegnare una banda vibrazionale a specifici residui nella proteina dopo il suo sviluppo. Questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo della biofisica molecolare per esplorare il meccanismo funzionale di molte diverse proteine guidate dalla luce.