Metodi di caratterizzare spontanea e startle indotta Locomozione in un rotenone-indotta malattia di Parkinson Modello di Drosophila
17 agosto 2014
La malattia di Parkinson è una malattia neurodegenerativa che deriva dalla degenerazione dei neuroni dopaminergici nel sistema nervoso centrale, causando difetti di locomozione. Modelli rotenone malattia di Parkinson in Drosophila. Questo documento delinea due saggi che caratterizzano le carenze locomozione sia spontanee e spaventare-indotte causate da rotenone.
L'obiettivo generale del seguente esperimento è determinare la locomozione spontanea indotta da startle e a lungo termine in un modello di malattia di Parkinson indotta da rotenone di drosophila, questo si ottiene allevando drosophila con cibo integrato con rotenone per indurre il fenotipo. In una seconda fase, i moscerini vengono sottoposti al test di risposta allo spavento e a un apparecchio a doppia fiala e a un test di locomozione spontanea a lungo termine. In un monitor dell'attività della Drosophila, i risultati mostrano che l'esposizione al rotenone provoca difetti di locomozione nella drosophila sulla base della quantificazione dello spavento e della locomozione spontanea a lungo termine.
Questi metodi possono aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della drosofila, dei modelli di disturbi neurodegenerativi e della locomozione, come i difetti nella locomozione indotta da startle, e la locomozione spontanea a lungo termine. Per iniziare, aggiungi 1,5 grammi di terreno di drosofila istantaneo. In una fiala standard per mosche costituire il terreno con cinque millilitri di acqua deionizzata contenente la dose appropriata di rotenone.
Successivamente, da otto a 12 mosche maschi di età compresa tra uno e tre giorni utilizzando anidride carbonica e trasportandoli in fiale contenenti il farmaco. Il cibo integrato consente ai moscerini di riprendersi dalla sedazione per 20 minuti con la fiala in posizione orizzontale. Quindi posizionare la fiala in posizione verticale in un'incubatrice al buio chiaro per 12 ore a 25 gradi Celsius per il resto dell'esperimento.
Quindi, capovolgere una fiala di mosca standard sopra un'altra fiala e sigillare la cucitura con del nastro adesivo per creare un apparecchio a doppia fiala. Quindi dividere la fiala doppia in tre sezioni uguali di 6,33 centimetri segnando dei cerchi attorno alle fiale con un pennarello indelebile. Dopo tre giorni di esposizione al farmaco, trasferire le mosche nell'apparato a doppia fiala.
La sostituzione del nastro sopra la cucitura consente alle mosche di acclimatarsi al nuovo ambiente per 15 minuti. Quindi posizionare le fiale su uno sfondo bianco e impostare la fotocamera digitale. Assicurarsi che l'intero apparecchio sia visibile in un'unica cornice e che l'apparecchio a doppia fiala e il timer siano in vista e che tutte le mosche siano a fuoco.
Contrassegnare la posizione della telecamera e della fiala per mantenere fotogrammi coerenti tra le prove, visualizzare chiaramente il numero della sperimentazione e il trattamento farmacologico nella vista della telecamera. Quindi, picchiettare con decisione l'apparecchio a doppia fiala contro il piano di lavoro tre volte e assicurarsi che tutte le mosche cadano sul fondo della fiala e avviare immediatamente il timer. Scattare una foto dell'apparecchio ogni cinque secondi per un minuto.
Quindi lascia che le mosche si riprendano indisturbate per un minuto. Ripetere il test altre due volte con tempi di recupero di un minuto tra ogni prova. Rivedi le immagini e registra il numero di mosche in ogni sezione nel tempo per fare i calcoli ricostituendo tre grammi di oph istantaneo, un mezzo con 15 millilitri di acqua deionizzata e la dose appropriata di rotenone.
Dopo cinque minuti, posizionare con cura i tubi verticalmente in fiale trasparenti e caricare il cibo sodo a un centimetro di altezza ruotando il tubo. Successivamente, spingere delicatamente il tappo di plastica all'estremità del tubo, evitando la creazione di bolle d'aria Sedate. Un maschio di un giorno vola con anidride carbonica e inserisce con cura una mosca in ogni tubo con un pennello.
Quindi tappare l'estremità del tubo con un batuffolo di cotone. Lasciare che le mosche si riprendano dall'anidride carbonica con i tubi in posizione orizzontale per 15 minuti e assicurarsi che tutte le mosche siano vive e attive. Inserire le provette nel monitor dell'attività della drosofila o DAM e verificare che tutte le provette siano nella stessa posizione rispetto alla DAM.
Posizionare il DAM in un'incubatrice al buio chiaro per 12 ore a 25 gradi Celsius. Successivamente, collegare il DAM al sistema di raccolta dati. Quindi apri il software DAM nelle preferenze.
Selezionare una raccolta dati iniziale di 10 minuti e consentire al programma di raccogliere dati per sette giorni. Quindi, apri il programma di scansione del file DAM e accedi ai dati del monitor facendo clic su Seleziona dati di input. Quindi selezionare l'intervallo di monitoraggio appropriato e impostare la lunghezza del contenitore a intervalli di 10 minuti.
Successivamente, nel tipo di file di output, scegli i file di canale e lascia tutte le altre opzioni ai loro valori predefiniti. Quindi fare clic su scansiona dati e salvare i file in una cartella designata. Infine, importa i dati nel software di analisi dei dati circadiani per ottenere conteggi al minuto.
Dopo tre giorni di esposizione a diversi dosaggi di roone wild type, le mosche di Canton esposte a dosaggi aumentati hanno mostrato una carenza nella risposta di spavento. Una percentuale inferiore di moscerini si trovava nella sezione superiore e una percentuale più alta nella sezione inferiore dell'apparato dopo 30 secondi, indicativa di un deficit nella risposta saral, una tendenza simile è stata osservata per i moscerini nel saggio di locomozione spontanea. I conteggi al minuto sono stati misurati nel monitor dell'attività della drosofila o DAM.
Il quarto giorno dopo l'esposizione, i moscerini esposti a 250 micromolari e 500 micromolari di rotenone mostrano una significativa riduzione della conta al minuto. Questi saggi possono essere convenientemente adattati per caratterizzare i difetti di locomozione in altri modelli esofagali di malattia e l'efficacia degli agenti terapeutici.
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Panoramica
Questo studio analizza le carenze locomotorie in un modello di Drosophila della malattia di Parkinson indotta da rotenone. La ricerca si concentra sia sulla locomozione spontanea che su quella indotta da stimolo improvviso, fornendo spunti sulle patologie neurodegenerative.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Neuroscienze
- Analisi Comportamentale
- Disturbi Neurodegenerativi
Sfondo
- Il morbo di Parkinson è caratterizzato dalla degenerazione dei neuroni dopaminergici.
- Drosophila è utilizzato come organismo modello per lo studio dei difetti della locomozione.
- La rotenone viene utilizzata per indurre sintomi simili al morbo di Parkinson in questi insetti.
- Comprendere la locomozione può fornire informazioni sui meccanismi della neurodegenerazione.
Scopo dello studio
- Valutare la locomozione indotta dallo startle in Drosophila.
- Valutare la locomozione spontanea a lungo termine in un modello indotto da rotenone.
- Esplorare l'impatto della rotenone sul comportamento locomotorio.
Metodi Utilizzati
- I Drosophila sono stati allevati su cibo integrato con rotenone.
- Le mosche hanno subito un test di risposta allo spavento.
- Un apparato a doppia provetta è stato utilizzato per la valutazione della locomozione.
- La locomozione spontanea a lungo termine è stata misurata utilizzando un monitor dell'attività di Drosophila.
Risultati principali
- L'esposizione alla rotenone ha provocato difetti significativi nella locomozione.
- La quantificazione ha rivelato una locomozione indotta dallo spavento compromessa.
- Anche la locomozione spontanea a lungo termine è risultata alterata a seguito dell'esposizione alla rotenone.
- Questi risultati contribuiscono alla comprensione dei disturbi della locomozione nei modelli di neurodegenerazione.
Conclusioni
- Lo studio fornisce un quadro di riferimento per la valutazione della locomozione in modelli di Drosophila della malattia di Parkinson.
- I risultati evidenziano l'utilità del rotenone nello studio dei disturbi neurodegenerativi.
- La ricerca futura potrà basarsi su questi metodi per esplorare ulteriori questioni neurobiologiche.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
Questo studio fornisce un approccio scalabile ad alto rendimento per quantificare i deficit locomotori in un modello di Drosophila della malattia di Parkinson, consentendo la validazione precoce di bersagli terapeutici e la riduzione dei rischi meccanicistici nei trattamenti per le malattie neurodegenerative. Catturando sia i fenotipi di movimento spontanei sia quelli indotti da stimoli improvvisi, i saggi offrono un'elevata affidabilità predittiva nelle campagne di modulazione delle vie metaboliche e di screening fenotipico. La metodologia garantisce una continuità traslazionale dalla fase di scoperta fino alla valutazione preclinica, facilitando la priorizzazione di composti in base al rischio, in relazione agli effetti sull'integrità dei neuroni dopaminergici e sulla funzione mitocondriale.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Target
- Valore scientifico: Consente l'analisi di ipotesi terapeutiche relative alla sopravvivenza dei neuroni dopaminergici e all'inibizione del complesso I mitocondriale.
- Valore operativo: Fornisce letture quantitative e riproducibili per chiarire i percorsi biologici e ridurre i rischi associati ai bersagli mitocondriali.
- Valore predittivo: Supporta la selezione del portafoglio distinguendo i composti che ripristinano la funzione locomotoria da quelli privi di effetto sui deficit indotti dalla rotenone.
Sviluppo di Screening e Saggi
- Valore scientifico: Fornisce sistemi biologici validati per la valutazione di composti in schermate mirate alla neurodegenerazione.
- Valore operativo: Garantisce standardizzazione del saggio e compatibilità con l'alta produttività grazie all'apparato a doppia fiala e al monitoraggio dell'attività di Drosophila.
- Scalabilità: Permette il riutilizzo della piattaforma con diverse dosi di rotenone e su diversi background genetici per una fenotipizzazione locomotoria costante.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Valore scientifico: Mantiene la rilevanza per la malattia modellando lo stress ossidativo indotto da rotenone e il declino della locomozione parallelo alla progressione del morbo di Parkinson nell'uomo.
- Valore operativo: Consente il monitoraggio longitudinale della locomozione spontanea per sette giorni al fine di valutare gli effetti cronici di un composto.
- Valore predittivo: Supporta decisioni di avanzamento con rischio calibrato collegando le risposte acute allo spavento e l'attività a lungo termine ai meccanismi neurodegenerativi.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Il metodo si integra nei flussi di lavoro delle fasi iniziali di scoperta stabilendo baseline locomotorie prima dello screening dei composti e prosegue nella ottimizzazione del composto di riferimento per la conferma del meccanismo d'azione.
- Biologia della scoperta: Supporta la verifica di ipotesi relative alla disfunzione mitocondriale e alle vie di stress ossidativo nella neurodegenerazione.
- Screening: Fornisce output quantitativi di locomozione suddivisi per classi, adatti per l'analisi automatica delle immagini e la definizione di curve dose-risposta.
- Analisi dati: Genera dati di conteggio al minuto e di distribuzione posizionale, consentendo il confronto statistico degli effetti dei trattamenti nel tempo.
- Ricerca traslazionale: Collega i difetti acuti di startle e la perdita cronica di attività spontanea al declino motorio progressivo osservato nei modelli preclinici.
- Riutilizzo aziendale: Stabilisce una piattaforma fenotipica della locomozione riutilizzabile, adattabile ad altri modelli di malattia di Drosophila e alla valutazione dell'efficacia terapeutica.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Aumenta la fiducia predittiva nella validazione degli obiettivi riducendo l'ambiguità meccanicistica nei fenotipi locomotori.
- Valore operativo: Migliora la riproducibilità e la standardizzazione tra laboratori attraverso protocolli di stimolazione definiti, intervalli di recupero e parametri di imaging.
- Valore strategico: Migliora le decisioni di avanzamento o interruzione fornendo biomarcatori precoci e quantificabili dell'integrità neuronale e della funzione mitocondriale.
- Impatto sul portafoglio: Permette la priorizzazione basata sul rischio di composti che modificano il declino locomotorio indotto da rotenone, riducendo il rischio di fallimento nelle fasi avanzate.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze specifiche nella manipolazione, sedazione e impostazione di saggi comportamentali su Drosophila.
- È dipendente da infrastrutture per l'imaging (fotocamera digitale, illuminazione) e sistemi di monitoraggio dell'attività di Drosophila per la raccolta dei dati.
- Necessita di una standardizzazione condivisa tra i gruppi di lavoro riguardo alla marcatura delle provette, alla forza del colpetto e ai tempi di recupero, al fine di garantire coerenza tra i diversi saggi.
- Richiede considerazioni adattative quando i saggi vengono estesi a diversi background genetici o condizioni ambientali.
- È limitato dalla necessità di una revisione manuale delle immagini nei saggi di startle, a meno che non sia implementato un sistema di tracciamento automatico.
Domande frequenti sulla biofarmaceutica
Chapters in this video
0:05
Title
1:12
Startle-induced Locomotion Assay and Setup
3:11
Startle-induced Locomotion Experimentation and Data Analysis
4:04
Spontaneous Locomotion Assay Setup
5:19
Spontaneous Locomotion Data Collection and Analysis
6:36
Results: Rotenone-induced Response Deficiency
7:35
Conclusion
