Name: Luso di fluorescenti target matrici per la valutazione delle cellule T risposte In vivo (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-06-19T15:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 9 s
Description: Impara a generare array di target fluorescenti per valutare le risposte delle cellule T in vivo mediante citometria a flusso multiparametrica. Questo metodo consente di analizzare oltre 250 parametri simultaneamente in un singolo animale.

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Questo lavoro è stato supportato dal progetto Sovvenzioni # 1010395 (BQ e CP) e # 525431 (CR), e un programma di sovvenzioni # 455395 (CP) dalla Salute e medicina Consiglio Nazionale delle Ricerche in Australia, un Centro australiano per l&#39;epatite e HIV Virologia EOI 2012 borsa di studio (CR e RJJ) e una sovvenzione da parte del Bootes Fondazione Gordon e Gretel (BQ e CR). Desideriamo ringraziare Harpreet Vohra e Michael Devoy per la loro eccellente mantenimento del laboratorio JCSMR FACS, Facility australiano Cancer Research Foundation Biomolecolare Resource, JCSMR, ANU, per la sintesi peptidica, e il Dr. David Boyle, CSIRO Laboratories Salute animale, Geelong, Australia per fornire le madri HIV scorte di vaccini.

<ol><li>Quah, B. J., Wijesundara, D. K., Ranasinghe, C., Parish, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+target+array+killing+assay%3A+A+multiplex+cytotoxic+T-cell+assay+to+measure+detailed+T-cell+antigen+specificity+and+avidity+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+A%22%5BJournal%5D)">Fluorescent target array killing assay: A multiplex cytotoxic T-cell assay to measure detailed T-cell antigen specificity and avidity in vivo.</a> Cytometry A. 81, 679-690 (2012).</li>
<li>Quah, B. J., Wijesundara, D. K., Ranasinghe, C., Parish, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+target+array+T+helper+assay%3A+a+multiplex+flow+cytometry+assay+to+measure+antigen-specific+CD4%2B+T+cell-mediated+B+cell+help+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">Fluorescent target array T helper assay: a multiplex flow cytometry assay to measure antigen-specific CD4+ T cell-mediated B cell help in vivo.</a> J Immunol Methods. 387, 181-190 (2013).</li>
<li>Quah, B. J., Parish, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+and+improved+methods+for+measuring+lymphocyte+proliferation+in+vitro+and+in+vivo+using+CFSE-like+fluorescent+dyes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">New and improved methods for measuring lymphocyte proliferation in vitro and in vivo using CFSE-like fluorescent dyes.</a> J Immunol Methods. 379, 1-14 (2012).</li>
<li>Mata, M., Paterson, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Th1+T+cell+responses+to+HIV-1+Gag+protein+delivered+by+a+Listeria+monocytogenes+vaccine+are+similar+to+those+induced+by+endogenous+listerial+antigens%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Th1 T cell responses to HIV-1 Gag protein delivered by a Listeria monocytogenes vaccine are similar to those induced by endogenous listerial antigens.</a> J Immunol. 163, 1449-1456 (1999).</li>
<li>Earl, P. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Design+and+evaluation+of+multi-gene%2C+multi-clade+HIV-1+MVA+vaccines%5BTitle%5D)+AND+%22Vaccine%22%5BJournal%5D)">Design and evaluation of multi-gene, multi-clade HIV-1 MVA vaccines.</a> Vaccine. 27, 5885-5895 (2009).</li>
<li>Wild, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preclinical+evaluation+of+the+immunogenicity+of+C-type+HIV-1-based+DNA+and+NYVAC+vaccines+in+the+Balb%2FC+mouse+model%5BTitle%5D)+AND+%22Viral+Immunol%22%5BJournal%5D)">Preclinical evaluation of the immunogenicity of C-type HIV-1-based DNA and NYVAC vaccines in the Balb/C mouse model.</a> Viral Immunol. 22, 309-319 (2009).</li>
<li>Takeshita, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+analysis+of+the+same+HIV+peptide+functionally+binding+to+both+a+class+I+and+a+class+II+MHC+molecule%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Molecular analysis of the same HIV peptide functionally binding to both a class I and a class II MHC molecule.</a> J Immunol. 154, 1973-1986 (1995).</li>
<li>Krutzik, P. O., Nolan, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+cell+barcoding+in+flow+cytometry+allows+high-throughput+drug+screening+and+signaling+profiling%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Fluorescent cell barcoding in flow cytometry allows high-throughput drug screening and signaling profiling.</a> Nature Methods. 3, 361-368 (2006).</li>
<li>Gilbert, D. F., Wilson, J. C., Nink, V., Lynch, J. W., Osborne, G. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplexed+labeling+of+viable+cells+for+high-throughput+analysis+of+glycine+receptor+function+using+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+A%22%5BJournal%5D)">Multiplexed labeling of viable cells for high-throughput analysis of glycine receptor function using flow cytometry.</a> Cytometry A. 75, 440-449 (2009).</li>
<li>Quah, B. J., Parish, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+carboxyfluorescein+diacetate+succinimidyl+ester+%28CFSE%29+to+monitor+lymphocyte+proliferation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">The use of carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester (CFSE) to monitor lymphocyte proliferation.</a> J Vis Exp. , (2010).</li>
<li>Quah, B. J., Warren, H. S., Parish, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monitoring+lymphocyte+proliferation+in+vitro+and+in+vivo+with+the+intracellular+fluorescent+dye+carboxyfluorescein+diacetate+succinimidyl+ester%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Monitoring lymphocyte proliferation in vitro and in vivo with the intracellular fluorescent dye carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester.</a> Nat Protoc. 2, 2049-2056 (2007).</li>
<li>Durward, M., Harms, J., Splitter, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antigen+specific+killing+assay+using+CFSE+labeled+target+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Antigen specific killing assay using CFSE labeled target cells.</a> J Vis Exp. , (2010).</li>
<li>Hermans, I. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+VITAL+assay%3A+a+versatile+fluorometric+technique+for+assessing+CTL-+and+NKT-mediated+cytotoxicity+against+multiple+targets+in+vitro+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">The VITAL assay: a versatile fluorometric technique for assessing CTL- and NKT-mediated cytotoxicity against multiple targets in vitro and in vivo.</a> J Immunol Methods. 285, 25-40 (2004).</li>
<li>Busch, D. H., Pamer, E. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T+cell+affinity+maturation+by+selective+expansion+during+infection%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">T cell affinity maturation by selective expansion during infection.</a> J Exp Med. 189, 701-710 (1999).</li>
<li>Savage, P. A., Boniface, J. J., Davis, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+kinetic+basis+for+T+cell+receptor+repertoire+selection+during+an+immune+response%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">A kinetic basis for T cell receptor repertoire selection during an immune response.</a> Immunity. 10, 485-492 (1999).</li>
<li>Wang, X. L., Altman, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caveats+in+the+design+of+MHC+class+I+tetramer%2Fantigen-specific+T+lymphocytes+dissociation+assays%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">Caveats in the design of MHC class I tetramer/antigen-specific T lymphocytes dissociation assays.</a> J Immunol Methods. 280, 25-35 (2003).</li>
<li>von Essen, M. R., Kongsbak, M., Geisler, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+behind+functional+avidity+maturation+in+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Dev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Mechanisms behind functional avidity maturation in T cells.</a> Clin Dev Immunol. , (2012).</li>
<li>Prussin, C., Metcalfe, D. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+intracytoplasmic+cytokine+using+flow+cytometry+and+directly+conjugated+anti-cytokine+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">Detection of intracytoplasmic cytokine using flow cytometry and directly conjugated anti-cytokine antibodies.</a> J Immunol Methods. 188, 117-128 (1995).</li>
<li>Foster, B., Prussin, C., Liu, F., Whitmire, J. K., Whitton, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+intracellular+cytokines+by+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Immunol%22%5BJournal%5D)">Detection of intracellular cytokines by flow cytometry.</a> Curr Protoc Immunol. , (2007).</li>
<li>Czerkinsky, C. C., Nilsson, L. A., Nygren, H., Ouchterlony, O., Tarkowski, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+solid-phase+enzyme-linked+immunospot+%28ELISPOT%29+assay+for+enumeration+of+specific+antibody-secreting+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">A solid-phase enzyme-linked immunospot (ELISPOT) assay for enumeration of specific antibody-secreting cells.</a> J Immunol Methods. 65, 109-121 (1983).</li>
<li>Klinman, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ELISPOT+assay+to+detect+cytokine-secreting+murine+and+human+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Immunol%22%5BJournal%5D)">ELISPOT assay to detect cytokine-secreting murine and human cells.</a> Curr Protoc Immunol. , (2008).</li>
<li>Yerly, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+cytotoxic+T-lymphocyte+epitope+variant+cross-recognition+and+functional+avidity+are+associated+with+hepatitis+C+virus+clearance%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Increased cytotoxic T-lymphocyte epitope variant cross-recognition and functional avidity are associated with hepatitis C virus clearance.</a> J Virol. 82, 3147-3153 (2008).</li>
</ol>

Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari in competizione.

Il vantaggio di saggi basati FTA è che permettono la discriminazione di&gt; 250 popolazioni di cellule bersaglio valida e perfettamente funzionante da un unico animale ospite mediante citometria a flusso. Questo fornisce un livello di complessità vivo flusso saggi in base citometria a che non è stato possibile prima. Ciò è evidenziato nei due esperimenti sugli animali indicati sopra, dove le risposte alle 7 epitopi virali distinte a 6 concentrazioni potrebbero essere monitorati in replicati di 6 contem...

Cellule T svolgono un ruolo centrale nella risposta immunitaria adattativa e sono spesso mirati per la manipolazione in immunoterapia. Cellule T effettrici CD4 + rispondono ai antigene estraneo secernendo citochine che regolano molti aspetti di immunità e può anche aiutare direttamente le cellule B a produrre anticorpi. Cellule CD8 + T citotossici (CTL) possono anche rispondere alle antigene estraneo secernendo citochine, così come un ruolo centrale nella uccidere direttamente le cellule che esprimono un antigene estraneo. L&#39;interazione fondamentale che avvia queste funzioni effettrici delle cellule T comporta l&#39;interazione del recettore delle cellule T (TCR) con peptidi estere visualizzati su molecole MHC sulla superficie delle cellule. Cellule CD4 + T riconoscono peptidi visualizzati su molecole MHC di classe II sulle cellule presentanti l&#39;antigene e cellule CD8 + T riconoscono peptidi visualizzati su molecole MHC di classe I che sono tipicamente visualizzati su cellule microbiche infetti. Al finevalutare il ruolo delle cellule T svolgono in una risposta immunitaria, è essenziale che le loro funzioni effettrici sono misurati con tecniche affidabili e sensibili. Metodi comuni per la valutazione della risposta delle cellule T includono; MHC class-I/II/peptide tetramero reattività; produzione di citochine da ELISPOT e intracellulare di citochine colorazione; e la capacità di uccidere con 51 saggi Cr-rilascio. Questi saggi, però, vengono in genere eseguite ex vivo con la stimolazione in vitro, o forniscono informazioni limitate nella funzione delle cellule T. Idealmente, quando si misurano le risposte delle cellule T sarebbe utile per valutare in situ, in vivo in cui si verificano, senza manipolazione di cellule T in modo da evitare alterazioni dei parametri funzionali che possono verificarsi attraverso la stimolazione in vitro. Alcuni dei più comunemente usato in vivo di cellule T saggi funzionali sono basati sulla misurazione uccisione CTL mediata delle cellule bersaglio pulsate con MHC di classe I peptidi leganti, che vengono enumerati in vivotramite la loro individuazione attraverso l&#39;etichettatura fluorescente con coloranti vitali come CFSE. Anche se questi tipi di test in grado di monitorare l&#39;uccisione CTL mediata di obiettivi quando accadono in vivo, che hanno già avuto una capacità relativamente limitata di valutare uccisione di obiettivi multipli che presentano diverse concentrazioni e diversi tipi di epitopi peptidici, che è necessario per consentire parametri qualitativi quali avidity funzionale e la variante epitopi cross-reattività da valutare. Questi test inoltre non forniscono alcuna informazione sui cellulari mediate risposte T CD4 +. Per superare molte delle limitazioni con metodi attualmente utilizzati per valutare le risposte delle cellule T, abbiamo recentemente sviluppato un saggio multiplex basato su array fluorescenti bersaglio (ALS), che permette il controllo delle risposte delle cellule T contro&gt; 250 cellule bersaglio contemporaneamente in un animale da citometria a flusso 1, 2. Accordi di libero scambio sono costituiti da linfociti marcati con SEVLe concentrazioni rali e combinazioni di coloranti vitali come CFSE, CTV e CPD permettendo&gt; 250 gruppi di cellule di fluorescenza unico da generare. Poiché queste cellule rimangono vitali e completamente funzionale, possono essere iniettati in animali per consentire il monitoraggio della loro interazione con le cellule T effettrici in vivo 3. Ad esempio, i gruppi di cellule FTA possono essere pulsate con peptidi MHC di classe I-binding per consentire la valutazione di antigene-specifica uccisione CTL mediata delle cellule bersaglio 1. Inoltre, i gruppi di cellule FTA possono essere pulsate con peptidi MHC di classe II-legame, che permetta di valutare antigene specifico per le cellule T helper (T H) L&#39;attività valutando attivazione (mediante la valutazione dei marcatori di attivazione quali CD69, CD44 e / o CD62L) delle cellule B all&#39;interno della zona di libero scambio recanti peptide cognate 2. Da più di 250 obiettivi possono essere rilevati simultaneamente, è possibile misurare le risposte CTL e T H contro molti gruppi di cellule bersaglio pulsate con npeptidi umerous a diverse concentrazioni e l&#39;inclusione di molti replicati. Il test FTA prevede pertanto un livello senza precedenti di T effettrici delle cellule valutazione della risposta in vivo. Qui si descrive in dettaglio la costruzione di un FTA e mostrare come possono essere applicati a valutare le risposte delle cellule T in vivo. La procedura descrive la costruzione di un FTA composto di 252 gruppi di cellule distinguibili attraverso l&#39;uso di tre coloranti vitali, composti da 6 ripetizioni di 42 gruppi di cellule pulsate con MHC di classe I e II peptidi leganti. L&#39;etichettatura dei 42 gruppi di cellule avviene in 10 ml a fondo conico tubi ed è utile per fissare questi fuori in un rack tubo, come indicato nella Tabella 1. Questo metodo può essere regolata per piccoli numeri di cluster distinguibili come richiesto riducendo la quantità di etichettatura di ciascun colorante eseguita 1. Si evidenzia l&#39;utilità del test, mostrando come si può misurare responses generati da ricombinante vaccinazione pox virus contro diversi epitopi in una piccola coorte di topi. Questo mostra come il test FTA può essere utilizzato per misurare le risposte cumulative e avidità funzionale attraverso, rispettivamente, l&#39;uso di area sotto la curva (AUC) valutazioni e misurare la concentrazione di peptide efficace necessaria per generare risposte massime mezzo (EC 50).

<table><tbody><tr><td>RPMI</td><td>Sigma</td><td>R8758</td><td></td></tr><tr><td>Siero fetale di vitello</td><td>Serana</td><td>FCS-500</td><td></td></tr><tr><td>CTV</td><td>Invitrogen</td><td>C34557</td><td></td></tr><tr><td>CFDA, SE</td><td>Invitrogen</td><td>C1157</td><td></td></tr><tr><td>CPD</td><td>eBioscience</td><td>65-0840-90</td><td></td></tr><tr><td>anti-B220 PerCp-Cy5.5</td><td>eBioscience</td><td>110730</td><td></td></tr><tr><td>anti-CD69 viola brillante 605</td><td>Biolegend</td><td>104529</td><td></td></tr><tr><td>PKH-26</td><td>Sigma</td><td>PKH26GL-1KT</td><td></td></tr><tr><td>Vortex</td><td>Scientific Industries Inc</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Centrifuga</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Citometro a flusso (Fortessa o equivalente con sorgente laser blu, rossa e viola)</td><td>BD Bioscience</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

l&#39;uso di fluorescenti target matrici per la valutazione delle cellule t risposte<em&gt; in vivo</em

The Use of Fluorescent Target Arrays for Assessment of T Cell Responses In vivo

La capacità di monitorare le risposte delle cellule T in vivo è importante per lo sviluppo della nostra comprensione della risposta immunitaria e la progettazione di immunoterapie. Qui si descrive l&#39;uso della tecnologia matrice di destinazione fluorescente (FTA), che utilizza coloranti vitali come ester carbossifluoresceina succinimidyl (CFSE), laser viola coloranti eccitabili (CellTrace Violet: CTV) e laser rosso coloranti eccitabili (Cell Proliferation Dye eFluor 670: CPD ) per combinatorialmente linfociti del mouse etichette in&gt; 250 distinguibili gruppi di cellule fluorescenti. Gruppi di cellule all&#39;interno di questi ALS possono essere pulsate con maggiore di istocompatibilità (MHC) di classe I e MHC classe II-peptidi leganti e quindi agiscono come cellule bersaglio per CD8 + e CD4 +, rispettivamente. Queste cellule FTA rimangono vitali e pienamente funzionale, e possono quindi essere somministrati in topi per consentire la valutazione della CD8 + T uccisione cellulo-mediata delle cellule bersaglio FTA e CD4 + T hel cell-meditatap delle cellule bersaglio cellule FTA B in tempo reale in vivo mediante citometria a flusso. Da&gt; 250 cellule bersaglio possono essere valutati in una volta, la tecnica consente di monitorare risposte delle cellule T contro diversi epitopi antigenici in diverse concentrazioni e in più replicati. Come tale, la tecnica può misurare le risposte delle cellule T sia un quantitativo (ad esempio la grandezza cumulativo della risposta) e qualitativa (ad es. Avidità funzionale e epitopo-cross reattività della risposta) livello. Qui, descriviamo come tali ALS sono costruiti e danno un esempio di come possono essere applicati per valutare le risposte delle cellule T indotta da un vaccino pox virus ricombinante.

Come esempio dell&#39;uso del test FTA, un topo BALB / c è stato immunizzato con il virus vaccinia ricombinante (VV) esprimere epitopi di HIV-I (VV-HIV) e le risposte alle epitopi di HIV-I CTL, Gag, mut Gag, Env e Pol, il VV CTL epitopi F2L e F2L mut, e l&#39;epitopo cellule HIV-I T H, Gag Th (come descritto al punto 2), sono stati valutati utilizzando un parametro di 252 FTA test (Figura 1B). Varianti epitopo Gag (mut Gag) e F2L (F2L MUT) non sono espressi nel vettore VV-HIV e qui...

La capacità di monitorare le risposte delle cellule T in dettaglio in vivo è importante per lo sviluppo della nostra comprensione della risposta immunitaria. Qui si descrive l&#39;uso di array di destinazione fluorescenti (ALS) in un test in vivo di cellule T in che valuta&gt; 250 parametri contemporaneamente mediante citometria a flusso.

L&#39;uso di fluorescenti target matrici per la valutazione delle cellule T risposte<em&gt; In vivo</em

The ability to monitor T cell responses in vivo is important for the development of our understanding of the immune response and the design of ...

L'obiettivo generale di questa procedura è generare un array di fino a 252 cellule bersaglio fluorescenti distinte etichettate per saggi immunologici mediante citometria a flusso multiparametrica. Questo risultato si ottiene innanzitutto etichettando i linfociti bersaglio con combinazioni uniche e diverse intensità di coloranti vitali come CFSE e CTV. Il passaggio successivo consiste nell'esporre ciascuna popolazione distinta di linfociti bersaglio a epitopi peptidici candidati che si legano alle molecole del complesso maggiore di istocompatibilità di classe I e di classe II.Successivamente, le cellule vengono lavate accuratamente per mantenere la specificità degli epitopi, quindi raggruppate e iniettate in un animale. I passaggi finali consistono nel prelevare le cellule con array di marcatori fluorescenti da tessuti specifici, etichettarle e valutare le risposte specifiche ai peptidi del complesso maggiore di istocompatibilità. In definitiva, i risultati della citometria a flusso possono mostrare le risposte dei linfociti T citotossici misurando la morte delle cellule bersaglio e possono rivelare le risposte dei linfociti T helper CD4 positivi misurando l'upregolazione dei marcat

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Immunologia e Infezioni

La compartimentazione delle proteine ​​sia all'interno della membrana plasmatica o in sedi intracellulari è un meccanismo di regolazione che possono influenzare notevolmente i risultati di segnalazione, di conseguenza, per comprendere la segnalazione è importante studiare il comportamento spaziale e temporale delle proteine ​​coinvolte. Descriviamo qui un sistema basato TIRF microscopia a studiare trasduzione del segnale in cellule T, ma è ampiamente applicabile.

Una tecnica di microscopia TIRF per Real-time, Imaging simultanea del TCR e delle sue proteine ​​associate segnalazione

Questo video dimostra lo screening di composti immunomodulatori tramite test basati sulla fluorescenza. I linfociti T transgenici derivati da topi con cassette di espressione proteica fluorescente verde sono trattati con questi composti. I segnali GFP potenziati e ridotti consentono l'identificazione degli effetti stimolatori e inibitori dei composti, rispettivamente.

Un test basato sulla fluorescenza che utilizza linfociti ingegnerizzati per lo screening di composti immunomodulatori

Descriviamo una singola cellula saggio ad alta prestazione per misurare la citotossicità delle cellule T quando incubati con cellule tumorali bersaglio. Questo metodo impiega una densa matrice elastomerica di sub-nanolitri pozzetti (~ 100.000 pozzetti / matrice) per confinare spazialmente le cellule T e le cellule bersaglio con rapporti definiti ed è accoppiato al microscopio a fluorescenza per monitorare effettore-bersaglio coniugazione e apoptosi successiva.

Quantitativa High-throughput cella singola test di citotossicità per le cellule T

Descriviamo tecniche basate sull'imaging di animali interi e citometria a flusso per monitorare l'espansione delle cellule T CD8+ antigene-specifiche in risposta all'immunizzazione con nanoparticelle in un modello murino di vaccinazione.

Imaging Whole-animale e di citometria a flusso tecniche di analisi di Antigen-specific CD8 + cellule T Risposte dopo nanoparticelle vaccinazione

Questo manoscritto descrive come condurre saggi basati su (singola molecola) basati sul trasferimento di energia di risonanza di Förster (FRET) per misurare le dinamiche di legame tra il recettore dell'antigene delle cellule T (TCR) e le molecole MHC caricate con peptidi antigenici mentre si verificano all'interno della sinapsi immunologica di una cellula T a contatto con un doppio strato lipidico supportato planare funzionalizzato.

Misurazione TCR-pMHC Binding<em&gt; In Situ</em&gt; Utilizzando un microscopio saggio basato FRET-

I meccanismi che regolano la motilità interstiziale di cellule CD4 T effettrici in siti di infiammazione sono relativamente sconosciuti. Presentiamo un approccio non invasivo per visualizzare e manipolare cellule CD4 T vitro -primed nel derma dell'orecchio infiammate, permettendo studio del comportamento dinamico di queste cellule in situ.

Imaging CD4 T cellule interstiziali migrazione nel derma infiammate

Presentiamo in questo studio un test basato sulla fluorescenza romanzo utilizzando linfociti derivati ​​da un topo transgenico. Questo test è adatto per high-throughput screening (HTS) di piccole molecole dotate di capacità di una inibizione o la promozione di attivazione dei linfociti.

Una fluorescenza a base di linfociti Assay Adatto per high-throughput screening di piccole molecole

Questo protocollo descrive un metodo per immagine residente tumore-infiltrazione CD8 T cellule identificate con gli anticorpi fluorescente accoppiati all'interno di fette di tumore del polmone umano. Questa tecnica permette in tempo reale analisi di migrazione delle cellule T CD8 usando la microscopia confocal.

Ex Vivo Imaging dei linfociti T CD8 residente nel tumore del polmone umano mediante microscopia confocale a fette

Questo protocollo descrive un metodo basato su formazione immagine per attivare i linfociti T usando fuse peptide-MHC, consentendo un controllo preciso spazio-temporale dell'attivazione delle cellule T.

Controllo spaziale e temporale di attivazione delle cellule T utilizzando un agonista fuse

Questo protocollo descrive la metodologia per il tracciamento non invasivo delle cellule T geneticamente modificate per esprimere i recettori dell'antigene chimerico in vivo con una piattaforma clinicamente disponibile.

Imaging dinamico di cellule T del recettore dell'antigene chimerico con [18F] tomografia ad emissione di positroni tetrafluoroborato/tomografia computerizzata

Impara a generare array di target fluorescenti per valutare le risposte delle cellule T in vivo mediante citometria a flusso multiparametrica. Questo metodo consente di analizzare oltre 250 parametri simultaneamente in un singolo animale.

L'uso di fluorescenti target matrici per la valutazione delle cellule T risposte

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