Name: Luso di fluorescenti target matrici per la valutazione delle cellule T risposte In vivo (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-06-19T15:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 9 s
Description: Impara a generare array di target fluorescenti per valutare le risposte delle cellule T in vivo mediante citometria a flusso multiparametrica. Questo metodo consente di analizzare oltre 250 parametri simultaneamente in un singolo animale.

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Questo lavoro è stato supportato dal progetto Sovvenzioni # 1010395 (BQ e CP) e # 525431 (CR), e un programma di sovvenzioni # 455395 (CP) dalla Salute e medicina Consiglio Nazionale delle Ricerche in Australia, un Centro australiano per l&#39;epatite e HIV Virologia EOI 2012 borsa di studio (CR e RJJ) e una sovvenzione da parte del Bootes Fondazione Gordon e Gretel (BQ e CR). Desideriamo ringraziare Harpreet Vohra e Michael Devoy per la loro eccellente mantenimento del laboratorio JCSMR FACS, Facility australiano Cancer Research Foundation Biomolecolare Resource, JCSMR, ANU, per la sintesi peptidica, e il Dr. David Boyle, CSIRO Laboratories Salute animale, Geelong, Australia per fornire le madri HIV scorte di vaccini.

<ol><li>Quah, B. J., Wijesundara, D. K., Ranasinghe, C., Parish, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+target+array+killing+assay%3A+A+multiplex+cytotoxic+T-cell+assay+to+measure+detailed+T-cell+antigen+specificity+and+avidity+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+A%22%5BJournal%5D)">Fluorescent target array killing assay: A multiplex cytotoxic T-cell assay to measure detailed T-cell antigen specificity and avidity in vivo.</a> Cytometry A. 81, 679-690 (2012).</li>
<li>Quah, B. J., Wijesundara, D. K., Ranasinghe, C., Parish, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+target+array+T+helper+assay%3A+a+multiplex+flow+cytometry+assay+to+measure+antigen-specific+CD4%2B+T+cell-mediated+B+cell+help+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">Fluorescent target array T helper assay: a multiplex flow cytometry assay to measure antigen-specific CD4+ T cell-mediated B cell help in vivo.</a> J Immunol Methods. 387, 181-190 (2013).</li>
<li>Quah, B. J., Parish, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+and+improved+methods+for+measuring+lymphocyte+proliferation+in+vitro+and+in+vivo+using+CFSE-like+fluorescent+dyes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">New and improved methods for measuring lymphocyte proliferation in vitro and in vivo using CFSE-like fluorescent dyes.</a> J Immunol Methods. 379, 1-14 (2012).</li>
<li>Mata, M., Paterson, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Th1+T+cell+responses+to+HIV-1+Gag+protein+delivered+by+a+Listeria+monocytogenes+vaccine+are+similar+to+those+induced+by+endogenous+listerial+antigens%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Th1 T cell responses to HIV-1 Gag protein delivered by a Listeria monocytogenes vaccine are similar to those induced by endogenous listerial antigens.</a> J Immunol. 163, 1449-1456 (1999).</li>
<li>Earl, P. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Design+and+evaluation+of+multi-gene%2C+multi-clade+HIV-1+MVA+vaccines%5BTitle%5D)+AND+%22Vaccine%22%5BJournal%5D)">Design and evaluation of multi-gene, multi-clade HIV-1 MVA vaccines.</a> Vaccine. 27, 5885-5895 (2009).</li>
<li>Wild, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preclinical+evaluation+of+the+immunogenicity+of+C-type+HIV-1-based+DNA+and+NYVAC+vaccines+in+the+Balb%2FC+mouse+model%5BTitle%5D)+AND+%22Viral+Immunol%22%5BJournal%5D)">Preclinical evaluation of the immunogenicity of C-type HIV-1-based DNA and NYVAC vaccines in the Balb/C mouse model.</a> Viral Immunol. 22, 309-319 (2009).</li>
<li>Takeshita, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+analysis+of+the+same+HIV+peptide+functionally+binding+to+both+a+class+I+and+a+class+II+MHC+molecule%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Molecular analysis of the same HIV peptide functionally binding to both a class I and a class II MHC molecule.</a> J Immunol. 154, 1973-1986 (1995).</li>
<li>Krutzik, P. O., Nolan, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+cell+barcoding+in+flow+cytometry+allows+high-throughput+drug+screening+and+signaling+profiling%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Fluorescent cell barcoding in flow cytometry allows high-throughput drug screening and signaling profiling.</a> Nature Methods. 3, 361-368 (2006).</li>
<li>Gilbert, D. F., Wilson, J. C., Nink, V., Lynch, J. W., Osborne, G. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplexed+labeling+of+viable+cells+for+high-throughput+analysis+of+glycine+receptor+function+using+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+A%22%5BJournal%5D)">Multiplexed labeling of viable cells for high-throughput analysis of glycine receptor function using flow cytometry.</a> Cytometry A. 75, 440-449 (2009).</li>
<li>Quah, B. J., Parish, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+carboxyfluorescein+diacetate+succinimidyl+ester+%28CFSE%29+to+monitor+lymphocyte+proliferation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">The use of carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester (CFSE) to monitor lymphocyte proliferation.</a> J Vis Exp. , (2010).</li>
<li>Quah, B. J., Warren, H. S., Parish, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monitoring+lymphocyte+proliferation+in+vitro+and+in+vivo+with+the+intracellular+fluorescent+dye+carboxyfluorescein+diacetate+succinimidyl+ester%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Monitoring lymphocyte proliferation in vitro and in vivo with the intracellular fluorescent dye carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester.</a> Nat Protoc. 2, 2049-2056 (2007).</li>
<li>Durward, M., Harms, J., Splitter, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antigen+specific+killing+assay+using+CFSE+labeled+target+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Antigen specific killing assay using CFSE labeled target cells.</a> J Vis Exp. , (2010).</li>
<li>Hermans, I. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+VITAL+assay%3A+a+versatile+fluorometric+technique+for+assessing+CTL-+and+NKT-mediated+cytotoxicity+against+multiple+targets+in+vitro+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">The VITAL assay: a versatile fluorometric technique for assessing CTL- and NKT-mediated cytotoxicity against multiple targets in vitro and in vivo.</a> J Immunol Methods. 285, 25-40 (2004).</li>
<li>Busch, D. H., Pamer, E. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T+cell+affinity+maturation+by+selective+expansion+during+infection%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">T cell affinity maturation by selective expansion during infection.</a> J Exp Med. 189, 701-710 (1999).</li>
<li>Savage, P. A., Boniface, J. J., Davis, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+kinetic+basis+for+T+cell+receptor+repertoire+selection+during+an+immune+response%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">A kinetic basis for T cell receptor repertoire selection during an immune response.</a> Immunity. 10, 485-492 (1999).</li>
<li>Wang, X. L., Altman, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caveats+in+the+design+of+MHC+class+I+tetramer%2Fantigen-specific+T+lymphocytes+dissociation+assays%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">Caveats in the design of MHC class I tetramer/antigen-specific T lymphocytes dissociation assays.</a> J Immunol Methods. 280, 25-35 (2003).</li>
<li>von Essen, M. R., Kongsbak, M., Geisler, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+behind+functional+avidity+maturation+in+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Dev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Mechanisms behind functional avidity maturation in T cells.</a> Clin Dev Immunol. , (2012).</li>
<li>Prussin, C., Metcalfe, D. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+intracytoplasmic+cytokine+using+flow+cytometry+and+directly+conjugated+anti-cytokine+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">Detection of intracytoplasmic cytokine using flow cytometry and directly conjugated anti-cytokine antibodies.</a> J Immunol Methods. 188, 117-128 (1995).</li>
<li>Foster, B., Prussin, C., Liu, F., Whitmire, J. K., Whitton, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+intracellular+cytokines+by+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Immunol%22%5BJournal%5D)">Detection of intracellular cytokines by flow cytometry.</a> Curr Protoc Immunol. , (2007).</li>
<li>Czerkinsky, C. C., Nilsson, L. A., Nygren, H., Ouchterlony, O., Tarkowski, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+solid-phase+enzyme-linked+immunospot+%28ELISPOT%29+assay+for+enumeration+of+specific+antibody-secreting+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">A solid-phase enzyme-linked immunospot (ELISPOT) assay for enumeration of specific antibody-secreting cells.</a> J Immunol Methods. 65, 109-121 (1983).</li>
<li>Klinman, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ELISPOT+assay+to+detect+cytokine-secreting+murine+and+human+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Immunol%22%5BJournal%5D)">ELISPOT assay to detect cytokine-secreting murine and human cells.</a> Curr Protoc Immunol. , (2008).</li>
<li>Yerly, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+cytotoxic+T-lymphocyte+epitope+variant+cross-recognition+and+functional+avidity+are+associated+with+hepatitis+C+virus+clearance%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Increased cytotoxic T-lymphocyte epitope variant cross-recognition and functional avidity are associated with hepatitis C virus clearance.</a> J Virol. 82, 3147-3153 (2008).</li>
</ol>

Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari in competizione.

Il vantaggio di saggi basati FTA è che permettono la discriminazione di&gt; 250 popolazioni di cellule bersaglio valida e perfettamente funzionante da un unico animale ospite mediante citometria a flusso. Questo fornisce un livello di complessità vivo flusso saggi in base citometria a che non è stato possibile prima. Ciò è evidenziato nei due esperimenti sugli animali indicati sopra, dove le risposte alle 7 epitopi virali distinte a 6 concentrazioni potrebbero essere monitorati in replicati di 6 contem...

Cellule T svolgono un ruolo centrale nella risposta immunitaria adattativa e sono spesso mirati per la manipolazione in immunoterapia. Cellule T effettrici CD4 + rispondono ai antigene estraneo secernendo citochine che regolano molti aspetti di immunità e può anche aiutare direttamente le cellule B a produrre anticorpi. Cellule CD8 + T citotossici (CTL) possono anche rispondere alle antigene estraneo secernendo citochine, così come un ruolo centrale nella uccidere direttamente le cellule che esprimono un antigene estraneo. L&#39;interazione fondamentale che avvia queste funzioni effettrici delle cellule T comporta l&#39;interazione del recettore delle cellule T (TCR) con peptidi estere visualizzati su molecole MHC sulla superficie delle cellule. Cellule CD4 + T riconoscono peptidi visualizzati su molecole MHC di classe II sulle cellule presentanti l&#39;antigene e cellule CD8 + T riconoscono peptidi visualizzati su molecole MHC di classe I che sono tipicamente visualizzati su cellule microbiche infetti. Al finevalutare il ruolo delle cellule T svolgono in una risposta immunitaria, è essenziale che le loro funzioni effettrici sono misurati con tecniche affidabili e sensibili. Metodi comuni per la valutazione della risposta delle cellule T includono; MHC class-I/II/peptide tetramero reattività; produzione di citochine da ELISPOT e intracellulare di citochine colorazione; e la capacità di uccidere con 51 saggi Cr-rilascio. Questi saggi, però, vengono in genere eseguite ex vivo con la stimolazione in vitro, o forniscono informazioni limitate nella funzione delle cellule T. Idealmente, quando si misurano le risposte delle cellule T sarebbe utile per valutare in situ, in vivo in cui si verificano, senza manipolazione di cellule T in modo da evitare alterazioni dei parametri funzionali che possono verificarsi attraverso la stimolazione in vitro. Alcuni dei più comunemente usato in vivo di cellule T saggi funzionali sono basati sulla misurazione uccisione CTL mediata delle cellule bersaglio pulsate con MHC di classe I peptidi leganti, che vengono enumerati in vivotramite la loro individuazione attraverso l&#39;etichettatura fluorescente con coloranti vitali come CFSE. Anche se questi tipi di test in grado di monitorare l&#39;uccisione CTL mediata di obiettivi quando accadono in vivo, che hanno già avuto una capacità relativamente limitata di valutare uccisione di obiettivi multipli che presentano diverse concentrazioni e diversi tipi di epitopi peptidici, che è necessario per consentire parametri qualitativi quali avidity funzionale e la variante epitopi cross-reattività da valutare. Questi test inoltre non forniscono alcuna informazione sui cellulari mediate risposte T CD4 +. Per superare molte delle limitazioni con metodi attualmente utilizzati per valutare le risposte delle cellule T, abbiamo recentemente sviluppato un saggio multiplex basato su array fluorescenti bersaglio (ALS), che permette il controllo delle risposte delle cellule T contro&gt; 250 cellule bersaglio contemporaneamente in un animale da citometria a flusso 1, 2. Accordi di libero scambio sono costituiti da linfociti marcati con SEVLe concentrazioni rali e combinazioni di coloranti vitali come CFSE, CTV e CPD permettendo&gt; 250 gruppi di cellule di fluorescenza unico da generare. Poiché queste cellule rimangono vitali e completamente funzionale, possono essere iniettati in animali per consentire il monitoraggio della loro interazione con le cellule T effettrici in vivo 3. Ad esempio, i gruppi di cellule FTA possono essere pulsate con peptidi MHC di classe I-binding per consentire la valutazione di antigene-specifica uccisione CTL mediata delle cellule bersaglio 1. Inoltre, i gruppi di cellule FTA possono essere pulsate con peptidi MHC di classe II-legame, che permetta di valutare antigene specifico per le cellule T helper (T H) L&#39;attività valutando attivazione (mediante la valutazione dei marcatori di attivazione quali CD69, CD44 e / o CD62L) delle cellule B all&#39;interno della zona di libero scambio recanti peptide cognate 2. Da più di 250 obiettivi possono essere rilevati simultaneamente, è possibile misurare le risposte CTL e T H contro molti gruppi di cellule bersaglio pulsate con npeptidi umerous a diverse concentrazioni e l&#39;inclusione di molti replicati. Il test FTA prevede pertanto un livello senza precedenti di T effettrici delle cellule valutazione della risposta in vivo. Qui si descrive in dettaglio la costruzione di un FTA e mostrare come possono essere applicati a valutare le risposte delle cellule T in vivo. La procedura descrive la costruzione di un FTA composto di 252 gruppi di cellule distinguibili attraverso l&#39;uso di tre coloranti vitali, composti da 6 ripetizioni di 42 gruppi di cellule pulsate con MHC di classe I e II peptidi leganti. L&#39;etichettatura dei 42 gruppi di cellule avviene in 10 ml a fondo conico tubi ed è utile per fissare questi fuori in un rack tubo, come indicato nella Tabella 1. Questo metodo può essere regolata per piccoli numeri di cluster distinguibili come richiesto riducendo la quantità di etichettatura di ciascun colorante eseguita 1. Si evidenzia l&#39;utilità del test, mostrando come si può misurare responses generati da ricombinante vaccinazione pox virus contro diversi epitopi in una piccola coorte di topi. Questo mostra come il test FTA può essere utilizzato per misurare le risposte cumulative e avidità funzionale attraverso, rispettivamente, l&#39;uso di area sotto la curva (AUC) valutazioni e misurare la concentrazione di peptide efficace necessaria per generare risposte massime mezzo (EC 50).

<table><tbody><tr><td>RPMI</td><td>Sigma</td><td>R8758</td><td></td></tr><tr><td>Siero fetale di vitello</td><td>Serana</td><td>FCS-500</td><td></td></tr><tr><td>CTV</td><td>Invitrogen</td><td>C34557</td><td></td></tr><tr><td>CFDA, SE</td><td>Invitrogen</td><td>C1157</td><td></td></tr><tr><td>CPD</td><td>eBioscience</td><td>65-0840-90</td><td></td></tr><tr><td>anti-B220 PerCp-Cy5.5</td><td>eBioscience</td><td>110730</td><td></td></tr><tr><td>anti-CD69 viola brillante 605</td><td>Biolegend</td><td>104529</td><td></td></tr><tr><td>PKH-26</td><td>Sigma</td><td>PKH26GL-1KT</td><td></td></tr><tr><td>Vortex</td><td>Scientific Industries Inc</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Centrifuga</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Citometro a flusso (Fortessa o equivalente con sorgente laser blu, rossa e viola)</td><td>BD Bioscience</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

l&#39;uso di fluorescenti target matrici per la valutazione delle cellule t risposte<em&gt; in vivo</em

The Use of Fluorescent Target Arrays for Assessment of T Cell Responses In vivo

La capacità di monitorare le risposte delle cellule T in vivo è importante per lo sviluppo della nostra comprensione della risposta immunitaria e la progettazione di immunoterapie. Qui si descrive l&#39;uso della tecnologia matrice di destinazione fluorescente (FTA), che utilizza coloranti vitali come ester carbossifluoresceina succinimidyl (CFSE), laser viola coloranti eccitabili (CellTrace Violet: CTV) e laser rosso coloranti eccitabili (Cell Proliferation Dye eFluor 670: CPD ) per combinatorialmente linfociti del mouse etichette in&gt; 250 distinguibili gruppi di cellule fluorescenti. Gruppi di cellule all&#39;interno di questi ALS possono essere pulsate con maggiore di istocompatibilità (MHC) di classe I e MHC classe II-peptidi leganti e quindi agiscono come cellule bersaglio per CD8 + e CD4 +, rispettivamente. Queste cellule FTA rimangono vitali e pienamente funzionale, e possono quindi essere somministrati in topi per consentire la valutazione della CD8 + T uccisione cellulo-mediata delle cellule bersaglio FTA e CD4 + T hel cell-meditatap delle cellule bersaglio cellule FTA B in tempo reale in vivo mediante citometria a flusso. Da&gt; 250 cellule bersaglio possono essere valutati in una volta, la tecnica consente di monitorare risposte delle cellule T contro diversi epitopi antigenici in diverse concentrazioni e in più replicati. Come tale, la tecnica può misurare le risposte delle cellule T sia un quantitativo (ad esempio la grandezza cumulativo della risposta) e qualitativa (ad es. Avidità funzionale e epitopo-cross reattività della risposta) livello. Qui, descriviamo come tali ALS sono costruiti e danno un esempio di come possono essere applicati per valutare le risposte delle cellule T indotta da un vaccino pox virus ricombinante.

Come esempio dell&#39;uso del test FTA, un topo BALB / c è stato immunizzato con il virus vaccinia ricombinante (VV) esprimere epitopi di HIV-I (VV-HIV) e le risposte alle epitopi di HIV-I CTL, Gag, mut Gag, Env e Pol, il VV CTL epitopi F2L e F2L mut, e l&#39;epitopo cellule HIV-I T H, Gag Th (come descritto al punto 2), sono stati valutati utilizzando un parametro di 252 FTA test (Figura 1B). Varianti epitopo Gag (mut Gag) e F2L (F2L MUT) non sono espressi nel vettore VV-HIV e qui...

La capacità di monitorare le risposte delle cellule T in dettaglio in vivo è importante per lo sviluppo della nostra comprensione della risposta immunitaria. Qui si descrive l&#39;uso di array di destinazione fluorescenti (ALS) in un test in vivo di cellule T in che valuta&gt; 250 parametri contemporaneamente mediante citometria a flusso.

L&#39;uso di fluorescenti target matrici per la valutazione delle cellule T risposte<em&gt; In vivo</em

The ability to monitor T cell responses in vivo is important for the development of our understanding of the immune response and the design of ...

L'obiettivo generale di questa procedura è generare un array di fino a 252 cellule bersaglio fluorescenti distinte etichettate per saggi immunologici mediante citometria a flusso multiparametrica. Questo risultato si ottiene innanzitutto etichettando i linfociti bersaglio con combinazioni uniche e diverse intensità di coloranti vitali come CFSE e CTV. Il passaggio successivo consiste nell'esporre ciascuna popolazione distinta di linfociti bersaglio a epitopi peptidici candidati che si legano alle molecole del complesso maggiore di istocompatibilità di classe I e di classe II.Successivamente, le cellule vengono lavate accuratamente per mantenere la specificità degli epitopi, quindi raggruppate e iniettate in un animale. I passaggi finali consistono nel prelevare le cellule con array di marcatori fluorescenti da tessuti specifici, etichettarle e valutare le risposte specifiche ai peptidi del complesso maggiore di istocompatibilità. In definitiva, i risultati della citometria a flusso possono mostrare le risposte dei linfociti T citotossici misurando la morte delle cellule bersaglio e possono rivelare le risposte dei linfociti T helper CD4 positivi misurando l'upregolazione dei marcatori di attivazione nelle cellule B. Uno dei principali vantaggi di questa tecnica rispetto ai tradizionali saggi in vivo per linfociti T citotossici è che consente la misurazione simultanea di oltre 250 cellule bersaglio in un singolo animale. A dimostrare la procedura sarà Ben Quire, ricercatore nel mio laboratorio.La procedura richiede linfociti raccolti dalla milza isolata e/o dai linfonodi di topi, filtrati e risospesi fino a 200 milioni di cellule per millilitro in 11,5 millilitri di RPMI contenente 5% di siero fetale bovino. La preparazione dell'FDA inizia con l'etichettatura. 42 provette di plastica conica da 10 millilitri, numerate da 1 a 42, verranno trattate con sette diversi epitopi peptidici a sei concentrazioni differenti, ripetute sei volte, per generare 252 cluster cellulari distinguibili.Ora, risospendere accuratamente i linfociti capovolgendo il tubo diverse volte. Quindi aggiungere 1,9 millilitri di sospensione cellulare nei tubi da 10 millilitri etichettati da 37 a 42, avendo cura di non bagnare la metà superiore dei tubi.Ora togliere il tappo dal tubo 38 e posizionarlo orizzontalmente sulla parte superiore del tubo 38. Aggiungere 83 microlitri di PBS. Quindi aggiungere 17 microlitri della soluzione madre di CTV appropriata, come indicato nella tabella due del protocollo testuale.Dopo aver caricato il tubo, agitarlo con il vortex. Ripetere questa operazione con i tubi da 39 a 42, assicurandosi che ogni tubo riceva un diverso stock di CTV come indicato nella tabella due.Ora incubare le cellule per almeno cinque minuti a temperatura ambiente. Quindi aggiungere cinque millilitri di RPMI contenente il 5% di FCS in ogni tubo. Sospendere accuratamente le cellule mediante vortexaggio da ciascun tubo. Trasferire un millilitro di sospensione in altri sei tubi seguendo lo schema di caricamento suggerito nel protocollo testuale; durante ogni trasferimento, è fondamentale non bagnare la parte superiore del tubo caricato. Per etichettare le cellule con CFSE, rimuovere i tappi dei tubi da 31 a 36 contenenti un millilitro di cellule e posizionare i tubi in posizione orizzontale accanto a ciascuno dei tubi.Per prima cosa, aggiungere 103 microlitri di PBS, espellendoli sulla parete superiore asciutta. Quindi aggiungere sette microlitri della soluzione madre di CFSE appropriata secondo la tabella tre del protocollo testuale e vorticare immediatamente il tubo. Ripetere questa procedura per i tubi raggruppati come indicato nella tabella tre.Assicurarsi che ogni provetta riceva un diverso stock di CFSE. Incubare tutte le provette per almeno cinque minuti a temperatura ambiente. Dopo aver atteso cinque minuti, lavare le cellule per completare l'etichettatura.Diluire ogni sospensione con nove millilitri di RPMI a temperatura ambiente con il 5% di FCS. Centrifugare le cellule a 300 ×g per 10 minuti a temperatura ambiente ed eliminare i soprannatanti mediante aspirazione utilizzando una pipetta trasferibile. Nel protocollo testuale viene presentata la preparazione di peptidi leganti per MHC classe I e MHC classe II. Questa sezione illustra come etichettare le cellule con questi peptidi.Prima di tutto, risospendere il pellet cellulare nel mezzo residuo, ad esempio passando i tubi su una griglia. Portare quindi il volume totale della sospensione cellulare a 250 microlitri nel nostro PMI contenente il 5% di FCS. Ogni pellet cellulare richiederà circa 200 microlitri di mezzo.Successivamente, aggiungere 250 microlitri delle soluzioni stock di peptidi precedentemente preparate elencate nella tabella cinque nei tubi designati. Seguire lo schema presentato nella tabella uno e assicurarsi di includere un tubo di controllo contenente solo PBS per il calcolo delle risposte delle cellule T. È fondamentale che ciascun epitopo peptidico e ciascuna concentrazione di peptidi sia assegnato a un singolo tubo e che ciò venga registrato chiaramente in base alla fluorescenza prevista delle cellule in questo tubo.Dato che la firma fluorescente di questo cluster definirà questo peptide, mescolare ogni sospensione cellulare mediante vortex e quindi incubare le cellule a 37 gradi Celsius per un'ora. Al termine dell'incubazione, procedere con il lavaggio delle cellule. In primo luogo, aggiungere cinque millilitri di RPMI ghiacciato con 5% FCS a ogni sospensione cellulare e risospendere le cellule capovolgendo i tubi.Quindi, aggiungere con attenzione sotto ogni sospensione cellulare tre millilitri di FCS freddo di ghiaccio come sedimento, centrifugando le cellule per 10 minuti a 300 G mantenuti a quattro gradi Celsius. Utilizzare un'accelerazione e una frenata lente per garantire che l'interfaccia della soluzione sia mantenuta in ogni provetta. Aspirare con cura l'RPMI, quindi aspirare il FCS lasciando indisturbato il pellet cellulare lavato.Dopo aver isolato i pellet, lavare nuovamente le cellule fino a ottenere i pellet cellulari lavati due volte. Sospendere le cellule in 10 millilitri di RPMI ghiacciato con il 5% di FCS e ripetere la centrifugazione; dopo la centrifugazione, eliminare i soprannatanti. Successivamente, raccogliere tutte le popolazioni in un nuovo tubo da 10 millilitri contenente sei millilitri di RPMI ghiacciato con il 5% di FCS, sedimentare le cellule raggruppate mediante centrifugazione ed aspirare il soprannatante con una pipetta trasferibile in questo punto dell'intero procedimento.Si possono generare sei replicati all'interno del saggio etichettando le cellule con impulso peptidico con sei diverse concentrazioni di CPD. Per prima cosa, aggiungere 11,4 millilitri di RPMI a temperatura ambiente contenente il 5% di FCS al pellet cellulare raccolto e risospendere accuratamente mediante pipettaggio. In secondo luogo, aggiungere 1,9 millilitri di sospensione cellulare a sei nuovi tubi da 10 millilitri etichettati da A a F, avendo cura di non bagnare la metà superiore del tubo.Per iniziare l'etichettatura delle cellule, utilizzare il tubo B senza tappo CPD e posizionare il tubo orizzontalmente lungo la parete asciutta. Aggiungere prima 92 microlitri di PBS, seguiti da un volume di soluzione madre CPD secondo la tabella quattro. Successivamente, vortexare la miscela. Ripetere questo passaggio con il tubo C due F, assicurandosi che ogni tubo riceva una soluzione madre CPD diversa, come indicato nella tabella quattro.Dopo aver miscelato tutti i tubi, lasciarli incubare per cinque minuti a temperatura ambiente. Quindi lavare le cellule due volte: prima ri-sospendendole in 10 millilitri di mezzo a temperatura ambiente. Secondo, centrifugarle; terzo, aspirare i soprannatanti con una pipetta di trasferimento.Quindi ripetere il processo. Ora raccogliere tutte le cellule dai tubi da A a F in un unico tubo con otto millilitri di mezzo freddo su ghiaccio.Raccogliere le cellule centrifugandole e procedere con l'iniezione delle cellule negli animali e successiva analisi mediante citometria a flusso. I dettagli sono forniti nel protocollo testuale. Un topo BC è stato immunizzato con virus vaccinia ricombinante che esprime epitopi di HIV V uno e le risposte a diversi epitopi sono state valutate utilizzando un saggio FTA a 252 parametri.Due varianti di epitopo, gag mute e FTL mute, non sono state espresse nel vettore e topi naïve sono stati iniettati anche con l'FTA. L'AT è stata discriminata rispetto alle cellule ospiti del topo mediante marcatura con PKH26 e le cellule FTAB sono state discriminate mediante colorazione con anticorpo B220 mediante citometria a flusso. Ciascuna delle sei repliche intra-animale è stata selezionata in base alla fluorescenza del CPD; gli obiettivi FTA che esprimevano le diverse concentrazioni di epitopi sono stati selezionati in base alla fluorescenza di CFSE e CTV.La frazione di lisi specifica di ogni replicato è stata valutata confrontando la morte cellulare nei cluster FTA di animali sensibilizzati rispetto ai corrispondenti cluster FTA di animali naïve. L'attività dei linfociti T helper è stata valutata confrontando l'upregolazione di CD69 nei linfociti B FTA di animali sensibilizzati rispetto ai corrispondenti cluster di linfociti B FTA di animali naïve. Da questa analisi, l'infezione da V-V-H-I-V ha generato le risposte CTL più forti contro l'epitopo immunodominante F two L del VV, con il 100% delle cellule bersaglio FDA caricate con 0,001 micromolare o più dell'epitopo rimosse dalla milza.Oltre alle risposte dei linfociti T citotossici, il saggio FTA ha misurato anche le risposte dei linfociti T helper valutando l'attivazione delle cellule FTAB, che esprimono l'epitopo legante la classe II del complesso maggiore di istocompatibilità H-I-V-M-H-C, HIV gag th. Questo ha dimostrato che si è verificata un'attivazione delle cellule B specifiche per l'antigene negli animali sensibilizzati, suggerendo la generazione di effettori delle cellule T helper specifici per HIV gag. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come generare un array fluorescente di cellule bersaglio composto da oltre 250 cellule bersaglio.

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Immunologia e Infezioni

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