DNA-RNA combinato fluorescente In situ Ibridazione (FISH) per studiare inattivazione del cromosoma X nelle cellule staminali embrionali di topo differenziata Femminile

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di studiare l'inattivazione del cromosoma X in cellule staminali embrionali di topo femmina differenziate per mezzo di DNA e RNA fluorescenti combinati simultaneamente in ibridazione C 2 o pesce D-N-A-R-N-A. Ciò si ottiene inducendo prima la differenziazione nelle cellule staminali embrionali di topo femmina. Come durante questo processo, che simula il normale sviluppo embrionale post-impianto, viene avviata l'inattivazione del cromosoma X, con conseguente miglioramento della trascrizione e dell'accumulo di RNA della cisti, codificando il futuro cromosoma X inattivo.

Il secondo passo consiste nel fissare le cellule staminali embrionali differenziate utilizzando la paraldeide. Successivamente, preparare le sonde per rilevare sia il DNA dal cromosoma X che l'RNA della cisti etichettando i frammenti di DNA con biotina o digo genina. Utilizzo della traduzione Nick.

Il passaggio finale consiste nell'eseguire la procedura D-N-A-R-N-A FISH. Le cellule staminali embrionali differenziate sono permeate, denaturate e ibridate alle sonde di pesce marcate, che vengono successivamente rilevate utilizzando anticorpi coniugati fluorescenti che rilevano la biotina o diggen in haps. In definitiva, la microscopia a immunofluorescenza è SU per mostrare la posizione dei due cromosomi nelle cellule femminili e per visualizzare l'espressione dell'RNA della cisti dal cromosoma X che subisce l'inattivazione.

Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ad altri metodi come i metodi FISH in cui l'RNA e il DNA vengono successivamente rilevati è che utilizzando il nostro protocollo, siamo in grado di rilevare entrambi i tipi di acido nucleico contemporaneamente nello stesso campione in meno di due giorni. Sebbene la combinazione di DNA e RNA, i pesci possono essere difficili da eseguire, poiché le condizioni ottimali per rilevare il DNA o l'RNA differiscono in modo significativo. Utilizzando il protocollo qui presentato, siamo in grado di rilevare l'esistenza di RNA e DNA derivati da entrambi i cromosomi X praticamente in tutte le cellule analizzate.

Questo ci ha permesso di studiare l'attivazione del cromosoma X come avviene durante la differenziazione delle cellule staminali embrionali di topo femmina o lo sviluppo anomalo del topo femmina. Sebbene questo metodo possa fornire informazioni sul processo di attivazione dell'X, che è un processo importante e affascinante che si verifica durante lo sviluppo embrionale precoce del topo, può probabilmente essere applicato anche ad altri sistemi biologici in cui è importante rilevare i trascritti di RNA derivati dalla cromatina nativa poiché gli RNA non codificanti sono sempre più apprezzati per l'importanza nei sistemi biologici e spesso gli approcci a singola cellula sono preferiti rispetto ad approcci alternativi dove vengono valutate intere popolazioni di cellule. Prevediamo che questo protocollo sarà utile per un'ampia comunità scientifica.

Le cellule staminali embrionali di topo femmina o E ESL vengono coltivate in condizioni standard ESL su piastre di coltura gelatinizzate rivestite con ORM di fibroblasti embrionali di topo per iniziare la procedura di induzione della differenziazione. Rimuovere il terreno ES dalla coltura ESL e lavare due volte con coltura cellulare PBS Aggiungere 1,5 millilitri di TRIPSIN EDTA preriscaldare a 37 gradi Celsius e incubare le cellule a 37 gradi Celsius per sette minuti. Dopo 3,5 minuti, agitare delicatamente il piatto per rompere le colonie.

Inattivare la tripsina EDTA aggiungendo 3,5 millilitri di terreno di differenziazione alle cellule, pipettare le cellule su e giù per ottenere una soluzione di singola cellula e raccoglierle in una provetta da 15 millilitri. Centrifugare per cinque minuti a 200 Gs.Dopo aver raccolto le cellule in 10 millilitri di terreno di differenziazione, aggiungere la sospensione cellulare a un piatto di coltura non gelatinizzato da 10 centimetri e incubare per un'ora. In un incubatore per colture cellulari, il MES sarà in grado di aderire al piatto di coltura non gelatinizzato, mentre le cellule ES rimarranno in sospensione.

Nel frattempo, posizionare i vetrini di vetro sterili in sei piastre a pozzetti, aggiungere lo 0,2% di gelatina e incubare per un minimo di cinque minuti. A temperatura ambiente dopo un'ora, raccogli il nat della coltura ESL prepl, che consisterà principalmente in ESL non aderenti. Dopo aver diluito la piastra E ESLs in piastre a sei pozzetti contenenti vetrini coprioggetti.

Iniziare questa procedura rimuovendo il terreno di differenziazione dalle colture di differenziazione e lavando due volte con PBS per colture cellulari. Assicurati di aggiungere PBS con attenzione per evitare che le cellule vengano lavate via. Fissare le cellule aggiungendo il 4% di para formaldeide PBS e incubando per 10 minuti a temperatura ambiente.

Dopo 10 minuti, rimuovere la paraformaldeide e lavare tre volte i vetrini coprioggetto con etanolo al 70%. Per preparare le sonde di DNA per la marcatura, diluire prima un microgrammo di ciascun rispettivo DNA in acqua in un volume totale di 16 microlitri. Quindi aggiungere quattro microlitri di genin di bue o soluzione di etichettatura della biotina mescolata mediante vortice e incubare a 16 gradi Celsius per 90 minuti.

Questo incorporerà la biotina o dig i nucleotidi marcati con l'ossigeno mediante traduzione NIC. Nel frattempo preparare le colonne G 50. Per rimuovere i nucleotidi non integrati, prendere una siringa da due millilitri, rimuovere lo stamper e aggiungere cotone sterilizzato nella siringa.

Aggiungere 50 g di palline e la soluzione per riempire la siringa. Quindi posizionare una siringa in una centrifuga per provette da 15 millilitri a 642 GS per un minuto. Dopo la centrifugazione, circa l'80% della siringa deve essere riempito con G 50 Dopo 90 minuti, aggiungere 40 microlitri di acqua a ciascuna miscela di reazione di traduzione NIC e trasferire la reazione alla colonna G 50.

Aggiungere una provetta vuota sotto la colonna e centrifugare a 642 Gs per due minuti. Raccogliere il flusso in una provetta di reazione. Misurare il volume del flusso con una pipetta e quindi aggiungere acqua per raggiungere un volume totale di 200 microlitri.

Per accelerare il flusso, aggiungere spermatozoi di salmone, DNA lievito TRNA di topo catturato 1D NA e due molari di acetato di sodio mescolati mediante vortex. Aggiungere 533 microlitri di etanolo al 100% ghiacciato e agitare la centrifuga a provette a 16, 200 G per 30 minuti a quattro gradi Celsius. Al termine della centrifugazione, rimuovere il surnatante e lavare il pellet due volte con centrifuga di etanolo al 70% a 16, 200 Gs per cinque minuti a quattro gradi Celsius e asciugare il pellet all'aria.

Quando il pellet è asciutto. Aggiungere 50 microlitri, una soluzione di ibridazione 50 plus e incubare a 37 gradi Celsius per 30 minuti. Per facilitare la dissoluzione prima della permeazione, reidratare le cellule fissate, scoprire gli scivolamenti rimuovendo il 70% di etanolo e aggiungendo PBS di coltura cellulare alle cellule.

Incubare per cinque minuti, ripetere per un totale di tre volte in modo da rendere permanenti le cellule. Rimuovere la coltura cellulare PBS e aggiungere lo 0,2% di pepina alle piastre a sei pozzetti. Incubare le piastre a bagnomaria a 37 gradi Celsius per quattro minuti.

Successivamente, rimuovere la pepina e inattivarla con acqua priva di RNA. Postfissare le cellule incubandole con aldeide paraforme al 4% PBS per cinque minuti a temperatura ambiente dopo la fissazione, lavare due volte con coltura cellulare o PBS per cinque minuti. Disidratare le cellule incubando con etanolo al 70% per tre minuti, etanolo al 90% per tre minuti ed etanolo al cento per cento per tre minuti.

Dopodiché, trasferire i vetrini di copertura dalle piastre a sei pozzetti e aggiungere asciugare i vetrini di copertura per diversi minuti. Invecchiare le cellule incubando i vetrini coprioggetti a 65 gradi Celsius per un'ora su una piastra calda. Nel frattempo, sonde di pesce pre-ibridate con rivestimento di topo 1D NA sommando insieme per ogni vetrino coprioggetto da analizzare.

25 microlitri di soluzione di ibridazione 50 plus. Un microlitro di cisti marcata con biotina, sonda un microlitro di ossigeno digo e sonda BAC marcata che rileva il cromosoma X e 0,5 microlitri di rivestimento di topo 1D NA miscelato mediante vortice e in natura a 99 gradi Celsius per cinque minuti. Incubare immediatamente a 37 gradi Celsius per 45 minuti per consentire al cot 1D NA di ibridarsi per ripetere le sequenze presenti nella sonda.

Una volta che le cellule sui vetrini coprioggetti sono invecchiate, posizionare 50 microlitri di tampone di maturazione su un vetrino e posizionare i vetrini coprioggetti sopra le celle rivolte verso il tampone di maturazione. Incubare a 65 gradi Celsius per due minuti. Fissare le celle trasferendo i vetrini di copertura nelle piastre a sei pozzetti preriempite con etanolo ghiacciato al 70% e incubare per cinque minuti.

Disidratare le cellule mediante successiva incubazione in etanolo al 70% per tre minuti, etanolo al 90% per tre minuti ed etanolo al 100% per tre minuti. Rimuovere i vetrini di copertura dalle piastre a sei pozzetti e lasciarli asciugare all'aria per diversi minuti. Spot pre-ibridato Sonda su un vetrino e incubatore con un vetrino coprioggetti sulla parte superiore.

Collocare i vetrini in una camera umidificata riempita con 50 millilitri di 50% IDE due XSSC e incubare per una notte a 37 gradi Celsius. Dopo l'incubazione notturna, il coperchio di trasferimento scivola dai vetrini a sei piastre a parete che sono state riempite con due preriscaldatori XSSC a 42 gradi Celsius. Incubare a 42 gradi Celsius per cinque minuti.

Rimuovete due XSSC e aggiungete il 50% di forma MI due XSSC. Incubare per 10 minuti a 42 gradi Celsius. Lavare con il 50% di forma IDE due X-S-S-C-A per un totale di tre volte per 10 minuti a 42 gradi Celsius per lavaggio.

Dopo il terzo lavaggio, rimuovere il 50% dei miei due XSSC e lavare i vetrini con tris saline tween o TST due volte per cinque minuti a temperatura ambiente per bloccare il punto 50 microlitri di tris saline BSA o T-S-P-S-A. Il suo vetrino scivola su nuovi vetrini e posiziona i vetrini capovolti sul vetrino, incuba per 30 minuti a temperatura ambiente in una camera oscura umidificata TST. Dopo 30 minuti, trasferire nuovamente i vetrini copricoperchio nelle piastre a sei pozzetti e lavare due volte per cinque minuti con TST per il primo punto di incubazione degli anticorpi, 50 microlitri di antigene di pecora e anticorpo per vetrino su nuovi vetrini e posizionare i vetrini coprioggetti capovolti sul vetrino incubare per 30 minuti a temperatura ambiente in una camera oscura umidificata A TST.

Successivamente, i vetrini coprioggetto vengono incubati con una serie di anticorpi marcati in fluorescenza per migliorare il segnale originale, come descritto nel manoscritto di accompagnamento. Dopo l'incubazione con una serie di anticorpi marcati in fluorescenza, disidratare le cellule mediante incubazione per tre minuti ciascuna in etanolo al 70%, etanolo al 90% ed etanolo al 100%. Rimuovere i vetrini di copertura dalle piastre a sei pozzetti e lasciarli asciugare all'aria per diversi minuti.

Infine, individua una goccia di mezzo di montaggio con dappy su ogni vetrino. Aggiungere un vetrino coprioggetti capovolto sulla parte superiore e sigillare i vetrini con lo smalto per unghie. Utilizzando questo protocollo per la combinazione D-N-A-R-N-A FISH, l'inattivazione del cromosoma X può essere visualizzata in cellule ES femminili differenziate.

Questa figura mostra un esempio rappresentativo di esperimento A-D-N-A-R-N-A fish in cui vengono rilevati contemporaneamente sia l'RNA della cisti che una regione del cromosoma X. L'RNA della cisti è un RNA non codificante essenziale per il processo di inattivazione del cromosoma X. Nella differenziazione dell'ESL femminile qui cisti, l'RNA viene rilevato utilizzando una sonda CD NA marcata con biotina, che viene visualizzata utilizzando anticorpi coniugati alla rumina e indicati in rosso.

Il cromosoma X viene rilevato utilizzando uno xigen in una sonda BAC marcata, che viene visualizzata utilizzando anticorpi coniugati a FITC indicati in verde. I nuclei sono controcolorati con DPI indicato in blu. In quasi tutte le cellule vengono rilevati due cromosomi x. Vengono rilevati sia grandi accumuli di cisti sui cromosomi X inattivi o sulle nuvole di cisti che l'espressione di cisti basali dal cromosoma X attivo o dai Pinpoints della cisti.

I punti di cisti non vengono rilevati in ogni nucleo perché, dopo la differenziazione, questa espressione di cisti basale cessa sul futuro cromosoma X attivo. Si noti che alcuni dei segnali puntiformi derivati dal cromosoma X si trovano all'interno delle nuvole di cisti, dimostrando così che la nuvola di cisti si sta effettivamente localizzando e codificando il cromosoma X una volta padroneggiato. Questa tecnica può essere eseguita in meno di due giorni e con un risultato affidabile se eseguita correttamente.

Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come indurre la differenziazione delle cellule staminali embrionali femmina di topo, come fissare queste cellule e come prepararle per consentirti di eseguire l'esecuzione combinata di D-N-A-R-N-A fish. Ricorda che è importante per il successo dei tuoi esperimenti mantenere costanti le temperature e i tempi di incubazione come indicato in questo protocollo. Inoltre, è importante lavorare in un ambiente pulito.

Se stai utilizzando un tipo di cellula diverso o stai studiando un sistema biologico diverso, potrebbe essere necessaria una certa ottimizzazione per fornirti un risultato ottimale. Buona fortuna con i tuoi esperimenti.