Un canale Cell-allegato patch-clamp registrazione

L'obiettivo generale di questa procedura è misurare la corrente elettrica attraverso un singolo canale ionico. Ciò si ottiene esprimendo prima eterologo il canale ionico di interesse in cellule con cui è facile lavorare e che sono favorevoli agli obiettivi sperimentali. Il secondo passo consiste nell'utilizzare una pipetta lucidata a fuoco per ottenere una tenuta stabile sulla membrana cellulare.

Successivamente, lo sperimentatore dovrebbe determinare il numero di canali presenti nella patch e, se si tratta di una corrente di registrazione a canale singolo, il passaggio finale consiste nell'elaborare e analizzare i dati. In definitiva, la registrazione della corrente da singoli canali ionici viene utilizzata per studiare le proprietà biofisiche con cui agiscono queste proteine di membrana, che costituiscono la base per il modo in cui comunicano le cellule neuronali e altre cellule eccitabili. A differenza dei metodi che consentono di misurare le correnti attraverso più canali ionici attivi, il vantaggio di questo approccio è che la misurazione delle correnti attraverso un singolo canale ionico consente di visualizzare e separare un'ampia gamma di modelli di risposta inerenti a un particolare canale.

Questo metodo può essere utilizzato per rispondere a domande chiave nel campo delle neuroscienze, come i modulatori fisiologici e terapeutici influenzano la comunicazione tra i neuroni. In generale, le persone che sono nuove a questa tecnica avranno difficoltà perché è difficile ottenere registrazioni a basso rumore che contengono un solo canale ionico. Quando si tenta per la prima volta questo metodo, è davvero utile vedere qualcuno che lo fa perché per ottenere una tenuta davvero stabile, che è la cosa più importante in questo metodo, è necessario avvicinarsi delicatamente alla cella con l'angolazione particolare e, soprattutto, è necessario essere persistenti per prepararsi alla trasfezione.

Le cellule HEK 2 93 vengono piastrate in piastre da 35 millimetri con un giorno di anticipo per portarle al 50-60% di confluenza in una provetta sterile. Preparare la miscela di trasfezione. Aggiungere un microgrammo di ogni CDNA di interesse, 315 microlitri di acqua distillata doppia e 350 microlitri di cumuli da 42 millimolari.

Infine, aggiungere 35 microlitri di cloruro di calcio goccia a goccia per formare il precipitato. Agitare il tubo per cinque secondi e aggiungere 175 microlitri di sospensione di trasfezione a ciascuna delle quattro piastre. Impiattato il giorno prima.

Incubare le cellule a 37 gradi Celsius per due ore. Dopo l'incubazione, rimuovere il terreno e lavare con PBS. Successivamente, aggiungere due millilitri di terreno di coltura, integrato con due millimolari di cloruro di magnesio per prevenire l'eccitotossicità mediata dal recettore MDA.

Per prima cosa estrarre due pipette di registrazione simmetriche dal vetro silicato di ragazzo utilizzando un estrattore verticale. Successivamente, la lucidatura a fuoco è necessaria per ottenere il diametro e la resistenza adeguati. Successivamente impostare la registrazione aprendo il software di acquisizione dati QUB e selezionando la finestra di acquisizione.

Sotto layout. Aprire un nuovo file di dati QUB facendo clic su nuovi dati e inserire i parametri sperimentali da utilizzare. Regolare la scala dell'ampiezza a 0,1 volt per pico amp facendo clic con il pulsante destro del mouse sul file di dati, selezionando le proprietà e facendo clic sulla scheda dei dati.

Dopo aver sostituito il terreno con due millilitri di PBS contenente calcio e magnesio, montare il piatto di cellule sul tavolino del microscopio. Concentrati sul campo cellulare utilizzando la microscopia a contrasto di fase per valutare che le cellule siano sane e ben attaccate alla piastra in modalità monostrato. Passa al rilevamento della fluorescenza per verificare che la trasfezione sia andata a buon fine.

Quindi, impostare i parametri per la registrazione a canale singolo. Impostare la modalità su voltage clamp e applicato voltage a più 100 millivolt con il voltage mantenendo il comando. In posizione off, selezionare il pulsante del test di tenuta in base alla fluorescenza e all'aspetto generale.

Scegliere una cella per verificare con il contrasto di fase che la cella sia ben attaccata alla piastra, che abbia un'ampia porzione della superficie cellulare esposta per il patch e che abbia un aspetto sano. Riempire una pipetta appena lucidata con una soluzione adatta ai recettori NMDA e agli esperimenti collegati alle cellule e sbattere delicatamente per rimuovere eventuali bolle d'aria. Fissare la pipetta di registrazione sullo stadio della testina dell'amplificatore e assicurarsi che il filo d'argento sia immerso nella soluzione della pipetta per evitare che la soluzione del bagno entri nella pipetta.

Durante l'avvicinamento, utilizzare una piccola siringa di plastica collegata al supporto della pipetta per applicare delicatamente una pressione positiva. Quindi, utilizzare il micromanipolatore per dirigere la pipetta nella vasca. Chiudendo il circuito elettrico, posizionarlo direttamente sopra la cella selezionata per il patching.

Prendere nota dell'oscilloscopio all'ingresso nella vasca da bagno. La resistenza della pipetta deve rientrare nell'intervallo ottimale durante il monitoraggio visivo della posizione del tubo al microscopio e della sua resistenza elettrica sull'oscilloscopio. Continuare l'approccio con piccoli incrementi fino a quando la pipetta non colpisce delicatamente la cellula.

Il segnale di test diminuirà leggermente per indicare una maggiore resistenza. Per formare un sigillo, sollevare la siringa e applicare delicatamente una leggera pressione negativa attraverso il tubo laterale. Tirando la siringa, la formazione della guarnizione dello stantuffo è indicata da un completo appiattimento della forma d'onda del segnale di prova sull'oscilloscopio.

Sull'amplificatore. Commutare l'interruttore del comando esterno da test di tenuta a disattivato. Commutare il comando di mantenimento della tensione da off a positivo e aumentare il guadagno da 10 x a 100 x.

Osservare l'oscilloscopio per l'attività del canale, che se presente verrà visualizzata come deflessioni quadrate verso il basso dalla linea di base precedentemente piatta. Se l'attività del canale viene visualizzata sull'oscilloscopio, iniziare ad acquisire i dati nel file digitale precedentemente aperto in QUB premendo il pulsante di riproduzione, seguito dal pulsante di registrazione. Per interrompere l'acquisizione dei dati, premere il pulsante di arresto in QUB e salvare il file QDF su un segnale che non si appiattisce completamente, oppure una linea di base che diventa rumorosa e instabile può indicare una tenuta debole.

In questo caso, rimuovere ed eliminare la pipetta e ripetere i passaggi successivi con una pipetta nuova fino a ottenere una chiusura adeguata. Per iniziare il processo di analisi dei dati, aprire il file di dati registrato in QUB e ispezionare la traccia corrente nell'interfaccia preliminare. Sotto layout.

Rimuovere il filtro digitale per visualizzare la traccia registrata a piena larghezza di banda deselezionando la casella etichettata fc. Scansiona visivamente la traccia per individuare irregolarità e artefatti Breve. I picchi di corrente possono essere corretti evidenziando una regione pulita adiacente della stessa classe di conduttanza.

Facendo clic con il pulsante destro del mouse e selezionando prima imposta buffer di cancellazione, ingrandisci il picco fino a quando non sono visibili i singoli punti di campionamento. Selezionare la regione da sostituire evidenziando solo questa regione. Fare clic con il pulsante destro del mouse e selezionare Cancella per correggere la linea di base per l'intero record.

Definire la linea di base con corrente zero selezionando una parte iniziale del record in cui la linea di base è stabile. Evidenziare il pulsante destro del mouse e selezionare imposta linea di base. Quando viene visualizzata la linea guida di base, confermare mediante ispezione visiva che rappresenti accuratamente il livello di base.

Identificare i punti del record in cui la linea di base dei dati grezzi si discosta visibilmente dalla linea di base impostata. Correggere questo problema selezionando una piccola sezione della linea di base all'interno della regione di deviazione. Fare clic con il pulsante destro del mouse e selezionare il comando Aggiungi un nodo di base.

Quando il record contiene periodi occasionali con rumore eccessivo o artefatti, che non possono essere facilmente corretti, queste parti devono essere eliminate, ma prima devono essere suddivise in segmenti consecutivi. Evidenzia immediatamente prima della regione da scartare. Fare clic con il pulsante destro del mouse e selezionare il segmento di interruzione.

Successivamente, evidenzia la sezione da scartare facendo clic con il pulsante destro del mouse, seleziona, elimina e premi invio per idealizzare i record. Passa all'interfaccia MOD in layout. Nel pannello di visualizzazione dei dati, selezionare una piccola parte del record contenente sia gli eventi chiusi che quelli aperti.

Spostare il cursore nel pannello ad alta risoluzione sottostante e, all'interno della traccia selezionata, evidenziare un segmento pulito rappresentativo della linea di base. Sposta il cursore sul pannello del modello sottostante, fai clic con il pulsante destro del mouse sul quadrato nero, che rappresenterà lo stato chiuso e seleziona Afferra. Ripetere la procedura per le aperture dei canali evidenziando una parte dei tratti che rappresenta la conduttanza aperta.

Fare clic con il pulsante destro del mouse sul quadrato rosso nel pannello del modello e selezionare Afferra. Eseguire l'idealizzazione per la parte selezionata del record selezionando il pulsante SEL in Origine dati. Quindi fare clic con il pulsante destro del mouse sulla scheda idealizzata sotto la sezione di modellazione nel pannello a comparsa.

Verificare che i parametri desiderati per l'analisi siano corretti, quindi fare clic su Esegui. Il risultato dell'idealizzazione, insieme all'istogramma dell'ampiezza per la porzione selezionata, viene sovrapposto ai dati per consentire l'ispezione visiva dell'idealizzazione. Se necessario, regolare i parametri di idealizzazione per ottenere il miglior risultato e ripetere, eseguire l'idealizzazione per l'intero file selezionando il pulsante del file sotto l'origine dati.

Quindi fare clic con il pulsante destro del mouse sulla scheda idealizzata e fare clic su Esegui. Vengono visualizzati i risultati dell'intero file. Sovrapposti ai dati, ispezionare attentamente la corrispondenza tra la traccia idealizzata e i dati registrati.

Occasionalmente vengono erroneamente identificati eventi che possono essere esclusi dalla traccia idealizzata. Seleziona l'evento falso, fai clic con il pulsante destro del mouse e seleziona unisciti a IDL. Qui sono mostrate le correnti di soli ioni calcio attraverso un singolo recettore NMDA in una cella HEK 2 93.

Utilizzando la tecnica del patch clamp attaccato alla cella, l'idealizzazione dei dati produce istogrammi di ampiezza, che si adattano perfettamente a due distinte classi di conduttanza in questa cella. Registrazione collegata da HEK 2 93 celle, un canale meno sensibile viene attivato da meno 20 millimetri. Pressione di mercurio attraverso la pipetta patch durante l'applicazione costante della tensione.

La linea tratteggiata rossa indica il livello di corrente zero. Queste registrazioni dai canali nativi mostrano un'attività continua del recettore NMDA registrata dal soma di un neurone che è stato dissociato dalla corteccia prefrontale di un embrione di ratto e mantenuto in coltura per cinque o 27 giorni. Una volta masterizzata, questa procedura può essere eseguita in 30 minuti o un'ora a seconda della durata della registrazione.

Seguendo questa procedura, è possibile eseguire altri metodi come l'analisi cinetica e la modellazione dello stato per determinare il meccanismo di gating di un canale e stimare le velocità di reazione. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come registrare e iniziare ad analizzare le correnti attraverso una proteina del canale ionico.