Un metodo di Permeabilization di Drosophila Gli embrioni per saggi di piccole molecole di attività

L'obiettivo generale del seguente esperimento è quello di preparare embrioni vitali di drosophila con un guscio d'uovo permeabile per testare la bioattività di farmaci o tossine introdotte a piccole molecole. Ciò si ottiene trattando prima gli embrioni in fase di sviluppo con candeggina diluita per rimuovere gli strati esterni del guscio d'uovo corionico. Il secondo passo consiste nel permeare gli embrioni con un solvente che esaurisce il sottile strato ceroso di guscio d'uovo che blocca i soluti di piccole molecole.

Il terzo passo consiste nel trattare gli embrioni con un farmaco o una tossina e un colorante per misurare contemporaneamente la permeabilità del guscio d'uovo e introdurre un composto di interesse. Dopo un ulteriore sviluppo, gli embrioni possono essere sottoposti a imaging diretto o elaborati per l'immunoistochimica. In definitiva, i risultati possono mostrare l'attività di un farmaco o di una tossina sullo sviluppo dei tessuti, come determinato dalla microscopia a fluorescenza con reagenti immunologici o legami vitali.

Oggi presenterò il nostro metodo di permeazione di embrioni di drosofila per saggi di attività di piccole molecole. I principali vantaggi di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti come l'uso di solventi organici convenzionali come l'eptano permeano. Il guscio dell'uovo è che il nostro solvente per la permeazione dell'embrione, o EPS, è privo di acqua e relativamente non tossico.

Queste proprietà facilitano i trattamenti embrionali in cui l'esposizione ai solventi può essere controllata in modo più preciso e può essere effettuata in mezzi fisiologicamente rilevanti, entrambi i quali si traducono in una maggiore vitalità dell'embrione. Ho avuto l'idea di questo metodo per la prima volta quando ho pensato a come rimuovere lo strato ceroso del guscio d'uovo. Essendo uno sciatore, ho riflettuto sull'uso comune del solvente agli agrumi per rimuovere la cera residua dalla soletta degli sci.

Questo mi ha spinto a tradurre questa applicazione per il guscio d'uovo dell'embrione di mosca e, dopo alcuni tentativi ed errori, ha portato alla risoluzione della composizione dell'EPS, preparare gabbie di popolazione con almeno 500 mosche in età di accoppiamento dei ceppi desiderati. Le gabbie devono essere dotate di succo d'uva di 10 centimetri. Aerare con una piccola quantità di pasta di lievito.

Cambia queste piastre due volte al giorno. Dopo alcuni giorni, le mosche saranno condizionate alla coltura e deporranno gli embrioni più regolarmente. L'EPS è composto da tensioattivi e soluzioni solventi limitanti ed è buono per due mesi.

Se conservati a temperatura ambiente, riscaldare i tensioattivi a 37 gradi Celsius quando si mescola l'EPS fresco Per il trattamento EPS gli embrioni vengono maneggiati con cestelli realizzati da tre centimetri, quindi tubo di polipropilene da 50 millilitri e rete di nylon ruvida. I bordi in plastica si fondono più facilmente con la rete durante le fasi di sviluppo successive. Gli embrioni vengono anche trattati con cesti ricavati dai tappi di provette da 50 millilitri.

Il tappo è forato e intagliato e l'infilatura tra il tappo e il tubo fissa la rete. In alternativa, viene utilizzata una camera di scorrimento a macchina locale e preparata con un pezzo di permeabile all'ossigeno. Fissare la membrana sopra l'apertura da un anello di contenimento per raccogliere gli embrioni.

Metti un piatto d'uva fresca con pasta di lievito sulla coltura al mattino. Dopo un'ora, cambiare la piastra e gettare la prima piastra raccolta. Lascia che la seconda piastra raccolga gli embrioni per due ore a 25 gradi Celsius.

Quindi raccogli il piatto e trasferiscilo a 18 gradi Celsius.Lì. Lasciare che gli embrioni si sviluppino fino allo stadio desiderato. Quando gli embrioni sono pronti, decapparli prima del trattamento EPS.

Sciacquarli dal piatto nel cestello del mosto con acqua e l'uso di un pennello. In secondo luogo, sciacquateli con acqua corrente delicata per rimuovere eventuali detriti. Terzo, immergerli in candeggina al 50% per due minuti con circolazione periodica della soluzione di candeggina.

Quindi sciacquarli prontamente con acqua corrente. Ora riempi sei piatti da 60 millimetri ciascuno con 10 millilitri di PBS per funzionare come bagni e fai una diluizione da uno a 40 di stock di EPS in MBIM agitando la miscela. Si formerà un'emulsione bianca, asporterà l'acqua in eccesso dal fondo del cestello a rete con una salvietta e immergerà gli embrioni nella diluizione dell'EPS con un movimento vorticoso costante.

Dopo aver fatto roteare gli embrioni in EPS per 30 secondi, rimuoverli e asciugare la soluzione in eccesso. Quindi spostare il cestello tra i sei bagni PBS, spruzzando delicatamente per risciacquare e procedere con il trattamento di tintura e farmaci. L'ottimizzazione della permeabilità e della vitalità è la parte più complicata di questo protocollo.

La permeabilità è sensibile allo stadio di sviluppo dell'embrione. La temperatura alla quale gli embrioni vengono invecchiati può anche variare notevolmente tra i singoli ceppi di mosche. I migliori parametri per la diluizione dell'EPS e il tempo di esposizione devono essere ottenuti empiricamente.

Per prima cosa, preparare una soluzione da 50 micromolari di colorante di acido carbossilico fantascientifico in M-B-I-M-T, un millilitro in una provetta per microfiche è sufficiente. In questa fase è possibile aggiungere una tossina o un farmaco per i trattamenti acuti a vortice da mescolare. Trasferire gli embrioni di perme dal cestello al tubo di microfuga con un pennello.

Tappate il tubo e capovolgetelo più volte. Quindi caricare la provetta su un mutageno e lasciarla incubare per 15 minuti. Dopo che gli embrioni si sono depositati, rimuovere il colorante con una pipetta e aggiungere nuovamente un millilitro di M-B-I-M-T per un lavaggio. Resus.

Sospendi gli embrioni, lasciali depositare e sostituisci il M-B-I-M-T. Quindi fallo per una terza e una quarta volta. Una volta completato il quarto lavaggio, rimuovere tutto l'M-B-I-M-T e spostare gli embrioni in un cestello di sviluppo per lunghi periodi di sviluppo.

Per il cestello di sviluppo prima, preparare il cestello con un risciacquo di etanolo al 70% e poi di acqua, asciugare il sangue con una salvietta da laboratorio. Al termine. Quindi, trasferire il cestello in un piatto da 60 millimetri con sei millilitri di terreno di incubazione contenente il farmaco o la tossina desiderata.

Trasferire gli embrioni nella rete del cestello con un pennello facendo cadere delicatamente il terreno di incubazione su di essi, disperdere gli embrioni in un monostrato. Fare attenzione a non intrappolare bolle d'aria sotto la rete. Per utilizzare prima una camera di scorrimento, preparare la camera, capovolgere la camera di slitta e mettere una sottile goccia di grasso per vuoto attorno al bordo dell'apertura.

Caricare successivamente, 150 microlitri del mezzo desiderato sulla superficie della membrana do all'interno dell'apertura. Ora, trasferisci gli embrioni nel terreno usando un pennello e disperdili sulla membrana. Terminare applicando un vetrino coprioggetto circolare da 25 millimetri appiattindo il mezzo.

Applicare una leggera pressione lungo il perimetro per garantire la tenuta. C'è un forte effetto dell'allevamento di embrioni a 18 gradi Celsius sulla loro capacità di essere permeati dall'EPS e di assorbire il colorante nelle fasi avanzate dello sviluppo. Ciò è illustrato dall'assenza di assorbimento di Rumina BD negli embrioni trattati con EPS allevati a 25 gradi Celsius L'assorbimento del colorante acido carbossilico fantascientifico visto qui in rosso rivela i vari livelli di permeabilità tipicamente osservati negli embrioni trattati con EPS.

La distribuzione dinamica del colorante rosso lontano durante lo sviluppo e il suo consolidamento nel tuorlo all'interno dell'intestino sviluppato visto con l'autofluorescenza blu rivelano un criterio utilizzato per valutare la vitalità. Il colorante fantascientifico può anche determinare l'embrione permeabile in precedenza dopo la fissazione della formaldeide e l'immunocolorazione. Dopo che gli embrioni EPS sono stati trattati con colorante fantascientifico e tossina metilmercurio, vengono colorati con Antifa due visti in verde per etichettare i motoneuroni e anti E lab in rosso per etichettare i corpi cellulari dei neuroni.

La tintura fantascientifica è pseudo colorata in blu. Il metilmercurio ha un effetto sul modello dei corpi cellulari dei neuroni del cortone contrassegnati dalle frecce negli embrioni del trattamento di controllo. Questi neuroni hanno una fascia più ordinata, due mostrati qui in bianco illustrano la normale ramificazione dei neuroni segmentali nel trattamento di controllo notato dalle punte di freccia.

In confronto, il trattamento con metilmercurio cambia il modello di ramificazione come indicato dalle frecce verdi continue. La freccia verde cava segna il punto in cui la ramificazione è stata spostata. Una volta padroneggiati, i trattamenti di permeazione embrionale con questa tecnica possono essere eseguiti in circa 30 o 40 minuti se eseguiti correttamente.

Seguendo questa procedura, è possibile eseguire altri metodi come la fissazione e l'immunocolorazione degli embrioni per rispondere a ulteriori domande, come ad esempio quali tessuti specifici sono presi di mira da un farmaco o da una tossina durante lo sviluppo. Vi ringrazio per aver assistito a questa procedura e vi auguro buona fortuna per mettere questi metodi al lavoro nel vostro laboratorio.