Name: High-throughput Analisi dei mammiferi olfattive Recettori: Misurazione del recettore Attivazione tramite Luciferase Activity (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-06-02T14:15:00.000+00:00
Duration: 12 min 2 s
Description: Scopri un metodo ad alto rendimento per misurare l'attivazione dei recettori olfattivi mediante saggio luciferasi. Questa tecnica utilizza cellule H3A transfected per quantificare rapidamente le risposte agli odori.

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Questo lavoro è stato sostenuto da DC013339 R01, R03 DC011373, e Ruth L. Kirschstein Servizio National Research Award T32 DC000014. Una parte del lavoro è stato eseguito utilizzando il Monell chemosensory Receptor segnalazione core, che è supportato, in parte, da un finanziamento della P30 DC011735 NIH-NIDCD core Grant. Gli autori ringraziano C. Sezille aiuto con la raccolta dei dati.

1. Coltura di cellule Hana3A <ol><li> Preparare supporti M10 completandolo mezzo minimo essenziale (MEM) con il 10% (v / v) di FBS. </li><li> Cultura di manutenzione <ol><li> Mantenere le cellule in mezzi M10. NOTA: I vettori di espressione per RTP1L, RTP2, REEP1, e G αolf conferiscono resistenza puromicina alle cellule Hana3A, ma mantenendo le cellule con questo antibiotico non influenzano significativamente i risultati del test. </li><li> Subculture con un rapporto di 01:08 a 10 centimetri piatti ogni 2-3 giorni. </li><li> Incubare a 37 ° C con 5% di CO 2. </li></ol></li></ol> 2. Cellule placcatura per Transfezione <ol><li> Aspirare il terreno da un confluente 10 centimetri piatto 100% delle cellule Hana3A. </li><li> Lavare le cellule con l&#39;aggiunta di 10 ml di PBS, roteando il piatto, e aspirare il PBS. </li><li> Aggiungere 3 ml di 0,05% tripsina / EDTA e attendere cellule di dissociarsi (circa 1 min). </li><li> Inattivare la tripsina aggiungendo 5 ml di M10 e rompere grumi di cellule triturando circa 10x &amp;# 160, con una pipetta 10 ml. Dispensare con cautela per evitare l&#39;introduzione di bolle d&#39;aria nella media. </li><li> Per ciascuna piastra da 96 pozzetti, trasferire 1 ml di cellule in una provetta conica da 15 ml, centrifugare a 200 xg per 5 min, e aspirare il surnatante senza disturbare il pellet. </li><li> Risospendere le cellule in 6 ml M10 per 1 ml di cellule trasferito nel passaggio 2.5. </li><li> Pipettare 50 ml di cellule a ciascun pozzetto di una piastra da 96 pozzetti e incubare una notte a 37 ° C con 5% di CO 2. </li></ol> 3. Trasfezione di recettori olfattivi <ol><li> Preparazione di DNA plasmidico <ol><li> Preparare plasmide DNA tramite un protocollo privo di endotossine. NOTA: kit di preparazione uso del DNA plasmide designati &quot;privo di endotossine&quot;, o aggiungere un passo di estrazione fenolo-cloroformio al DNA protocollo di preparazione plasmide. </li><li> Diluire DNA ad una concentrazione di 100 ng / ml in tampone TE. </li></ol></li><li> Osservare le cellule placcato (Passo 2.7) per garantire una corretta confluenza di ravvicinamentotamente 30-50% per bene e tornare a incubatore. NOTA: Mentre questa confluenza non è ottimale per il reagente di transfezione lipidi, una confluenza del 30-50% in questa fase è ottimale per misurare l&#39;attività della luciferasi 24 ore dopo la trasfezione. </li><li> Preparazione di Transfezione Mix <ol><li> Pipetta RTP1S-PCI, M3-R-PCI, PCRE-luc, e pSV40-RL plasmidi in MEM medio per i volumi specificati nella tabella 1 per rendere il plasmide mix (i volumi indicati si intendono piastra a 96 pozzetti). <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:356px;"><tbody><tr height="22"><td colspan="3" height="22" style="height:22px;width:356px;"> Mix plasmide </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;"></td><td> per pozzetto </td><td> per piastra a 96 pozzetti </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;"> MEM </td><td> - </td><td> 500 microlitri </td></tr><trheight = &quot;21&quot;&gt; <td height="21" style="height:21px;"> RTP1S-PCI </td><td> 5 ng </td><td> 480 ng </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;"> M3-R-PCI </td><td> 2.5 ng </td><td> 240 ng </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;"> PCRE-luc </td><td> 10 ng </td><td> 960 ng </td></tr><tr height="22"><td height="22" style="height:22px;"> pSV40-RL </td><td> 5 ng </td><td> 480 ng </td></tr></tbody></table> Componenti Tabella 1. Plasmidi mix. Per oltre e per volumi piastra a 96 pozzetti di RTP1S-PCI, M3-R-PCI, PCRE-luc, e pSV40-RL, e MEM. </li><li> Per ogni piastra a 96 pozzetti, diluire 18 ml di lipidi trasfezione reattivo in 450 microlitri di media MEM. </li><li> Pipetta plasmide mix (dal punto 3.3.1), rodopsina-tagged recettore olfattivo PCI plasmide (Rho-OR-PCI), e la miscela di trasfezione lipidico (dal punto 3.3.2) per rendere il complesso dettagliata <strong&gt; Tabella 2. Mescolare la soluzione da triturazione e incubare a temperatura ambiente per 15 min. Arrestare la reazione aggiungendo M10 conformemente alla tabella 2. NOTA: questa reazione è il tempo sensibile e non dovrebbe essere permesso di continuare per più di 30 min. Il pozzo + 10% calcolo è importante garantire un volume sufficiente per passi successivi. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr height="21"><td colspan="3" height="21" style="height:21px;width:472px;"> Complesso </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;"></td><td> per pozzetto </td><td> per pozzetto + 10% </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;"> Mix plasmide </td><td> 4.2 microlitri </td><td> 4.58 microlitri </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;"> Rho-O-PCI </td><td> 0.05 ng </td><td> 0,06 ng </td></tr><trheight = &quot;21&quot;&gt; <td height="21" style="height:21px;"> Mix di trasfezione Lipid </td><td> 4.2 microlitri </td><td> 4.58 microlitri </td></tr><tr height="22"><td height="22" style="height:22px;"> M10 </td><td> 41.7 ml </td><td> 45,83 microlitri </td></tr></tbody></table> Tabella 2. Componenti complessi. Per bene e per oltre + 10% di volumi della miscela di plasmide (Tabella 1), il plasmide recettore olfattivo (Rho-OR-PCI), e mescolare lipidi trasfezione. M10 viene aggiunto per estinguere la seguente reazione a 15 minuti di incubazione a temperatura ambiente. </li></ol></li></ol><ol start="4"><li> Toccare il supporto sulle piastre di cella. </li><li> Pipettare 50 ml di complesso a ciascun pozzetto e incubare una notte a 37 ° C con 5% di CO 2. </li></ol> 4. Odore stimolazione <ol><li> Osservare le cellule trasfettate per garantire una corretta confluenza del 50-80% per bene e tornare a incubatore. NOTA: Se le cellule sono meno di 50Letture% confluenti, lucciola luciferasi e Renilla luciferasi può essere troppo basso per la misurazione di attivazione del recettore. Si consideri scartando la piastra. </li><li> Preparare 1 M soluzioni madre di ogni odore in DMSO. </li><li> Preparare le soluzioni di stimolazione odore di CD293 medio. <ol><li> Per gli esperimenti di screening, diluire soluzione stock di odore a 100 micron. Anche preparare un controllo senza odore (CD293 solo) per controllare per OR attivazione sfondo. NOTA: Per gli esperimenti di screening, ogni coppia O / odore è stato testato soltanto una volta per ogni esperimento. Poiché alcuni diffusione odore di tutti i pozzetti è possibile, si raccomanda di stimolare con un odorizzante per ciascuna piastra. </li><li> Per gli esperimenti dose-risposta, preparare sette diluizioni seriali di 10 volte di soluzione odore magazzino in triplice copia a partire da 1 mm per ciascun recettore. Anche preparare le stesse diluizioni odore in triplicato per cellule transfettate vettore vuoto al fine di controllare l&#39;attivazione odore sfondo. NOTA: Per gli esperimenti dose-risposta, ogni odor trattamento concentrazione dovrebbe essere condotto in triplice copia. </li></ol></li><li> Toccare il supporto sulle piastre di cella. </li><li> Pipettare 25 ml di soluzione di stimolazione odore ad ogni pozzetto e incubare per 4 ore. </li></ol> 5. Misura o attività via Luciferase Assay <ol><li> Risospendere substrato di luciferasi di lucciola secondo le istruzioni del produttore e conservare a -80 ° C. </li><li> Scongelare 1 ml di substrato della luciferasi di lucciola per piastra a 96 pozzetti. </li><li> Preparare fresco reazione luciferasi di lucciola dissetante e Renilla luciferasi reagente substrato (5 microlitri luciferasi quencher / Renilla luciferasi substrato per 1 ml di tampone). NOTA: circa 1 ml di reagente è necessario per piastra a 96 pozzetti. </li><li> Preparare il lettore luminescenti micropiastre. Aprire il software lettore di micropiastre. All&#39;interno l&#39;icona di sistema: <ol><li> Sotto il &quot;Pre-riscaldamento&quot; Tab, selezionare la casella &quot;ON&quot; e impostare la temperatura della macchina a 25 °; C. </li><li> Nella scheda &quot;Dispenser&quot;, prime ciascun erogatore con 1.000 ml di etanolo al 70% seguita da 1.000 ml di acqua distillata. NOTA: Utilizzare aliquote separate di alcool e acqua per ogni erogatore. Etanolo è utilizzato per disinfettare i dispenser, e acqua rimuove l&#39;etanolo residuo. </li><li> Prime ciascun erogatore con 1.500 ml di aria (rimuovi dispenser da liquido). NOTA: adescamento di aria assicura che i substrati luciferasi non sono diluiti con acqua residua. </li><li> Dispenser Prime 1 con 1.080 ml di substrato luciferasi di lucciola (dal punto 5.2). Dispenser Prime 2 con Renilla substrato luciferasi (dal punto 5.3). NOTA: Fare attenzione a non contaminare i substrati luciferasi. Adescamento con i substrati luciferasi riempie lo spazio morto nei dispensatori di reagenti. </li></ol></li><li> Impostare il seguente protocollo di leggere sia lucciola e Renilla luciferasi luminescenza. All&#39;interno del software associato al lettore di micropiastre, ONUder menu &quot;File&quot;, cliccare su &quot;Nuova attività&quot;. Evidenziare &quot;Protocolli&quot; e cliccare su &quot;Crea nuovo&quot;. Nella finestra successiva, il cerchio accanto a &quot;protocollo standard&quot; dovrebbe essere selezionata. Fare clic su &quot;OK&quot;. Fare doppio clic su &quot;Procedura&quot; sul lato sinistro dello schermo. <ol><li> Dispensare 10 ml di substrato luciferasi di lucciola a tutti i pozzetti con dispenser 1. Sotto il menu &quot;Azioni&quot;, fai clic su &quot;Dispense&quot;. Nella finestra &quot;Dispensare Step&quot;, impostare &quot;Dispenser&quot; a 1 &quot;Adescamento&quot; a nessuno, &quot;Dispense Volume&quot; a 10 microlitri e &quot;Rate&quot; a 225 ml / sec. Fare clic su &quot;OK&quot;. </li><li> Agitare la piastra per 30 sec. Sotto il menu &quot;Azioni&quot;, fai clic su &quot;Shake&quot;. Nella finestra &quot;Shake Step&quot;, impostare &quot;Intensity&quot; per Medio e &quot;Durata&quot; alle 0:30 MM: SS. Fare clic su &quot;OK&quot;. </li><li> Leggi la luminescenza di tutti i pozzi per 0,5 sec per bene. Sotto il menu &quot;Azioni&quot;, fare clic su &quot;Leggi&quot;;. Nella finestra &quot;Leggi Step&quot;, impostare &quot;Metodo di rilevazione&quot; a luminescenza, &quot;Leggi Type&quot; per Endpoint, &quot;Integrazione Time&quot; a 00:00:50 MM: SS: ss, &quot;Filter Sets&quot; a 1 &quot;Emissione&quot; Hole, &quot;Ottica Position&quot; a Top, &quot;Gain&quot; per 135, e &quot;Leggi altezza&quot; a 1.00 mm. Fare clic su &quot;OK&quot;. </li><li> Dispensare 10 ml di Renilla substrato luciferasi a tutti i pozzetti con dispenser 2. Impostare le condizioni della Fase 5.6.1, salvo set &quot;Dispenser&quot; a 2. </li><li> Agitare piastra per 30 sec. Impostare le condizioni nel passaggio 5.6.2. </li><li> Leggi luminescenza di tutti i pozzetti per 0,5 sec per bene. Impostare le condizioni nel passaggio 5.6.3. </li></ol></li><li> Rimuovere il coperchio dalla piastra a 96 pozzetti e posizionare la piastra nel lettore di micropiastre. Avviare il programma esposto al punto 5.5 per leggere piastra luminescenza. </li><li> Pulire le pompe dispenser reagenti. Dall&#39;icona sistema sotto la scheda &quot;Dispenser&quot;: <ol><li> Purge 1.000 ml di fsubstrato di luciferasi irefly dal dispenser luciferasi lucciola in un tubo di recupero. NOTA: luciferasi della lucciola può essere conservato a -80 ° C e riutilizzato. </li><li> Prime ciascun erogatore con 1000 ml di acqua distillata, seguiti da 1.000 ml di etanolo al 70%, e infine 1.500 microlitri di aria (rimuovi dispenser da liquido). NOTA: L&#39;acqua elimina substrati luciferasi dalle pompe reagenti, disinfetta etanolo, e l&#39;aria asciuga ogni residuo di etanolo. </li></ol></li></ol> 6. Analisi dei dati <ol><li> Data Export <ol><li> Nel software lettore di micropiastre, fare doppio clic su &quot;Segnala / Export Costruttori&quot; sul lato sinistro dello schermo. </li><li> Fare clic sul pulsante &quot;Nuovo Esporta in Excel&quot; e fare clic su &quot;OK&quot;. </li><li> Evidenziare Esport1 e fare clic su &quot;Modifica&quot;. <ol><li> In &quot;Contenuti&quot; check &quot;Descrizione del sistema&quot;, &quot;Procedura&quot;, &quot;Descrizione Piatto&quot; e &quot;Piatto layout Matrix&quot;. Include &quot;dati grezzi&quot;, unnd &quot;Calcolato dati&quot;. </li><li> In &quot;Workflow&quot;, selezionare &quot;Esecuzione automatica al termine della procedura&quot;. In modalità di esportazione, controllare &quot;Tutti i piatti nella stessa cartella di lavoro&quot; e &quot;come un nuovo foglio di lavoro&quot;. </li><li> Sotto &quot;File&quot;, scegliere il formato del nome file e il percorso del file e fare clic su &quot;OK&quot;. </li><li> Chiudere la finestra &quot;Segnala / Export Costruttori&quot;. </li></ol></li></ol></li><li> Per ottenere i valori normalizzati luciferasi, dividere la luciferasi di lucciola lettura luminescenza per ogni bene (Step 5.6.3), dalla lettura luminescenza Renilla per ogni pozzetto (fase 5.6.6). </li></ol>

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</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Identità odorizzante è codificato da olfattivi pattern di attivazione del recettore, ma pattern di attivazione del recettore, tra cui i recettori che vengono attivati ​​e in che misura, sono noti da meno di 6% dei recettori olfattivi umani 1-11. Gli sforzi per caratterizzare i recettori olfattivi sono stati limitati dai loro metodi o applicabilità alta intensità di lavoro solo a un sottoinsieme della olfattivo 17,23,24,33,34 famiglia di recettori. Il sistema di espressione eterologo Hana3A supporta...

Il sistema olfattivo dei mammiferi ha la capacità di rispondere ad un vasto numero di stimoli odorosi, consentendo la rilevazione e la discriminazione di migliaia di odoranti. Recettori olfattivi (OR) sono i sensori molecolari espressi dai neuroni sensoriali olfattivi nell&#39;epitelio olfattivo 12. Riconoscimento odore dei mammiferi avviene attraverso l&#39;attivazione differenziale delle RUP di odoranti, e l&#39;OR famiglia di geni è ampia, con circa 1.000 murino e 400 recettori umani 12-16. Analisi funzionali precedenti di RUP nei neuroni olfattivi e nelle cellule eterologhe hanno dimostrato che diversi odoranti sono riconosciuti da unico, ma insiemi di RUP 10,17-20 sovrapposizione. Corrispondenza ligandi di RUP è fondamentale per comprendere il codice olfattivo ed essenziale per la costruzione di modelli sostenibili di olfatto. A causa delle difficoltà che esprimono RUP in sistemi eterologhi nonché il gran numero di entrambi odoranti e RUP, questi dati è stato praticamente assente dal field; anzi, meno del 6% delle RUP umani hanno un ligando pubblicato 1-11. Questo protocollo descrive l&#39;uso di un saggio di luciferasi per caratterizzare odoranti / o interazioni. Questo test consente la caratterizzazione high-throughput di RUP, un compito che è essenziale per comprendere odorizzante / o interazioni, nonché lo sviluppo di un modello di codifica odore. Gli studi High-throughput di RUP devono affrontare tre grandi sfide. In primo luogo, OR espressi in cellule eterologhe sono stati mantenuti al pronto soccorso e successivamente degradata nel proteasoma 21,22, impedendo ai RUP di interagire con odoranti nel sistema di dosaggio 23-25. Questo problema è stato affrontato dalla scoperta di proteine ​​accessorie che facilitano l&#39;espressione sulla superficie cellulare stabile di una vasta gamma di RUP 19,26,27. Receptor-trasportatore-proteine ​​1 e 2 (RTP1 e 2) promuovere o espressione sulla superficie cellulare e l&#39;attivazione in risposta alla stimolazione odorizzante 19. Sulla base di questo lavoro, HEK293T cellule eranomodificata per esprimere stabilmente RTP1 lungo (RTP1L) e RTP2, recettore espressione di miglioramento proteina 1, e G αolf, risultante nella linea cellulare Hana3A 19,27. Inoltre, il tipo 3 recettori muscarinici (M3-R) interagisce con RUP sulla superficie cellulare e migliora l&#39;attivazione in risposta a odoranti 26. Co-trasfezione di un OR con RTP1S e M3-R in Hana3A cellule risultati nella robusta, coerente e funzionale espressione di una vasta gamma di RUP sulla superficie cellulare 27. In secondo luogo, mammifero o repertori sono abbastanza grandi. Negli esseri umani, per esempio, il repertorio OR è un ordine di grandezza più numerose di repertorio recettore gustativo, e 2 ordini di grandezza più numerose di repertorio recettore visivo. Sebbene clonazione di una singola O è un protocollo relativamente semplice, è necessaria notevole sforzo up-front per generare una libreria completa. In terzo luogo, anche se sappiamo che nella visione, di lunghezza d&#39;onda si traduce in colori ein frequenza audizione si traduce in campo, l&#39;organizzazione degli odori è poco conosciuta, rendendo difficile per i ricercatori di interpolare da un campione rappresentativo di odoranti. Anche se sono stati compiuti alcuni progressi su questo fronte 10,28, la mappa del paesaggio olfattivo rimane incompleto. Screening decine di migliaia di molecole contro centinaia di RUP è un compito arduo; schermi high-throughput in questo settore richiedono campagne accuratamente definiti. Le grandi sfide rimanenti sono quelli della logistica e dei costi, piuttosto che problemi inerenti alla tecnica. Sebbene lo screening eterologo non è stato ampiamente utilizzato per identificare ligandi da gruppi accademici, una società privata ha utilizzato la stessa tecnica per identificare ligandi per 100 RUP umani 29. Purtroppo, questi dati rimangono di proprietà. La luciferasi saggio ad alta prestazione qui descritto ha diversi vantaggi rispetto ai metodi alternativi utilizzati per valutare O attivazione. Anche se la responsabilitàses dei neuroni sensoriali olfattivi nativi sono stati misurati utilizzando elettrofisiologia e di imaging di calcio, queste tecniche hanno difficoltà a prendere in giro oltre che O porta alla risposta di un neurone causa della sovrapposizione di proprietà di risposta per i neuroni olfattivi. Anche se bussare in una GFP-etichettata tipo di recettore 30,31, offrendo recettori specifici tramite adenovirus murino neuroni olfattivi 32,33, o l&#39;esecuzione di RT-PCR dopo le registrazioni 17,24,33 può collegarsi registrazioni tipi di recettori singoli, questi metodi sono a bassa velocità e non adatto per schermi di grandi dimensioni. Sistemi di screening eterologhi sono più scalabili, e due forme principali si trovano in letteratura: i giornalisti di via cAMP e inositolo trifosfato (IP3) giornalisti di via. Dopo stimolazione odore, RUP attivano una cascata di segnali G αolf trasduzione che provoca la produzione di AMP ciclico (cAMP) 12. Mediante co-trasfezione una lucciola gene reporter luciferasi sotto il controllo di acAMP risposta elemento (CRE), produzione luciferasi può essere misurata in funzione della risposta odore, permettendo la quantificazione di OR attivazione. O attivazione può anche essere collegata al percorso IP3 mediante co-esprimono proteine ​​G come G α15/16 o un G α15-OLF chimera 24,25,34. Abbiamo scelto il saggio qui presentato sulla base di tre fattori: (1) la co-espressione di RTP1 con i recettori olfattivi Rho-contrassegnate migliora l&#39;espressione di recettori olfattivi sulla superficie cellulare 19,27; (2) l&#39;uso di un gene reporter cAMP-reattivo consente la misurazione di OR attivazione attraverso il percorso del secondo messaggero canonica; e (3) il saggio è adatto agli schermi high-throughput. Questo saggio luciferasi ad alta produttività è applicabile ad una varietà di pregevoli studi al campo dell&#39;olfatto. In primo luogo, un gran numero di RUP può essere proiettato contro un singolo odorante per determinare lo schema di attivazione recettore di un spodorizzante ecific. Questo tipo di studio ha identificato OR7D4 come OR responsabile per rispondere alla steroide androstenone odorizzante 8. Viceversa, uno o potrà essere schermato contro un pannello di odoranti per determinare il profilo di risposta recettore 10. Quando candidato olfattivo odorizzante / O coppie sono identificati tramite questi schermi, interazione può essere confermata effettuando un esperimento dose risposta esaminando la risposta del OR a concentrazioni crescenti di odorizzante. Curve dose-risposta possono anche valutare come variazione genetica in un OR colpisce in vitro risposta odorizzante 8,9,11,35, e questi studi possono essere esteso a interspecifica o variazione, consentendo l&#39;esame dell&#39;evoluzione del recettore attraverso le specie e le mutazioni causali nell&#39;evoluzione 36,37, infine, questo saggio può essere utilizzato per lo screening di antagonisti odori che sono in grado di antagonizzare o la risposta ad una particolare odorizzante per una coppia odorizzante / ricevitore conosciuto 38,39. In sintesi, questo alto-Capacità saggio luciferasi è applicabile ad una serie di studi che aiuteranno caratterizzano o pattern di attivazione e fornire una migliore comprensione della codifica odore nel sistema olfattivo.

<table><tbody><tr><td>Celle Hana3A</td><td>Disponibili presso il Laboratorio Matsunami su richiesta</td><td></td><td></td></tr><tr><td>RTP1S-pCI</td><td>Disponibili presso il Laboratorio Matsunami su richiesta</td><td></td><td></td></tr><tr><td>M3-R-pCI</td><td>Disponibili presso il Laboratorio Matsunami su richiesta</td><td></td><td></td></tr><tr><td>pCRE-luc</td><td>Agilent</td><td>219076</td><td><a href="http://www.chem.agilent.com/store/ProductDetail.aspx?productID=219076%28Agilent%29">LUC</a></td></tr><tr><td>pSV40-RL</td><td>Promega</td><td>E2231</td><td><a href="http://www.promega.com/products/reporter-assays-and-transfection/reporter-vectors-and-cell-lines/prl-renilla-luciferase-control-reporter-vectors/">RL</a></td></tr><tr><td>Minimo supporto essenziale, Eagle</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M4655</td><td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/m4655?lang=en&amp; region=US">MEM</a></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Life Technologies</td><td>16000-044</td><td><a href="https://products.invitrogen.com/ivgn/product/16000044? ICID=search-16000044">FBS</a></td></tr><tr><td>PBS (senza Ca2+ e Mg2+)</td><td>Cellgro</td><td>21-040-CV</td><<td>a href="http://cellgro.com/products/balanced-salt-solutions/phosphate-buffered-saline/phosphate-buffered-saline-1x-2.html">PBS</a></td></tr><tr><td>Tripsina (0,05% tripsina EDTA)</td><td>Life Technologies</td><td>25300</td><td><a href="https://products.invitrogen.com/ivgn/product/25300054? ICID=search-product">Trypsin</a></td></tr><tr><td>CD293</td><td>Life Technologies</td><td>11913-019</td><td><a href="http://products.invitrogen.com/ivgn/product/11913019? ICID=search-11913019">CD293</a></td></tr><tr><td>96-well PDL piastra bianca/trasparente</td><td>BD BioCoat</td><td>356693</td><td><a href="http://www.thomassci.com/Supplies/Tissue-Culture-Cellware/_/BD-Biocoat-Poly-D-Lysine-Culture-Dishes?q=356693">plates</a></td></tr><tr><td>Reagente di trasfezione lipidica: Lipofectamine 2000</td><td>Life Technologies</td><td>11668-019</td><td><a href="https://products.invitrogen.com/ivgn/product/11668019? ICID=search-11668019">Lipofectamine</a></td></tr><tr><td>Firefly luciferase substrato, lucciola luciferase quencher/Renilla luciferase substrato: Dual-Glo Assay</td><td></td><td>Promega E2980</td><td><a href="http://www.promega.com/products/reporter-assays-and-transfection/reporter-assays/dual_glo-luciferase-assay-system/?__utma=1.1932750276.1376486173.1376486173.1376486173.1&__utmb=1.1.10.1376486173&amp;__utmc=1&__utmx=-&__utmz=1.1376486173.1.1.utmcsr=google|utmc">dual glo</a></td></tr><tr><td>Synergy S2&nbsp;</td><td>BioTek</td><td>SLAD</td><<td>a href="http://www.biotek.com/products/microplate_detection/synergy2_multimode_microplate_reader.html">BioTek S2</a></td></tr><tr><td>Software per lettore di micropiastre: Software di analisi dati Gen5</td><td>BioTek</td><td>Gen5</td><td><a href="http://www.biotek.com/products/microplate_software/gen5_data_analysis_software.html">Gen5</a></td></tr><tr><td>BIOSTACK</td><td>BioTek</td><td>BIOSTACK2WR</td><td><a href="http://www.biotek.com/products/microplate_software/biostack_microplate_stacker.html">BioStack</a></td></tr><tr><td>Multiflo</td><td>BioTek</td><td>MFP</td><td><a href="http://www.biotek.com/products/liquid_handling/multiflo_microplate_dispenser.html">MultiFlo</a></td></tr><tr><td>300 &#956; l GripTips</td><td>Integra</td><td>4433</td><td><a href="http://www.integra-biosciences.com/sites/us/pipette_tips_griptips_4_e.html">GripTips</a></td></tr><tr><td>12.5 &#956; l GripTips</td><td>Integra</td><td>4414</td><td><a href="http://www.integra-biosciences.com/sites/us/pipette_tips_griptips_4_e.html">GripTips</a></td></tr><tr><td>300 &#956; l GripTips ViaFlo96</td><td>Integra</td><td>6433</td><td><a href="http://www.integra-biosciences.com/sites/us/pipette_tips_griptips_XYZ_4_e.html">XYZ tips</a></td></tr><tr><td>12.5 &#956; l GripTips 384 XYZ</td><td>Integra</td><td>6403</td><td><a href="http://www.integra-biosciences.com/sites/us/pipette_tips_griptips_XYZ_4_e.html">XYZ tips</a></td></tr><tr><td>384ViaFlo</td><td>Integra</td><td>6030</td><td><a href="http://www.integra-biosciences.com/sites/us/96_384_channel_pipette.html">384ViaFlo</a></td></tr><tr><td>TE buffer</td><td>Macherey Nagel</td><td>740797.1</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D2650-100ML</td><<td>a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/d2650?lang=en&amp; region=US">DMSO</a></td></tr><tr><td>Forskolin</td><td>Enzo Life Sciences</td><td>BML-CN100-0010</td><td><a href="http://www.thomassci.com/007635F0-AA41-4B24-B46A-05723D685997/_/FORSKOLIN-10MG?q=c002e24">FOR</a></td></tr></tbody></table>

high-throughput analisi dei mammiferi olfattive recettori: misurazione del recettore attivazione tramite luciferase activity

High-throughput Analysis of Mammalian Olfactory Receptors: Measurement of Receptor Activation via Luciferase Activity

Odoranti di creare modelli unici e sovrapposte di attivazione del recettore olfattivo, permettendo una famiglia di circa 1.000 murino e 400 recettori umani di riconoscere migliaia di odoranti. Ligandi odoranti sono stati pubblicati da meno di 6% di recettori umani 1-11. Questa mancanza di dati è dovuta in parte alle difficoltà funzionalmente esprimono questi recettori in sistemi eterologhi. Qui, descriviamo un metodo per esprimere la maggior parte della famiglia dei recettori olfattiva in cellule Hana3A, seguita da valutazione ad alta velocità di attivazione del recettore olfattivo utilizzando un saggio reporter di luciferasi. Questo test può essere utilizzato per (1) pannelli schermo di odoranti contro pannelli di recettori olfattivi; (2) confermare l&#39;interazione odorizzante / recettore tramite curve dose-risposta; e (3) confrontare i livelli di attivazione del recettore tra le varianti del recettore. Nei nostri dati di esempio, 328 recettori olfattivi sono stati proiettati contro 26 odoranti. Coppie di odorizzante / recettori con diversi punteggi di risposta erano selezioneted e testato in dose-risposta. Questi dati indicano che uno schermo è un metodo efficace per arricchire per coppie odorizzante / recettore che passeranno un esperimento dose-risposta, cioè recettori che hanno una risposta bona fide a un odorizzante. Pertanto, questa high throughput saggio luciferasi è un metodo efficace per caratterizzare olfattiva recettori-un passo essenziale verso un modello di codifica odore nel sistema olfattivo dei mammiferi.

Uno schermo primario testato 328 RUP contro 26 odori ad una concentrazione di 100 mM. Questa concentrazione di odore è stato dimostrato per attivare efficacemente una grande proporzione di RUP con ligandi noti 10. In primo luogo, l&#39;attività della luciferasi normalizzata è stata calcolata dividendo la lettura luciferasi lucciola dalla lettura Renilla luciferasi. Successivamente, i valori baselined sono stati calcolati sottraendo le letture luciferasi normalizzati per il controllo senza odore dalle...

Olfattive pattern di attivazione del recettore codificano identità odore, ma la mancanza di dati pubblicati identificativi ligandi odoranti per i recettori olfattivi dei mammiferi ostacola lo sviluppo di un modello completo di codifica odore. Questo protocollo descrive un metodo per facilitare l&#39;identificazione ad alta produttività di ligandi dei recettori olfattivi e quantificazione di attivazione del recettore.

High-throughput Analisi dei mammiferi olfattive Recettori: Misurazione del recettore Attivazione tramite Luciferase Activity

Odorants create unique and overlapping patterns of olfactory receptor activation, allowing a family of approximately 1,000 murine and 400 human receptors ...

L'obiettivo generale del seguente esperimento è quello di eseguire una misurazione ad alto rendimento dell'attivazione del recettore olfattivo tramite un saggio di luciferasi. Ciò si ottiene sezionando le cellule H tre A con vettori contenenti proteine accessorie, luciferasi di lucciola e vaniglia e recettori olfattivi al fine di esprimere un recettore olfattivo diverso. In ogni pozzetto di una piastra a 96 pozzetti.In una seconda fase, le cellule vengono stimolate con gli odori. Successivamente viene aggiunto il substrato della luciferasi che provoca la luminescenza delle cellule che hanno prodotto l'enzima luciferasi, funzionando così come reporter per l'attivazione del recettore olfattivo. In definitiva, i risultati mostrano le risposte della popolazione di recettori olfattivi agli odori in base alla luminescenza di ciascun pozzetto nella piastra.I principali vantaggi di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti come l'adenovirale, la trasduzione dei neuroni nativi o l'imaging del calcio, è che questa tecnica scala a screening ad alto rendimento e utilizza la via nativa del secondo messaggero mediata da CM per esaminare l'attivazione del recettore olfattivo. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo dell'olfatto, come l'abbinamento dei ligandi degli odori, quindi i recettori olfattivi, e l'esame dell'effetto della variazione genetica sull'attivazione dei recettori olfattivi. Le tre celle A Hanna utilizzate in questo protocollo sono mantenute in terreni M 10 a 37 gradi Celsius con il 5% di CO2 e devono essere confluenti al 100% per poter preparare le celle per i mezzi di aspirazione per trasfezione da un piatto di 10 centimetri di celle di lavaggio delle cellule.Aggiungendo 10 millilitri di PBS, agitando la piastra e aspirando il PBS, aggiungere tre millilitri di tripsin EDTA allo 0,05% e attendere circa un minuto affinché le cellule si dissocino a temperatura ambiente. Inattivare la tripsina aggiungendo cinque millilitri di terreno M 10 per rompere i grumi cellulari tri valutando circa 10 volte con una pipetta da 10 millilitri. Pipettare con cura per evitare di introdurre bolle d'aria nel terreno.Per ogni piastra da 96 pozzetti, trasferire un millilitro di cellule in una provetta conica da 15 millilitri. Centrifugare a 200 volte la gravità per cinque minuti e aspirare il surnatante senza disturbare il pellet della cella. Sospendi le cellule in 12 millilitri di M 10, pipetta 50 microlitri di cellule in ciascun pozzetto delle piastre da 96 pozzetti e incuba per una notte a 37 gradi Celsius con il 5% di CO2.Prima di iniziare questa procedura, osservare le cellule piastrate il giorno precedente per garantire una corretta cofluenza di circa il 30-50% per pozzetto. Rimetti le piastre nell'incubatrice e procedi. Per preparare la trasfezione, mescolare i plasmidi per esprimere le proteine accessorie.La luciferasi Firefly e la luciferasi ran vanilla sono state diluite ciascuna a una concentrazione di 100 nanogrammi per microlitro in tampone TE per fare in modo che la miscela plasmidica pipetti i plasmidi in mem medium per i volumi indicati in questa tabella. Per ogni piastra a 96 pozzetti, diluire 18 microlitri di reagente di trasfezione lipidica in 450 microlitri di terreno mem per ottenere la miscela di trasfezione lipidica. Quindi, pipettare il plasmide.Miscelare il plasmide con il recettore olfattivo marcato con opsina e la miscela di trasfezione lipidica in una piastra MICROTITER pulita. Per rendere il complesso descritto in questa tabella, il calcolo del pozzo più il 10% è importante per garantire un volume sufficiente per le fasi successive. Mescolare la soluzione mediante tri curation e incubare a temperatura ambiente per 15 minuti.Arrestare la reazione aggiungendo M 10 secondo la tabella. Per il successo di questa procedura, è importante che le cellule non vengano mai lasciate senza terreno per più di due minuti. Mentre le soluzioni vengono aggiunte ai pozzi.Estrarre le cellule dall'incubatore e capovolgere la piastra cellulare e picchiettare la pipetta del terreno 50 microlitri di complesso in ciascun pozzetto e incubare per una notte a 37 gradi Celsius con il 5% di CO2 il giorno dopo la trasfezione dei recettori olfattivi. Osservare le cellule trasfettate per garantire una corretta cofluenza dal 50 all'80% per ogni pozzetto che riporta le cellule nell'incubatore. L'odore è stato diluito a una concentrazione stock di un molare e il DMSO per gli esperimenti di screening diluisce ogni soluzione stock di odore a 100 micromolari.Inoltre, preparare un controllo senza odori contenente solo il terreno CD 2 93 per controllare l'attivazione del fondo del recettore olfattivo. Rimuovere le cellule dall'incubatore e picchiettare il terreno dalle piastre cellulari. Pipettare 25 microlitri di soluzione per la stimolazione degli odori in ogni pozzetto e incubare a 37 gradi Celsius con il 5% di CO2 per quattro ore.Iniziare questa procedura. Scongelamento di un millilitro di substrato di luciferasi lucciola per 96. Preparare bene la piastra per estinguere la reazione della luciferasi della lucciola fresca e il reagente del substrato della luciferasi alla vaniglia.È necessario circa un millilitro di reagente per 96 piastre di saldatura. Quindi, preparare il lettore di micropiastre luminescenti all'interno dell'icona del sistema sotto la scheda di preriscaldamento. Selezionare la casella per on e impostare la temperatura della macchina a 25 gradi Celsius sotto la linguetta dell'erogatore.Adescare ogni erogatore con 1000 microlitri di etanolo al 70%, seguiti da 1000 microlitri di acqua distillata. Utilizzare aliquote separate di alcol e acqua per ogni erogatore. Adescare ogni erogatore con 1.500 microlitri di erogatore di adescamento ad aria.Uno con 1080 microlitri di dispenser di substrato di luciferasi lucciola. Due con substrato di luciferasi ranil. Fare attenzione a non contaminare in modo incrociato i substrati della luciferasi.Imposta il seguente protocollo per leggere la luminescenza della luciferasi della lucciola e della luciferasi vaniglia all'interno del software. Nel menu file. Fare clic su nuovi protocolli di evidenziazione delle attività e fare clic su crea nuovo.Nella finestra successiva, dovrebbe essere selezionato il cerchio accanto al protocollo standard. Fare clic su OK. Fare doppio clic sulla procedura.Sul lato sinistro dello schermo, erogare 10 microlitri di substrato di luciferasi Firefly a tutti i pozzetti utilizzando il dispenser uno nel menu delle azioni, fare clic su eroga nella finestra della fase di erogazione. Impostare l'erogatore su uno. Priming a nessuno.Erogare il volume a 10 microlitri e la velocità a 225 microlitri al secondo fare clic ok. Agitare la piastra per 30 secondi nel menu delle azioni, fare clic su agitare nella finestra della fase di agitazione. Imposta l'intensità su media e la durata su 30 clic. Ok.Leggere la luminescenza di tutti i pozzetti per 0,5 secondi per pozzetto nel menu delle azioni. Fare clic su lettura nella finestra del passaggio di lettura, impostare il metodo di rilevamento per la luminescenza, leggere il tipo al punto finale, il tempo di integrazione fino a 50, i set di filtri su un'emissione per l'intera ottica, la posizione per il guadagno superiore a 1, 35 e l'altezza di lettura a 1,00 millimetri. Fare clic su OK.Erogare 10 microlitri di substrato di luciferasi ran in tutti i pozzetti utilizzando il dosatore due. Impostare le condizioni come mostrato per l'utilizzo dell'erogatore. Uno tranne l'erogatore impostato su due.Agitare la piastra per 30 secondi. Leggere la luminescenza di tutti i pozzetti per 0,5 secondi per pozzetto. Rimuovere il coperchio dalla piastra a 96 pozzetti e posizionare la piastra nel lettore di micropiastre.Avviare il programma precedentemente impostato per leggere la luminescenza della lastra al termine della lettura. Pulire le pompe dell'erogatore di reagenti dall'icona del sistema sotto la scheda dell'erogatore. Spurgare 1000 microlitri di substrato di luciferasi firefly dall'erogatore di luciferasi firefly in un tubo di recupero.Ogni erogatore con 1000 microlitri di acqua distillata seguiti da 1000 microlitri di etanolo al 70%. E infine, 1.500 microlitri di aria mostrati qui sono i risultati di uno screening primario che ha testato 328 recettori olfattivi o OR contro 26 odori a una concentrazione di 100 micromolari. Questo istogramma rappresenta la frequenza o il conteggio dei valori di luciferasi al basale calcolati per ciascun odorante o coppia nello schermo poiché le coppie di attivazione del recettore degli odori sono scarse.La maggior parte dei valori è centrata a zero e l'ampia distribuzione centrale stima la distribuzione del rumore per questo test. Le curve dose-risposta sono state eseguite su 48 odoranti o coppie distribuite in modo casuale nell'intervallo di valori basali come indicato dalle barre colorate. Le barre blu sono coppie che sono state classificate come agonisti in base alla risposta alla dose completa e le barre rosse sono coppie che non sono state classificate come agonisti.Il tasso di veri positivi è stato quindi confrontato con il tasso di falsi positivi utilizzando il pacchetto statistico R. L'area sotto la curva o un UC è 0,68, indicando che l'odorante o le coppie con valori di screening della luciferasi più elevati hanno maggiori probabilità di superare la risposta alla dose rispetto a quelli con valori più bassi. Questi dati suggeriscono che lo screening primario è un metodo utile per arricchire odoranti o coppie che saranno classificati come agonisti in un esperimento di risposta a dose completa.Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in circa sei ore per 5 96 piastre ole, escluso il tempo di incubazione se viene eseguita correttamente. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come eseguire un'analisi ad alto rendimento dei recettori olfattivi utilizzando la trasfezione, la stimolazione degli odori e la misurazione dell'attivazione con il saggio della luciferasi.

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