Name: Un Ex vivo Cultura sistema per studiare lo sviluppo della tiroide (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-06-06T13:45:00.000+00:00
Duration: 8 min 33 s
Description: Impara a dissezionare e coltivare esplanti tiroidei embrionali di topo per studiare eventi morfogenetici e di differenziazione. Questo metodo consente analisi di imaging, immunofluorescenza ed espressione genica.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Il lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni dell'Université catholique de Louvain (Action de recherché concertées) e del Fondo per la Ricerca Medica Scientifica (F.R.S.-FNRS, Belgio). A.-S.D. è un dottorando di ricerca presso Télévie, A.-C.H. ha ottenuto una borsa di studio dal Fonds pour la formation à la Recherche dans l'Industrie et dans l'Agriculture (Belgio), M.V. è sostenuto dal de Duve Institute e C.E.P. è un senior research associate del F.R.S.-FNRS (Belgio).

I topi sono stati allevati e trattati secondo i principi della cura degli animali da laboratorio della commissione per il Benessere degli Animali University. Tutte le procedure e protocolli sono stati approvati dal comitato. 1. Rivestimento di Microscopia plastica Cultura Chambers NOTA: Eseguire tutte le seguenti operazioni in condizioni di sterilità in una cappa a flusso laminare. I due tipi di rivestimento sono funzionalmente equivalenti. <ol><li> Cappotto di plastica camere di coltura con fibronectina un giorno prima l&#39;isolamento dei tessuti tiroidei: <ol><li> Diluire fibronectina sterile ad una concentrazione finale di 50 mg / ml in M199 mezzo supplementato con 100 U / ml di penicillina, 100 pg / ml streptomicina, 0,25 mg / ml fungizone e glutammina 2 mM 12. </li><li> Coprire i pozzetti con 200 ml di fibronectina diluito e incubare una notte in un 4 ° C frigorifero. </li><li> Il giorno della dissezione, aspirare la fibronectina, lavare i pozzetti una volta con M199 e aggiungere un volume minimo di 200 ml di M199 addizionato con antibiotici, glutamina e siero di vitello fetale al 10%. </li><li> Lasciare le camere rivestite in incubatrice fino al momento piastra espianti. </li></ol></li><li> Cappotto di plastica camere di coltura con collagene di tipo I 2 ore prima l&#39;isolamento dei tessuti tiroidei: <ol><li> Diluire tipo sterile collagene ad una concentrazione finale di 50 mg / ml in HCl 10 mM. NOTA: Mantenere soluzione stock di collagene sul ghiaccio. </li><li> Coprire i pozzetti con 200 ml di tipo diluito collagene e incubare per 2 ore a temperatura ambiente (RT). </li><li> Aspirare il collagene di tipo I soluzione, lavare i pozzetti una volta con M199 e aggiungere un volume minimo di 200 ml di M199 addizionato con antibiotici, glutamina e siero di vitello fetale al 10%. </li><li> Lasciare le camere rivestite in incubatrice fino al momento piastra espianti. </li></ol></li></ol> 2. Dissezione della tiroide Anlagen contenenti tessuti (E12.5) o tiroide Lobi (E13.5-E14.5) NOTA: Utilizzare strumenti di dissezione pulite e piastre di Petri / coltura. I passi generali e incisioni descritte qui sotto sono le stesse per E12.5 e E14.5 embrioni. <ol><li> Sacrifica tempestive incinta topi di sesso femminile al embrionale desiderata (e) giornata (dalle E12.5 a E14.5) e rimuovere l&#39;utero con strumenti di dissezione. </li><li> Posizionare l&#39;utero sezionato in una piastra 10 cm contenente HBSS. </li><li> Tenere una estremità dell&#39;utero con una pinza e aprire l&#39;utero con piccole forbici per liberare progressivamente tutti gli embrioni. </li><li> Separare gli embrioni dalla placenta con le forbici e trasferire gli embrioni con i loro annessi embrionali in una nuova piastra 10 cm contenente HBSS. </li><li> Rimuovere il sacco vitellino e sacco amniotico. NOTA: Da questo punto, lavorare sotto uno stereomicroscopio con transilluminazione dal basso; aumentare l&#39;ingrandimento a passi di dissezione. Utilizzare aghi di tungsteno in capillari di vetro come strumenti di dissezione. </li><li> Utilizzando gli aghi comeun coltello e forchetta, rimuovere la parte superiore della testa, compresa la mascella superiore e le orecchie (Figura 1A, tagliare lungo a). </li><li> Tenere l&#39;embrione sul dorso e rimuovere prima un ulteriore pezzo di tubo neurale (Figura 1A, tagliare lungo b), allora la parte inferiore dell&#39;embrione, appena sotto gli arti anteriori e sopra il cuore (Figura 1B). </li><li> Trasferire la fetta embrione contenente la lingua (per orientare il tessuto) e regione del collo in una nuova piastra 10 cm contenente HBSS. </li><li> Rimuovere il tubo neurale e tessuti posteriori per l&#39;esofago / trachea (Figura 1C, tagliare lungo a). </li><li> Delicatamente sezione fetta tessuto lungo entrambi i lati della linguetta (Figura 1C, tagliare lungo b e b &#39;). </li><li> Individuare l&#39;esofago e trachea, nel prolungamento della lingua, e sezionare la lingua, lasciando il arytenoid gonfiore (Figura 1D, tagliare lungo a), e il tessuto sul both lati dell&#39;esofago / trachea (Figura 1D, tagliare lungo b e b &#39;). </li><li> Rimuovere l&#39;esofago, e collocare la trachea con il lato ventrale rivolto verso l&#39;alto. </li><li> Sezionare i tessuti indesiderati quali il timo (Figura 1E) e tutti i tessuti situati lateralmente alle arterie arco faringeo. Per E13.5 E14.5 embrioni o, visualizzare i lobi tiroidei su ogni lato della trachea (Figura 1F; linee tratteggiate rosse) e sezionare ulteriormente i lobi dalla trachea. </li><li> Trasferire la regione E12.5 trachea isolata, o lobi tiroidei E13.5-E14.5 in una piastra di coltura 35 millimetri contenente pre-riscaldato a medio M199 addizionato con antibiotici, glutamina e siero di vitello fetale del 10%. Trasferire espianti con una punta di filtro prewetted su un P-200 micropipetta. Per espianti E12.5, tagliare l&#39;estremità della punta per allargare l&#39;apertura. NOTA: Ordinariamente, e se gli embrioni hanno lo stesso genotipo, eseguire i passaggi 6 e 7 per tutti gli embrioni, lan 9-11, e infine 12 e 13. </li></ol> 3. Placcatura e Cultura della tiroide espianti <ol><li> Lavare gli espianti mediante trasferimento successivo in tre pozzetti di una piastra da 24 pozzetti contenenti 1 ml di terreno di coltura pre-riscaldato (= M199 addizionato con antibiotici, glutamina e siero di vitello fetale al 10%). </li><li> Placcatura dei lobi tiroidei sul rivestiti di microscopia camere di coltura di plastica: <ol><li> Aspirare il mezzo di coltura M199 dalle camere rivestite. </li><li> Con cautela, trasferire i espianti tiroide nelle camere di coltura utilizzando un consigli micropipetta e filtro. Posizionare un espianto al centro di ogni camera. </li><li> Rimuovere eccesso di terreno e posizionare la camera di coltura in un incubatore di coltura tissutale (37 ° C, 5% CO 2) per 2 ore per consentire gli espianti attribuiscono alla matrice. </li><li> Aggiungere delicatamente 200 a 300 ml di terreno di coltura pre-riscaldato a ciascun pozzetto. </li><li> Incubare per la cultura a lungo termine nel tessuto culturale incubatore. </li></ol></li><li> Placcatura of regione trachea o della tiroide lobi sui filtri semiporoso: <ol><li> Riempire il numero di pozzetti di una piastra da 24 pozzetti richiesto con 330 ml di terreno di coltura pre-riscaldato. </li><li> I filtri (esempio 0,4 micron filtro Millipore) sul supporto, avendo cura di evitare intrappolamento di bolle d&#39;aria sotto il filtro della cultura. </li><li> Dolcemente con una micropipetta consigli e filtri, trasferire gli espianti tiroidei con un volume minimo di mezzo sul centro dei filtri (massimo 4/filter). </li><li> Rimuovere l&#39;eccesso di medio e distanziare gli espianti con un ago di tungsteno. </li><li> Incubare per la cultura a lungo termine nel tessuto culturale incubatore. NOTA: Cambia terreno di coltura ogni altro giorno sotto la cappa a flusso laminare. Cultura gli espianti fino a 7 giorni. </li></ol></li></ol> 4. Whole-mount immunofluorescenza Protocollo di colorazione per la tiroide espianti Sloggiare espianti coltivati ​​su filtri (dopo il passo 2 sotto) utilizzando aghi di tungsteno opinza sottile e il trasferimento in una piastra a 24 pozzetti per tutte le fasi, ad eccezione di primaria (passo 5) e secondaria (passo 7) incubazioni anticorpi (piastra a 96 pozzetti). Per espianti aderenti coltivate in camere di plastica microscopia, eseguire tutti i passaggi nelle camere di coltura. <ol><li> Aspirare M199 terreno di coltura e fissare l&#39;espianto con gelida 4% paraformaldeide (PFA) per 20 min (500 microlitri nel piatto da 24 pozzetti e 300 microlitri di diapositive microscopia). </li><li> Lavare 2x 10 min in Tris Buffered Saline con Triton (TBST, 50 mM Tris HCl pH 7.5, 150 mM NaCl, 0,1% Triton X-100) a temperatura ambiente. </li><li> Elaborare gli espianti immediatamente o conservare a -20 ° C. NOTA: Per la conservazione a lungo termine a -20 ° C, disidratare gli espianti in metanolo aumentando gradualmente la concentrazione di metanolo in TBST per raggiungere il 100% di metanolo. Quando si è pronti per continuare con l&#39;immunoistochimica (punto 4), reidratare gli espianti aggiungendo gradualmente TBST al metanolo. </li><li> Sostituire TBST con la soluzione di bloccaggio (10% normale Goat Serum in TBST) E incubare su un rocker mare sega per 30-60 minuti a temperatura ambiente. </li><li> Diluire l&#39;anticorpo primario in soluzione bloccante (100-200 ml per condizioni). Trasferire gli espianti &quot;filtro&quot; da una piastra da 24 pozzetti ad una piastra a 96 pozzetti. Incubare espianti con gli anticorpi primari su un rocker mare-sega notte a 4 ° C. </li><li> Il giorno successivo, scartare la soluzione di anticorpo primario, di trasferire gli espianti &quot;filtro&quot; di nuovo in una piastra a 24 pozzetti e lavare almeno cinque volte con TBST su una sedia a dondolo mare sega per 45-60 minuti ciascuno a RT. </li><li> Diluire anticorpo secondario (per esempio capra anti-X-Alexa Fluor a diluizione 1:2.000) in TBST contenente 1% di siero normale di capra e incubare gli espianti con questa diluizione durante la notte su un bilanciere mare-sega a 4 ° C e al buio. Per contrasto nucleare, comprende 1 mg / ml di bis-Benzimide (Hoechst), insieme con la soluzione di anticorpo secondario. </li><li> Il giorno successivo, scartare la soluzione di anticorpo secondario e lavare 5x con TBST su un mare-segarocker per 45-60 minuti ciascuno a RT. Durante i lavaggi, mantenere gli espianti nel buio. </li><li> Eseguire un lavaggio supplementare in TBST delicatamente vorticoso notte a 4 ° C al buio. </li><li> Postfix gli espianti immunostained in PFA 4% a 4 ° C per 10 min. </li><li> Lavare 2x 10 min con TBST. </li><li> Trasferire gli espianti sia gradualmente in metanolo 100% per la conservazione a lungo termine a -20 ° C, o analizzare immediatamente. Per espianti coltivati ​​su filtri, e immunostained in una piastra da 24 pozzetti, trasferimento in una camera di microscopia (es LabTek o Ibidi) con TBST o meglio mezzo di montaggio fluorescente prima dell&#39;analisi con un Multiphoton o microscopio confocale. </li></ol> 5. Estrazione di RNA da tiroide Lavorare in un ambiente privo di RNasi. Pertanto, l&#39;uso di acidi nucleici e nucleasi gratuito punte per pipette e pulire sia panchina e attrezzature da contaminanti e RNasi. Questo protocollo essendo basato su fenolo / cloroformio, eseguire il primo passos (1-7) sotto una cappa chimica. <ol><li> Omogeneizzare un espianto tiroide o due lobi tiroidei con 300 ml di soluzione di estrazione di RNA utilizzando un pestello monouso per provetta da 1,5 ml. In tra i campioni, lavare il pestello in 2% SDS, poi acqua, poi etanolo. </li><li> Aggiungere altri 100 ml di soluzione di estrazione dell&#39;RNA, vortice 10 sec e incubare a temperatura ambiente per 10 min. </li><li> Vortex per 30 secondi e aggiungere 20 ng di tRNA per ciascun campione. </li><li> Vortex per 1 minuto e aggiungere 80 ml di cloroformio. </li><li> Vortex energicamente per 30 secondi ed incubare 15 minuti a temperatura ambiente. </li><li> Spin per 15 minuti a 19.000 xg in un frigorifero (4 ° C) centrifuga. </li><li> Trasferire accuratamente la fase acquosa superiore incolore in una nuova provetta contenente 20 mg di glicogeno come coprecipitant. </li><li> Vortex e aggiungere 200 ml di alcol al 100% isopropanolo. </li><li> Vortex energicamente per 15-30 secondi e lasciare RNA precipitato a -20 ° C per 2-3 ore oa -80 ° C per 1 ora. </li><li> Spin per 30 min a 19.000xga 4 ° C, ed eliminare il surnatante. </li><li> Lavare il pellet con 450 ml di freddo il 75% di etanolo e vortex per rimuovere il pellet. </li><li> Spin per 10 min a 19.000 xga 4 ° C, ed eliminare il surnatante. </li><li> Essiccare il pellet sotto il cofano per 5 min. </li><li> Risospendere il pellet con 10 ml di acqua RNase-free e incubare 10 minuti a temperatura ambiente. </li><li> Concentrazione di RNA Assay, conservare a -80 ° C o inverse trascrivono per analisi di espressione genica. </li></ol>

<ol><li>Colin, I. M., Denef, J. -F., Lengelé, B., Many, M. -C., Gérard, A. -C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+insights+into+the+cell+biology+of+thyroid+angiofollicular+units%5BTitle%5D)+AND+%22Endocr.+Rev%22%5BJournal%5D)">Recent insights into the cell biology of thyroid angiofollicular units.</a> Endocr. Rev. 34 (2), 209-238 (2013).</li>
<li>Fagman, H., Andersson, L., Nilsson, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+developing+mouse+thyroid+embryonic+vessel+contacts+and+parenchymal+growth+pattern+during+specification+budding%2C+migration%2C+and+lobulation%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Dyn%22%5BJournal%5D)">The developing mouse thyroid embryonic vessel contacts and parenchymal growth pattern during specification budding, migration, and lobulation.</a> Dev. Dyn. 235 (2), 444-455 (2006).</li>
<li>Fagman, H., Nilsson, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphogenesis+of+the+thyroid+gland%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell.+Endocrinol%22%5BJournal%5D)">Morphogenesis of the thyroid gland.</a> Mol. Cell. Endocrinol. 323 (1), 35-54 (2010).</li>
<li>Fagman, H., Nilsson, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphogenetics+of+early+thyroid+development%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Endocrinol%22%5BJournal%5D)">Morphogenetics of early thyroid development.</a> J. Mol. Endocrinol. 46 (1), (2011).</li>
<li>De Felice, M., Di Lauro, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thyroid+development+and+its+disorders+genetics+and+molecular+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Endocr.+Rev%22%5BJournal%5D)">Thyroid development and its disorders genetics and molecular mechanisms.</a> Endocr. Rev. 25 (5), 722-746 (2004).</li>
<li>De Felice, M., Di Lauro, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intrinsic+and+extrinsic+factors+in+thyroid+gland+development%3A+an+update%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Intrinsic and extrinsic factors in thyroid gland development: an update.</a> Endocrinology. 152 (8), 2948-2956 (2011).</li>
<li>Hick, A. -C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reciprocal+epithelial+paracrine+interactions+during+thyroid+development+govern+follicular+organization+and+C-cells+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Reciprocal epithelial paracrine interactions during thyroid development govern follicular organization and C-cells differentiation.</a> Dev. Biol. 381 (1), 227-240 (2013).</li>
<li>Toda, S., Koike, N., Sugihara, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+integration+of+thyrocytes+and+thyroid+folliculogenesis%3A+a+perspective+for+thyroid+tissue+regeneration+and+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Endocr.+J%22%5BJournal%5D)">Cellular integration of thyrocytes and thyroid folliculogenesis: a perspective for thyroid tissue regeneration and engineering.</a> Endocr. J. 48, 407-425 (2001).</li>
<li>Toda, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Culture+models+for+studying+thyroid+biology+and+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22ISRN+Endocrinol%22%5BJournal%5D)">Culture models for studying thyroid biology and disorders.</a> ISRN Endocrinol. , (2011).</li>
<li>Eggo, M. C., Quiney, V. M., Campbell, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Local+factors+regulating+growth+and+function+of+human+thyroid+cells+in+vitro+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Local factors regulating growth and function of human thyroid cells in vitro and in vivo.</a> 213, 47-58 (2003).</li>
<li>Antonica, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+functional+thyroid+from+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Generation of functional thyroid from embryonic stem cells.</a> Nature. 491, 66-71 (2012).</li>
<li>van Eyll, J. M., Pierreux, C. E., Lemaigre, F. P., Rousseau, G. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shh-dependent+differentiation+of+intestinal+tissue+from+embryonic+pancreas+by+activin+A%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Shh-dependent differentiation of intestinal tissue from embryonic pancreas by activin A.</a> J. Cell Sci. 117, 2077-2086 (2004).</li>
<li>Hick, A. -C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanism+of+primitive+duct+formation+in+the+pancreas+and+submandibular+glands%3A+a+role+for+SDF-1%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Dev.+Biol.+9%22%5BJournal%5D)">Mechanism of primitive duct formation in the pancreas and submandibular glands: a role for SDF-1.</a> BMC Dev. Biol. 9. , (2009).</li>
<li>Pierreux, C. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epithelial%3AEndothelial+cross-talk+regulates+exocrine+differentiation+in+developing+pancreas%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Epithelial:Endothelial cross-talk regulates exocrine differentiation in developing pancreas.</a> Dev. Biol. 347, 216-227 (2010).</li>
<li>Puri, S., Hebrok, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamics+of+embryonic+pancreas+development+using+real-time+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Dynamics of embryonic pancreas development using real-time imaging.</a> Dev. Biol. 306, 82-93 (2007).</li>
<li>Petzold, K. M., Spagnoli, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+system+for+ex-vivo+culturing+of+embryonic+pancreas%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">A system for ex-vivo culturing of embryonic pancreas.</a> J. Vis. Exp. , (2012).</li>
<li>Watanabe, T., Costantini, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+analysis+of+ureteric+bud+branching+morphogenesis+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Real-time analysis of ureteric bud branching morphogenesis in vitro.</a> Dev. Biol. 271, 98-108 (2004).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Questo documento descrive un metodo per la dissezione e la coltura espianti tiroidei (E12.5) o lobi (E14.5), al fine di studiare e comprendere meglio le complesse vicende che portano alla formazione della tiroide. Grazie alla duplice origine del anlagen tiroide (anlage linea mediana e due corpi laterali ultimobranchial), e le loro piccole dimensioni, un frammento di tessuto E12.5 rostrale localizzato alle arterie arco faringeo, e contenente la trachea, ma non l&#39;esofago è microdissezione. Come illustrato, entro un pe...

La tiroide è una raccolta di sfere epiteliali indipendenti, chiamati follicoli, circondato da una fitta rete di capillari endoteliali. Questa organizzazione permette la funzione della tiroide: i capillari endoteliali forniscono tireociti con iodio, necessari per T3 e T4 sintesi degli ormoni, e distribuire questi ultimi a tutto il corpo. Sparsi tra i follicoli e dei capillari, C-cellule producono l&#39;ormone calcitonina hypocalcemic 1. Anche se l&#39;architettura della tiroide adulti e le funzioni sono ben noti, i meccanismi cellulari e molecolari coinvolti nella tiroide sviluppo embrionale (formazione del follicolo e differenziazione) sono lungi dall&#39;essere compreso. Durante l&#39;embriogenesi, tireociti progenitore nasce come un ispessimento (anlage linea mediana) della parete ventrale del endoderma foregut al giorno embrionale (e) 8,5 nell&#39;embrione topo, mentre cellule C progenitori origine a E11.5 come sporgenze a forma di gocciolina ( bo ultimobranchialmuore), della quarta tasche faringee 2-6. La gemma linea mediana stacca quindi dal endoderma, si espande bilateralmente a fondere a E13.5 con gli organi ultimobranchial su ogni lato della trachea. Infine, tireociti organizzano in follicoli e C-cellule si differenziano. Le conoscenze attuali sulla formazione tiroide proviene principalmente da analisi istologica dei tessuti fissi, ma gli eventi morfogenetici coinvolti nella formazione tiroide sono altamente dinamico e coinvolgere comunicazioni e le interazioni tra diversi tipi di cellule e con la matrice extracellulare. Lavoro recente ha dimostrato che progenitori tireocita producono alti livelli di VEGF per reclutare cellule endoteliali alla tiroide sviluppo, e, a sua volta, reclutati cellule endoteliali promuovere la formazione del follicolo e cellule C differenziazione 7. La maggior parte degli studi ex vivo sulla tiroide sono stati effettuati su cellule isolate adulte tiroide-derivato, coltivate in 2D coltura tissutale di plastica drocchie o in matrici 3D. L&#39;utilizzo di questi tipi di culture, le cellule follicolari differenziate o rimanere polarizzata e organizzate come i follicoli o riacquisire un organismo 3D 8-10. Tuttavia, queste cellule epiteliali puri, espiantati dal loro ambiente fisiologico, e coltivate in 2D, ignorano interazioni con matrice extracellulare, citochine, fattori di crescita e con altri tipi cellulari, quali le cellule endoteliali o nervi che normalmente incontrano in vivo. Un bel studio recentemente descritto un protocollo di differenziazione delle cellule staminali in follicoli tiroidei con un passo di coltura in 3D matrigel 11. Tuttavia, queste culture 3D mancano contatto con altri tipi di cellule. Sulla base delle esperienze precedenti su pancreas e ghiandole salivari cultura d&#39;organo 12-14, un metodo per la dissezione del mouse embrionali anlagen tiroide e coltivando gli espianti sui filtri semiporoso o su scivoli di plastica microscopia stato sviluppato. Quandolavorare con embrioni E12.5, la doppia origine del abbozzi tiroide (il anlage linea mediana e due corpi laterali ultimobranchial) ha imposto la microdissezione di un grande frammento di tessuto. Questo conteneva la trachea, ma non l&#39;esofago, ed esteso dalle arterie arco faringeo fino a soffiatura aritenoidea. Quando coltivate su filtri, la anlage linea mediana si estende lateralmente su ciascun lato della trachea, dove si fondono con gli organi ultimobranchial per formare i due lobi tiroidei, ancora collegati da uno stretto istmo. Nella cultura, cellule epiteliali proliferano, organizzano in follicoli e si differenziano in tireociti e cellule C, a seconda della loro origine. Le cellule endoteliali contenute nel tessuto microdissezione anche proliferano e invadono i lobi tiroidei associare finalmente stretto contatto con la struttura follicolare epiteliale, indipendentemente flusso sanguigno o fattori circolanti. Come sviluppo degli espianti riassume fedelmente in vivo svilupparezione, questo sistema di coltura è ottimale per studiare morfogenetica e gli eventi che si verificano durante lo sviluppo differenziazione tiroidea. Tessuti tiroidei possono essere ottenute da wild type, knockout o embrioni transgenici fluorescenti, e il sistema cultura è suscettibile di perdita e di guadagno-di-funzione esperimenti. Infine, time-lapse imaging di espianti tiroidei fluorescente su piatti di plastica microscopia potrebbe essere sfruttata per studiare meglio la cinetica e la continuità dei movimenti morfogenetici che si verificano in vivo. Time-lapse imaging è già stata utilizzata per studiare branching morfogenesi del pancreas 15,16 o la gemma ureterale 17.

<table><tbody><tr><td>&micro;-slide 8 pozzetti, ibiTreat, coltura tissutale trattata, sterile</td><td>proxylab</td><td>80826</td><td></td></tr><tr><td>Collagene di tipo I, coda di ratto</td><td>Millipore</td><td>08-115</td><td></td></tr><tr><td>Fibronectina da plasma umano</td><td>Invitrogen</td><td># 33010-018</td><td></td></tr><tr><td>M199</td><td>Invitrogen</td><td>31150-022</td><td></td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Invitrogen</td><td>14025-100</td><td></td></tr><tr><td>Filo di tungsteno</td><td>Goodfellow</td><td>LS237450</td><td></td></tr><tr><td>inserto per piastra di coltura (diametro 12 mm)</td><td>Millipore</td><td>PICM01250</td><td></td></tr><tr><td>GlycoBlue</td><td>Invitrogen</td><td>AM9516</td><td></td></tr><tr><td>E-caderina</td><td>BD Biosciences</td><td>610182</td><td>1/1.000</td></tr><tr><td>Ezrin</td><td>Thermo Scientific</td><td>MS-661-P1</td><td>1/400</td></tr><tr><td>PECAM</td><td>BD Biosciences</td><td>550274</td><td>1/100</td></tr><tr><td>Hoechst</td><td>Sigma</td><td>B2261</td><td></td></tr></tbody></table>

un<em&gt; ex vivo</em&gt; cultura sistema per studiare lo sviluppo della tiroide

An Ex vivo Culture System to Study Thyroid Development

La tiroide è una ghiandola endocrina bilobated localizzata alla base del collo, producendo gli ormoni tiroidei T3, T4, e calcitonina. T3 e T4 sono prodotti da tireociti differenziati, organizzati in sfere chiusi chiamati follicoli, mentre calcitonina è sintetizzato dalle cellule C, intervallati tra i follicoli e una fitta rete di capillari sanguigni. Sebbene architettura tiroide adulto e funzioni sono state ampiamente descritte e studiato, la formazione delle unità &quot;angio-follicolari&quot;, la distribuzione delle cellule C nel parenchima e le comunicazioni paracrini tra cellule epiteliali ed endoteliali è lungi dall&#39;essere compresa. Questo metodo descrive le fasi sequenziali di topo tiroide embrionale anlagen dissezione e la sua cultura sui filtri semiporoso o su scivoli di plastica microscopia. Entro un periodo di quattro giorni, questo sistema di coltura riassume fedelmente nello sviluppo della tiroide vivo. Infatti, (i) bilobation dell&#39;organo verifica (per espianti E12.5), (ii) tireociti precursori organizzano in follicoli e polarizzano, (iii) tireociti e C-cellule si differenziano, e (iv) le cellule endoteliali presenti nel tessuto microdissezione proliferano, migrano nella lobi tiroidei, e strettamente associano con le cellule epiteliali, come fanno in vivo. Tessuti tiroidei possono essere ottenute da wild type, knockout o embrioni transgenici fluorescenti. Inoltre, espianti coltura può essere manipolato per aggiunta di inibitori, bloccando anticorpi, fattori di crescita, o anche cellule o mezzo condizionato. Ex vivo sviluppo può essere analizzato in tempo reale, o in qualsiasi momento della coltura mediante immunoistochimica e RT-qPCR. In conclusione, la cultura espianto tiroide combinato con a valle intera-mount o su sezioni di imaging e di espressione genica fornisce un potente sistema per manipolare e studiare morfogenetiche e differenziazione eventi della tiroide organogenesis.

Anlages tiroide (linea mediana e UB, insieme con i tessuti circostanti) e lobi tiroidei sono sezionati da embrioni di topo a E12.5 e e13.5/e14.5, rispettivamente (Figura 1). Dopo un giorno di coltura sul filtro, la anlage linea mediana è visibile (Figura 2A) come un tessuto allungata si estende sulla parte superiore della trachea. Esso forma progressivamente due lobi su ciascun lato della trachea. Se lobi tiroidei isolati (E13.5 o E14.5) sono coltivate, si espandono, subiscono morfogene...

Questo protocollo descrive la dissezione dell'anlagen tiroideo embrionale di topo e la coltura di espianti su filtri semiporosi o su vetrini plastici per microscopia. Questo sistema è ideale per studiare gli eventi morfogenetici o di differenziazione che si verificano durante lo sviluppo tiroideo di embrioni wild type o knockout ed è suscettibile di esperimenti di guadagno e perdita di funzione.

Un<em&gt; Ex vivo</em&gt; Cultura sistema per studiare lo sviluppo della tiroide

The thyroid is a bilobated endocrine gland localized at the base of the neck, producing the thyroid hormones T3, T4, and calcitonin. T3 and T4 are ...

L'obiettivo generale di questa procedura è dissezionare colture ex vivo, impianti tiroidei embrionali di topo o lobi, al fine di studiare gli eventi morfogenetici e di differenziamento che si verificano durante lo sviluppo della tiroide. Questo viene ottenuto rimuovendo innanzitutto la mascella superiore e la parte inferiore del corpo di embrioni di topo al giorno embrionale E 12,5 fino a E 14,5 per isolare la regione del collo degli embrioni.Nel secondo passaggio, si rimuovono il tubo neurale, i tessuti laterali e la lingua per esporre la parte superiore della trachea e dell'esofago. Successivamente, il germoglio tiroideo, le regioni o i lobi vengono ulteriormente puliti da eventuali tessuti indesiderati. Nell'ultima fase, gli impianti tiroidei vengono seminati per la coltura su una micropiastrella rivestita o su un filtro.In definitiva, è possibile eseguire imaging a intervalli di tempo, colorazione immunohistochimica o analisi dell'espressione genica per studiare l'organizzazione tridimensionale della morfogenesi epiteliale e dei follicoli, la vascolarizzazione degli innesti o la differenziazione dei progenitori tiroidei. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fond

an-ex-vivo-culture-system-to-study-thyroid-development

Research

Ricerca

JoVE Journal

Biology

Biologia

Questo video dimostra la dissezione e la rimozione del timo del feto e la preparazione delle colture ex vivo di 2-dGuo trattati con timo.

La preparazione di 2-dGuo-trattati Organ Culture Timo

Qui, si descrive un metodo per l'isolamento, la cultura e manipolazione del pancreas embrionali di topo. Ciò rappresenta un...

Un sistema per<em&gt; Ex vivo</emColtura&gt; del pancreas embrionale

Questo video descrive la procedura per l'inoculazione ortotopica di cellule tumorali tiroidee nella ghiandola tiroidea di modelli murini, che possono quindi fungere da preziosa piattaforma per valutare la cancerogenesi e scoprire potenziali strategie di trattamento.

Inoculazione ortotopica di cellule tumorali tiroidee nella tiroide murina: una procedura per stabilire un modello murino di carcinoma tiroideo ortotopico

Generazione di un modello ortotopico murino di carcinoma anaplastico della tiroide è descritto qui. Questa tecnica impiega posizionamento chirurgico di cellule di cancro della tiroide anaplastico umani nella tiroide di topi immunodeficienti, creando così un ambiente più clinicamente rilevante per studiare la progressione della malattia, così come schermo interventi terapeutici innovativi.

Un modello di mouse ortotopico di anaplastico della tiroide Carcinoma

Lo studio delle cellule epiteliali midollari del timo in vitro è stato in gran parte infruttuoso, poiché gli attuali sistemi di coltura 2D non imitano lo scenario in vivo. Il sistema di coltura 3D qui descritto - un modello di coltura organotipica della pelle modificata - si è dimostrato superiore nella ricapitolazione della proliferazione, della differenziazione e del mantenimento dell'espressione genica promiscua di mTEC.

3D organotipica Co-cultura Modello Sostenere midollare timica epiteliale proliferazione, differenziazione e promiscua genica

La coltura di goccioline verticali ex vivo è un'alternativa alle attuali tecniche sperimentali in vitro e in vivo. Questo protocollo è facile da eseguire e richiede piccole quantità di reagente, consentendo al contempo la capacità di manipolare e studiare la vascolarizzazione, la morfogenesi e l'organogenesi fetale.

Utilizzando<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Upright Droplet Culture di interi organi fetali per studiare i processi evolutivi durante mouse Organogenesi

Questo articolo fornisce un approccio aggiornato al sistema classico pollo quaglia chimera di studiare la formazione di organo, combinando romanzo procedure sperimentali in vitro e in ovo .

Approccio in due fasi per esplorare e tardo-fasi iniziali di formazione dell'organo nel modello aviaria: il timo e le ghiandole paratiroidali organogenesi paradigma

Qui, presentiamo un organotipiche coltura protocollo per crescere organi embrionali di pollo in vitro. Utilizzando questo metodo, lo sviluppo del tessuto embrionale pollo può essere studiato, pur mantenendo un elevato grado di controllo dell'ambiente di cultura.

Metodo di coltura organotypic per studiare lo sviluppo dei tessuti embrionali di pollo

Il modello murino dell'indicatore di azione dell'ormone tiroideo è stato sviluppato per consentire la quantificazione tessuto-specifica dell'azione locale dell'ormone tiroideo utilizzando il suo meccanismo di regolazione endogena. Recentemente, è stato dimostrato che il modello è adatto per caratterizzare sostanze chimiche interferenti endocrine che interagiscono con l'economia degli ormoni tiroidei, sia con metodologie ex vivo che in vivo .

Caratterizzazione in vivo degli effetti chimici di interferenza endocrina tramite l'indicatore di azione dell'ormone tiroideo

Questo video dimostra nuova cultura, un metodo con cui sono coltivati ​​embrioni di pollo al di fuori l'uovo per un massimo di 24 ore. Questo metodo permette di studiare lo sviluppo precoce (stria primitiva a 14 som.), Un periodo corrispondente a E7-9 nel topo. Le applicazioni di questa tecnica sono elettroporazione, ibridazione in situ e immunoistochimica.

Metodo per la Cultura di Chick primi embrioni ex vivo (Nuova Cultura)

Impara a dissezionare e coltivare esplanti tiroidei embrionali di topo per studiare eventi morfogenetici e di differenziazione. Questo metodo consente analisi di imaging, immunofluorescenza ed espressione genica.

Un

Esplora altri video