Un Ex vivo Cultura sistema per studiare lo sviluppo della tiroide

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di sezionare una coltura ex vivo, un topo, impianti tiroidei embrionali o lobi per consentire lo studio degli eventi morfogenetici e di differenziazione che si verificano durante lo sviluppo della tiroide. Ciò si ottiene rimuovendo prima la mascella superiore e la parte inferiore del corpo del giorno embrionale. Embrioni di topo da E 12,5 a E 14,5 per isolare la regione del collo degli embrioni.

Nella seconda fase, il tubo neurale, i tessuti laterali e la lingua vengono rimossi per esporre la parte superiore della trachea e dell'esofago. Successivamente, la gemma tiroidea, le regioni o i lobi vengono ulteriormente ripuliti da eventuali tessuti indesiderati. Nella fase finale, le protesi tiroidee vengono piastrate per la coltura su un micropozzetto rivestito o su un filtro.

Infine, l'imaging time lapse, l'immunocolorazione o l'analisi dell'espressione genica possono essere eseguiti per studiare l'organizzazione tridimensionale della morfogenesi epiteliale e dei follicoli, la vascolarizzazione degli impianti o la differenziazione dei progenitori tiroidei. Questo metodo può aiutare a rispondere alle principali esigenze di sviluppo e differenziazione. Domanda sull'organizzazione delle cellule epiteliali tiroidee in 3D, formazione del lume, differenziazione cellulare, polarizzazione e crescita.

A dimostrare la procedura saranno Fidel Marcel, uno studente laureato, e Myla LaCorte, un postdoc, entrambi del mio laboratorio In condizioni sterili nella cappa a flusso laminare. Due ore prima dell'isolamento del tessuto tiroideo, diluire il collagene sterile di tipo uno a 50 microgrammi per millilitro. Concentrazione finale in 10 millimolari di acido cloridrico e porre il collagene sul ghiaccio.

Quindi coprire ciascuno dei pozzetti di una camera di coltura di plastica con 200 microlitri di collagene diluito e incubare la camera a temperatura ambiente Dopo due ore, aspirare il collagene. Sciacquare i pozzetti con terreno M1 99 e aggiungere un volume minimo di 200 microlitri di terreno di coltura a ciascuno. Posizionare bene le camere rivestite nell'incubatrice e poi procedere con la dissezione tiroidea.

Per prima cosa, posizionare l'utero sezionato in una piastra di 10 centimetri contenente HBSS. Successivamente, usa una pinza per tenere un'estremità dell'utero e poi apri l'utero con piccole forbici per liberare consecutivamente ciascuno degli embrioni. Usa le forbici per separare gli embrioni dalla placenta, quindi trasferisci gli embrioni all'interno delle loro membrane extra embrionali in una nuova piastra di 10 centimetri contenente HBSS fresco.

Successivamente, continuare la dissezione al microscopio stereoscopico per ogni embrione. Per prima cosa, rimuovere il sacco vitellino e l'amnio. Tenendo poi gli aghi di tungsteno nei capillari di vetro come coltello e forchetta.

Rimuovere la parte superiore della testa, compresa la mascella superiore e le orecchie. Tieni l'embrione sulla schiena. Quindi rimuovere un pezzo in più del tubo neurale e successivamente rimuovere la parte inferiore dell'embrione appena sotto gli arti anteriori e sopra il cuore.

Per orientare il tessuto, trasferire la fetta di embrione contenente la lingua e la regione del collo in una nuova piastra di 10 centimetri contenente HBSS fresco e rimuovere il tubo neurale e i tessuti posteriori all'esofago e alla trachea. Ora seziona delicatamente la fetta di tessuto lungo entrambi i lati della lingua. Quindi localizzare l'esofago e la trachea, sezionare la lingua, lasciando il rigonfiamento del retinoide e il tessuto su entrambi i lati dell'esofago e della trachea.

Dopo aver rimosso la lingua, sezionare l'esofago e posizionare la trachea con il lato ventrale rivolto verso l'alto. Quindi sezionare i tessuti indesiderati come il timo e tutti i tessuti situati lateralmente alle arterie dell'arco faringeo. Quindi, per gli embrioni E 13.5 o E 14.5, visualizzare i lobi tiroidei su ciascun lato della trachea e sezionare ulteriormente i lobi dalla trachea.

Per gli embrioni di E 12,5, la dissezione può essere eseguita come appena dimostrato fino a dopo l'asportazione della lingua e dell'esofago. Quindi, dopo aver localizzato le arterie dell'arco faringeo, rimuovere tutti i tessuti laterali come per gli embrioni da E 13,5 a 14,5. Infine, utilizzando un puntale filtrante pre-bagnato su una micropipetta P 200, trasferire il tessuto isolato in una piastra di coltura da 35 millimetri contenente terreno di coltura preriscaldato.

Prima di placcare la tiroide da E 13,5 a E 14,5 spiegare. In primo luogo, lavare il tessuto mediante trasferimento successivo in tre pozzetti di una piastra a 24 pozzetti contenente un millilitro di terreno di coltura preriscaldato per placcare i lobi sulle camere pre-rivestite. Per prima cosa, aspirare il terreno di coltura e utilizzare una micropipetta con puntali filtrati per placcare con cura un lobo tiroideo in ciascuna delle camere di coltura.

Rimuovere il terreno in eccesso e quindi posizionare la camera di coltura in un incubatore per colture tissutali per consentire agli espianti di attaccarsi alla matrice. Quindi, dopo due ore, aggiungere delicatamente da 200 a 300 microlitri di terreno di coltura preriscaldato a ciascun pozzetto e riposizionare le camere nell'incubatore per placcare la regione della trachea E 12,5 o i lobi tiroidei su filtri semiporosi. Per prima cosa, riempire i pozzetti di una piastra da 24 pozzetti con centinaia e 30 microlitri di coltura Prewarm.

Posizionare i filtri sul mezzo. Facendo attenzione a non intrappolare bolle d'aria sotto il filtro di coltura. Quindi utilizzare una micro pipetta con puntali filtrati per trasferire con cura l'explan o i lobi tiroidei e un volume minimo di terreno al centro di ciascuno dei filtri fino a un massimo di quattro explan per filtro.

Quando si inclinano le X sul filtro, è importante trasferirle al centro del filtro con una quantità minima di fluido per evitare che il fluido entri in contatto e crei un menisco con la parete del filtro. Infine, rimuovere il terreno in eccesso e utilizzare un ago di tungsteno per distanziarli. Quindi posizionarlo nell'incubatore di coltura tissutale per un massimo di sette giorni, cambiando il terreno di coltura a giorni alterni sotto la cappa a flusso laminare.

Dopo un giorno di coltura su un filtro, la linea mediana su laa è visibile come un tessuto allungato che si estende per tutta la lunghezza superiore e forma due lobi su ciascun lato della trachea. Con la coltura, i lobi si espandono subendo l'organizzazione morfogenetica delle cellule epiteliali in strutture follicolari macroscopicamente visibili. Come dimostrato in queste immagini, l'organizzazione e la polarizzazione delle cellule epiteliali coerenti e positive possono essere visualizzate mediante l'immunomarcatura ezrin.

Nel corso del tempo, le strutture intracellulari positive ezrin si sono fuse con il polo della cellula che diventerà il polo apicale. Durante questo processo, le cellule endoteliali positive a quattro pcam proliferano e si organizzano attorno ai follicoli in via di sviluppo per formare unità angiofollicolari. Per quantificare il differenziamento dei thro, dei citi e delle cellule C, l'espressione genica può essere analizzata mediante R-T-Q-P-C-R di RNA, isolato dai lobi tiroidei in coltura.

Mentre l'espressione del fattore di trascrizione tiroideo, NK X 2.1, non cambia durante la coltura, l'espressione della tireoglobulina specifica del thy e della calcitonina specifica delle cellule C aumenta notevolmente, indicando un differenziamento funzionale. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come sezionare e coltivare la tiroide explan. Non sei pronto per eseguire esperimenti di guadagno e perdita di funzione utilizzando embrioni wild type o NOCO.