Name: Sviluppo di un Varicella-Zoster immunità cellulo-mediata specifica-Virus-IFN γ ELISpot test per valutare seguito cordone ombelicale trapianto di sangue (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-07-09T21:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 4 s
Description: Scopri il test IFN-γ ELISpot per valutare la risposta immunitaria cellulo-mediata contro il virus varicella-zoster. Questo metodo rileva la produzione di citochine a livello di singola cellula con attrezzatura di base.

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Gli autori desiderano ringraziare i partecipanti allo studio e ai loro genitori. Vorremmo anche ringraziare il Dott. Réjean Lapointe (CHUM Notre-Dame, Montreal, Canada) per l&#39;accesso al suo lettore ELISpot, Dr. Lubo Alexandrov per l&#39;analisi statistica, e Denis Blais, Sandra Caron, Silvie Valois e Martine Caty per esperto tecnico assistenza. Sostenuto da finanziamenti le Fonds d&#39;opération pour les projets de recherche clinique et d&#39;evalution des tecnologie (CHU Sainte-Justine) per HS e PO, per la Fondation Centre de cancérologie Charles-Bruneau, e dal Leukemia &amp; Lymphoma Society of Canada. ISF è stato sostenuto da borse di studio la Fondation CHU Sainte-Justine e le Fonds de la recherche du Québec-santé (FRQS). AJG è stato il destinatario di borse di studio dal Dipartimento di Microbiologia, Immunologia e Malattie infettive, Université de Montréal (Gabriel-Marquis borsa di studio), FRQS, e la Canadian Institutes of Health Ricerca (CIHR). NM è stato supportato da la Fondation CHU Sainte-Justine, la Fondazione Cole, e FRQS.

Questo protocollo di ricerca è stato approvato dal Consiglio di CHU Sainte-Justine, Montreal, Quebec, Canada, dove è stato condotto lo studio Istituzionale valutazione etica. Il consenso informato è stato chiesto e ottenuto da tutti i partecipanti allo studio, i loro genitori o tutori legali. Tutte le procedure eseguite nei giorni 1 e 2 devono essere eseguite in condizioni sterili (cioè sotto una cappa a flusso laminare). Procedure di sicurezza standard per il trattamento del sangue umano devono essere rigorosamente rispettate. 1. Rivestimento delle piastre <ol><li> Permeabilize il difluoruro di polivinilidene (PVDF) membrane in fondo 96 pozzetti MultiScreen IP piastre ELISpot bianco aggiungendo ad ogni pozzetto 20 pl di 35% etanolo per 1 min. Membrane dovrebbero diventare leggermente traslucido. </li><li> Lavare immediatamente i pozzetti 3 volte con 200 ml di 1x tampone fosfato (PBS; 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na 2 HPO 4, 2 mM KH 2 PO 4, pH 7.4) utilizzando un multichannel pipetta o un dispositivo simile. Questo passaggio è fondamentale dato che i residui di etanolo possono influenzare la vitalità cellulare e legame di anticorpo di cattura. Piastre ELISpot sono fragili e devono essere maneggiati con cura: l&#39;uso di un lavatore automatico non è raccomandato. </li><li> Cappotto pozzetti con 10 ml di topo purificato cattura IFN-γ anticorpo anti-umano diluito in 1x PBS ad una concentrazione finale di 10 pg / ml. Coprire le piastre con pellicola trasparente e regolare incubare una notte a 4 ° C. </li></ol> 2. Blocco Plates <ol><li> Svuotare i pozzetti, toccando asciugare e lavare i piatti 5 volte con 200 ml di 1x PBS. </li><li> Riempire i pozzetti con 200 ml di terreno RPMI 1640 completo e incubare le piastre per 2 ore a 37 ° C (blocco passo). </li><li> Lavare le piastre 5x con 200 microlitri di PBS 1x e mantenere i pozzi pieno di PBS 1x finché le cellule sono pronte per essere placcato. </li></ol> 3. Cella placcatura e di stimolazione <ol><li> Preparare peripheral cellule mononucleate del sangue (PBMC) a partire da campioni di sangue venoso umano mediante centrifugazione su gradienti di Ficoll-Paque utilizzando le procedure standard. In alternativa, utilizzando metodi standard, disgelare le aliquote di PBMC congelati in azoto liquido. Dopo centrifugazione ultimi, risospendere le cellule ad una concentrazione finale di 2 x 10 6 cellule / ml e incubate overnight a 37 ° C sotto atmosfera di CO 2 5% in un incubatore a camicia d&#39;acqua. </li><li> Rimuovere PBMC dall&#39;incubatore e risospendere in un volume finale di 5 ml di RPMI completo 1640. </li><li> Incubare PBMC in presenza di 10 ml di endonucleasi geneticamente da Serratia marcescens per 5 min a temperatura ambiente. </li><li> Rimuovere un&#39;aliquota 50 microlitri di PBMC e mescolare con 50 ml di trypan colorante blu. Contare le celle e stimare% vitalità usando un emocitometro e l&#39;esame microscopico (metodo esclusione del colorante). Vari metodi automatizzati per il conteggio e la valutazione della vitalità cellulare can al cellularecosì essere utilizzato. PBMC deve essere&gt; 95% praticabile. Scartare campione quando vitalità è inferiore al 95%. </li><li> Centrifugare PBMC a 700 xg per 5 minuti, il surnatante scarto, e risospendere le cellule in AIM-V mezzo supplementato con 2% (v / v) di siero umano inattivato (HIS) ad una concentrazione finale di 2 x 10 6 cellule / ml. Mantenere a 37 ° C fino miscele di stimolazione sono aggiunti alla piastra. </li><li> Aggiungere ai pozzetti, una goccia alla volta, 100 microlitri della miscela stimolazione appropriata. Tre le miscele di stimolazione devono essere utilizzati come descritto di seguito: <ol><li> Medio uso AIM-V integrato con il 2% (v / v) di siero umano inattivato (IHS) come controllo negativo. </li><li> Utilizzare anti-CD3 anticorpo monoclonale (clone OKT3) diluito in mezzo AIM-V supplementato con 2% (v / v) IHS ad una concentrazione finale di 0,5 mg / ml come controllo positivo). </li><li> Utilizzare antigene VZV, sotto forma di una γ-irradiati (10.000 Gy; 30 min tempo di esposizione) vaccino vivo attenuato contro VZV (1.350 unità formanti placca [PFU] / ml) diluizioneTED 1:200 in AIM-V mezzo supplementato con 2% (v / v) IHS) o 1 mg di una miscela equimolare di 67 peptidi (15 residui amminoacidici) sintetizzato sulla base della sequenza del VZV immediatamente precoce (IE63) fosfoproteina . Controllare l&#39;efficacia irradiazione monitorando l&#39;assenza di segni visibili di effetto citopatico dopo 4 giorni in culture di PBMC. </li><li> Preparare tutti i pozzetti in duplicato. </li></ol></li><li> Aggiungere ai pozzetti, una goccia alla volta, 100 microlitri di cellule preparate nel passo 5.4 ai pozzetti appropriati. Due pozzetti devono essere lasciati senza cellule (controllo negativo). Incubare per 20 ore a 37 ° C sotto atmosfera di CO 2 5% in un incubatore a camicia d&#39;acqua. Non scuotere, spostare o impilare i piatti su uno sopra l&#39;altro durante l&#39;incubazione. </li></ol> 4. Spot Sviluppo e rilevamento <ol><li> Scartare le cellule e lavare le piastre 10x con PBS 1x integrato con 0,05% (v / v) di Tween 20 (PBST). Tween 20 aiuta staccare cellule che hanno aderito al PVDF membrane seguente notte di incubazione. </li><li> Usando una pipetta multicanale, aggiungere 100 ml di 0,5 mg / ml biotina coniugato anti-IFN-γ anticorpo monoclonale (clone 4S.B3) diluito in 1x PBS contenente 0,5% (w / v) di siero albumina bovina (BSA). Incubare le piastre per 2 ore a temperatura ambiente. </li><li> Lavare i pozzetti 6x con PBST e aggiungere ogni ben 100 ml di streptavidina conjugatd con fosfatasi alcalina diluito 1:1000 in 1x PBS contenente 0,5% (w / v) BSA. Coprire le piastre e incubare per 1 ora a temperatura ambiente. </li><li> Lavare le piastre 3x con PBST e 3x con 1x PBS. Aggiungere 100 pl di un fosfato 5-bromo-4-cloro-3-indolil (BCIP) / nitro blu tetrazolio cloruro (NBT) soluzione di substrato e incubare 5 min a temperatura ambiente. </li><li> Lavare le piastre sotto acqua distillata. Rimuovere la sezione inferiore della piastra ELISpot e lavare entrambi i lati della membrana con acqua distillata. Far asciugare i piatti. </li><li> Esaminare i pozzi ed enumerare le macchie con un d stereoscopicamicroscopio issection o la scansione delle piastre utilizzando un contatore posto automatizzato. Conservare le piastre lontano dalla luce se non possono essere esaminati lo stesso giorno. <ol><li> Calcolare la media dei numeri di punti contati in corrispondenti pozzetti duplicati e sottrarre il numero di punti contati in pozzetti di controllo negativo (nessuna cella) dal numero di punti contati nei pozzetti. </li><li> Esprimere la produzione di IFN-γ, come il numero di unità in loco di formatura (SFU) per 10 6 PBMC. </li><li> Si consideri che i campioni di prova sono positivi se il numero di SFU è&gt; 50 per 10 6 PBMC e 2 deviazioni standard (SD) sopra il controllo negativo (medium cellule + AIM-V integrato con il 2% (v / v) IHS). </li><li> Utilizzare un valore di 400 SFU per bene quando i punti sono troppi per essere contati. </li></ol></li><li> Verificare se i dati ELISpot sono distribuiti normalmente o non utilizzare il test di Kolmogorov-Smirnov. Quando i dati sono distribuiti normalmente, effettuare confronti statistici con t tes di Studentt (2 gruppi) o ANOVA e il post-test di Bonferroni (confronti multipli). Se i dati non sono distribuiti normalmente, utilizzare il test di Mann-Whitney U (2 gruppi) o il test di Kruskal-Wallis e post-test di Dunn (confronti multipli). </li></ol>

Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari in competizione.

Modifiche e risoluzione di problemi: saggi IFN-γ ELISpot sono stati utilizzati per esaminare le risposte immunitarie mediate da cellule contro una varietà di patogeni microbici, inclusi tipo virus dell&#39;immunodeficienza umana 1 (HIV-1) 24,25, virus dell&#39;epatite C (HCV) 26, 27, e Mycobacterium tuberculosis 28,29, solo per citarne alcuni. Qui abbiamo descritto lo sviluppo di un ELISpot test IFN-γ per misurare l&#39;immunità cellulare contro, con la speranza di definire corr...

La prima volta nel 1989 UCBT è sempre più utilizzato come parte del trattamento di vari disturbi del sangue neoplastiche e non neoplastiche in bambini 1. VZV è un alphaherpesvirus umana citopatico che provoca due malattie diverse, varicella (dopo l&#39;infezione primaria) e dell&#39;herpes zoster (dopo la riattivazione). Dopo l&#39;infezione primaria, VZV persiste per tutta la vita dell&#39;ospite riparata entro nervi sensoriali del gangli spinali. Una delle complicanze infettive più minacciosi seguenti UCBT è associato con VZV 2-4. Nel nostro centro clinico, in assenza di VZV la profilassi, l&#39;incidenza cumulativa di malattia VZV malattia da VZV a 3 anni postUCBT era del 46% 2. In questi pazienti, de novo infezione con o riattivazione di VZV è spesso associato con diffusione viscerale al sistema nervoso centrale, polmoni e fegato 5-7. Come profilassi conseguenza, aciclovir, valaciclovir e famciclovir viene comunemente somministrato a UBCT destinatari 8,9. Tuttavia, questa strategia di trattamento non tiene conto del potenziale protettivo di VZV linfociti T specifici o la cinetica di ricostituzione del VZV specifiche risposte delle cellule T. Potenziali problemi associati con l&#39;uso crescente di profilassi antierpetico lungo termine includono a) overtreatment paziente; b) lo sviluppo di resistenza ai farmaci antivirali 10,11; c) violazione di VZV specifico ricostituzione immunitaria 12,13. Poiché il rilevamento di VZV funzionali specifici linfociti T è correlata con la presenza di una protezione a lungo termine da VZV e un miglior risultato clinico 4,14,15, monitoraggio delle cellule mediata risposte immunitarie contro VZV nel periodo post-trapianto potrebbe comportare un uso più razionale antivirale trattamento consentendo medici di distinguere i pazienti che potrebbero trarre vantaggio da VZV profilassi da coloro il cui sistema immunitario è in grado di controllare la replicazione VZV 4,13. Il ELISpot saggio IFN-γ è ampiamente usato per le cellule monitoraggio risposte immunitarie mediate in una varietà di sistemi sperimentali e condizioni cliniche. Macchie sono generate a seguito clivaggio di un substrato cromogenico, generando un precipitato visibile e stabile al sito di reazione. Ogni singolo spot rappresenta quindi l&#39;impronta di una cella producenti citochine individuale. IFN-γ ELISpot non solo misura la capacità delle singole cellule ex vivo per produrre IFN-γ in risposta alla stimolazione in vitro con antigene affine, ma fornisce anche una stima della frequenza di rispondere cellule in una data popolazione cellulare 16,17. Oltre alla sua elevata sensibilità, IFN-γ ELISpot è semplice da eseguire, rendendo possibile il suo impiego nel contesto di protocolli clinici personalizzati volti a guidare l&#39;inizio o cessazione del trattamento antivirale. La procedura di seguito dettagliata descries un saggio ELISpot che è specificamente progettato per rilevare e misurare la produzione di IFN-γ da parte delle cellule mononucleate del sangue periferico dopo stimolazione in vitro con antigeni derivati ​​VZV.

<table><tbody><tr><td>Provetta Leucocep</td><td>VWR</td><td>89048-936/89048-932</td><td>provette da 12 ml o 50 ml possono essere utilizzate a seconda del volume di sangue.</td></tr><tr><td>Ficoll-Paque</td><td>GE Healthcare</td><td>17-1440-02</td><td>Proteggere dalla luce.</td></tr><tr><td>Benzonasi nucleasi</td><td>Novagen</td><td>70746-3</td><td>Mantenere a -20 &#176;C.</td></tr><tr><td>MultiScreenHTS-IP Piastra filtrante</td><td>Millipore</td><td>MSIPS4W10</td><td>sterile con dimensione dei pori di 0,45 &,micro;m.&nbsp;</td></tr><tr><td>Mouse anti-umano IFN-&gamma; catturare l'anticorpo</td><td>BD Biosciences</td><td>551221</td><td>clone NIB42.</td></tr><tr><td>Pepmix VZV IE63&nbsp;</td><td>JPT Peptide Technologies</td><td>PM-VZV-IE63</td><td>Dissolvere il contenuto di una fiala in 40 &#956; l di DMSO. Utilizzare entro 6 mesi.</td></tr><tr><td>Anticorpo monoclonale coniugato con biotina anti-IFN-&gamma</td><td>BD Biosciences</td><td>554550</td><td>4SB3 clone.</td></tr><tr><td>Streptavidina coniugata con fosfatasi alcalina</td><td>Bio-Rad Life Science</td><td>170-3554</td><td>Diluire per l'uso lo stesso giorno.</td></tr><tr><td>BCIP/NBT</td><td>Bio-Rad Life Science</td><td>170-6432</td><td>Protegge dalla luce.</td></tr></tbody></table>

sviluppo di un varicella-zoster immunità cellulo-mediata specifica-virus-ifn γ elispot test per valutare seguito cordone ombelicale trapianto di sangue

Development of an IFN-&#947; ELISpot Assay to Assess Varicella-Zoster Virus-specific Cell-mediated Immunity Following Umbilical Cord Blood Transplantation

Varicella zoster (VZV) è una causa importante di morbilità e mortalità dopo trapianto di sangue del cordone ombelicale (UCBT). Per questo motivo, la profilassi antierpetico è amministrato sistematicamente ai destinatari UCBT pediatrici per evitare complicazioni associate con infezione VZV, ma non vi è un consenso prove basate forte che definisce la sua durata ottimale. Poiché cellule T mediata è responsabile del controllo di infezione VZV, valutare la ricostituzione di VZV specifiche risposte delle cellule T seguente UCBT potrebbe fornire indicazioni sul fatto profilassi possono essere mantenute o possono essere sospesi. A tal fine, un VZV specifico interferone gamma (IFN-γ) immunospot enzimatico (ELISpot) saggio è stata sviluppata per caratterizzare la produzione di IFN-γ da linfociti T in risposta alla stimolazione in vitro con vaccino vivo attenuato irradiato VZV. Questa analisi fornisce una misurazione rapida, riproducibile e sensibile di VZV specifico cell immunità adatto per monitorare la ricostituzione del VZV dell&#39;immunità specifica in ambito clinico e di valutare la risposta immunitaria agli antigeni VZV mediata.

Il protocollo ELISpot IFN-γ sopra descritto è stato sviluppato ed ottimizzato nel nostro laboratorio per misurare l&#39;entità e la qualità delle cellule risposte immunitarie mediate dirette contro VZV 4. Diverse fonti di antigene VZV possono essere utilizzati per la fase di stimolazione. Questi includono: a) disponibile in commercio dei detergenti estratti inattivati ​​da VZV infettate cellule Vero 18; b) le piscine di sovrapposizione peptidi sintetici da specifiche proteine ​​codificate VZV, comp...

Generazioni di nuovi saggi funzionali quali interferone gamma (IFN-γ) ELISpot, che rilevano la produzione di citochine a livello di singola cellula e forniscono sia la caratterizzazione quantitativa e qualitativa delle risposte delle cellule T possono essere utilizzati per valutare la risposta immunitaria cellulo-mediata contro varicella zoster virus (VZV).

Sviluppo di un Varicella-Zoster immunità cellulo-mediata specifica-Virus-IFN γ ELISpot test per valutare seguito cordone ombelicale trapianto di sangue

Varicella zoster virus (VZV) is a significant cause of morbidity and mortality following umbilical cord blood transplantation (UCBT). For this reason, ...

L'obiettivo generale della seguente procedura è rilevare la produzione di IFN gamma a livello singola cellula per valutare la risposta immunitaria mediata da cellule diretta contro il virus della varicella-zoster o VZV. Questo viene ottenuto innanzitutto ricoprendo le pozzette di una piastra per spot da 96 pozzette con un anticorpo monoclonale di cattura per l'IFN gamma. Nel secondo passaggio, le cellule vengono seminate e stimolate con antigene VZV.Successivamente, le cellule vengono rimosse e l'IFN gamma catturato viene marcato con un anticorpo di rilevamento, consentendo infine di quantificare la produzione di IFN gamma e l'entità e la qualità delle risposte immunitarie cellulari dirette contro il VZV. Il principale vantaggio di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti, come il PMHC, i tremori e la colorazione intracellulare delle citochine, è che il saggio del "spot" per l'interferone gamma rappresenta un test robusto, riproducibile e ricco di informazioni, eseguibile su campioni di sangue venoso utilizzando attrezzature relativamente semplici, come incubatori, centrifughe e microscopi da dissezione.Per preparare le piastre per la procedura, iniziare aggiungendo 20 microlitr

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Immunology and Infection

Immunologia e Infezioni

L'identificazione di bersagli microbici di immunità adattativa nelle malattie idiopatica può essere realizzato tramite l'uso delle analisi enzima-collegata immunospot.

Enzyme-linked Immunospot Assay (ELISPOT): Quantificazione di Th-1 risposte cellulari immunitarie contro antigeni microbici

Un rapido, protocollo semplice e conveniente per la generazione di donatore-derivati ​​multivirus specifici CTL (RCtl) per infusione a trapianto allogenico di cellule staminali emopoietiche (HSCT) a rischio di sviluppare infezioni da CMV, EBV o Adv. Questo processo di fabbricazione è GMP e deve assicurare l'applicazione più ampia di cellule T immunoterapia al di là di centri specializzati.

Generazione di Multivirus-cellule T specifiche per prevenire / curare infezioni virali dopo trapianto allogenico di cellule staminali ematopoietiche

Qui si descrive la prima pratica di fabbricazione (GMP) conforme metodo per produrre virus-specifici linfociti T citotossici (CTL) da sangue del cordone ombelicale, fonte di cellule T prevalentemente ingenuo.

Espansione linfociti T citotossici da sangue del cordone ombelicale che Target Citomegalovirus, virus di Epstein-Barr virus, e Adenovirus

La caratterizzazione di epitopi per cellule T di patogeni che causano infezioni localizzate, come il papillomavirus umano, rappresenta una sfida a causa del numero limitato di cellule T in circolo. Viene descritto un metodo mediante il quale cellule T rare sono state isolate e caratterizzate a partire da un numero molto ridotto di cellule.

L&#39;uso di interferone-γ Enzyme-linked Assay Immunospot per caratterizzare Nuovi epitopi T-cellulari di Papillomavirus Umano

L'obiettivo di questo protocollo è produrre cellule T di grado clinico specifiche per i patogeni utilizzando un dispositivo di arricchimento cellulare di seconda generazione automatizzato da banco che incorpora un sistema chiuso di cattura delle citochine e non richiede personale dedicato o l'uso di una struttura GMP. Le cellule T specifiche per il citomegalovirus pp65 generate possono essere somministrate direttamente ai pazienti.

Arricchimento cellulare automatizzata di Citomegalovirus specifici linfociti T per le applicazioni cliniche che utilizzano il sistema di citochine cattura

A lungo termine colta interferone-γ enzimatico test immunospot viene usato come misura di risposte di memoria centrale e correla con le risposte vaccino anti-micobatteri protettivi. Con questo test, le cellule mononucleari del sangue periferico sono stimolati con antigeni micobatterici e interleuchina-2 per 14 giorni, differenziazione e consentendo l'espansione delle cellule T di memoria centrale.

Applicazione di lungo termine colta interferone-γ Enzyme Linked immunospot Assay per la valutazione effettori e memoria delle cellule T risposte a Bovino

Un protocollo per valutare le risposte delle cellule T antigene-specifiche negli organi nuova di Ifnar1- / - modello murino per l'infezione del virus (ZIKV) di Zika è descritto. Questo metodo è fondamentale per indagare i meccanismi cellulari della protezione e immunopatogenesi di vaccini ZIKV ed è inoltre utile per la loro valutazione di efficacia.

Valutazione delle risposte a cellula T Zika Virus-specifici in organi di nuova di Ifnar1 infetti- / - Mice

Lo sviluppo del test ELISpot interferone per la cavia PBMCs permette la caratterizzazione delle risposte delle cellule T in questo modello altamente rilevante per lo studio delle malattie infettive. Abbiamo applicato il test per misurare le risposte delle cellule T associate intradermica consegna di vaccini a DNA.

Ottimizzazione del interferone-gamma ELISpot analisi di risposte a cellula T misura nel modello cavia dopo la vaccinazione

Il presente protocollo combina la stimolazione ex vivo e la citometria a flusso per analizzare i profili delle cellule T polifunzionali (T PF) nelle cellule mononucleate del sangue periferico (PBMC) all'interno di bambini vaccinati con virus dell'encefalite giapponese (JEV). Il metodo di rilevazione e lo schema di colori della citometria a flusso dei TPF specifici di JEV sono stati testati per fornire un riferimento per studi simili.

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Saggio su sangue intero con doppia co-stimolazione per l'analisi antigene-specifica dell'immunità dell'ospite a patogeni fungini e virali

Questo protocollo dimostra l'iniezione temporale nelle vene per la somministrazione endovenosa di cellule tumorali pediatriche ai topi neonatali, consentendo una modellazione precisa e riproducibile delle risposte immunitarie precoce contro il cancro. Il metodo consente di valutare l'impatto degli interventi, come l'immunomodulazione o la terapia, quando applicati durante il periodo neonatale.

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Scopri il test IFN-γ ELISpot per valutare la risposta immunitaria cellulo-mediata contro il virus varicella-zoster. Questo metodo rileva la produzione di citochine a livello di singola cellula con attrezzatura di base.

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