Un metodo Chiarimento Nuovo per visualizzare biliare degenerazione Durante fegato Metamorfosi in mare Lamprey ( Petromyzon marinus)

L'obiettivo generale di questa procedura è chiarificare l'intero fegato e la giunzione con l'intestino per analisi globali, strutturali e cellulari della degenerazione biliare in C lamprey in metamorfosi. Questo viene ottenuto fissando innanzitutto i tessuti in una soluzione monomerica di idrogel.

Successivamente, l'idrogel viene polimerizzato con i tessuti fissati. Quindi, la membrana plasmatica del tessuto fissato viene rimossa e il tessuto diventa trasparente. Infine, viene eseguita una colorazione immunofluorescente e, in ultima analisi, viene utilizzata la microscopia a scansione laser confocale per mostrare i cambiamenti strutturali e cellulari globali durante la degenerazione biliare nella lampreda metamorfica c Lampry.

Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nel campo biomedico, come ad esempio i connettomi nel sistema nervoso centrale e, nel nostro caso, la degenerazione biliare durante la metamorfosi allo stadio di punto sierologico. Le implicazioni di questa tecnica si estendono alla terapia o alla diagnosi dell'atresia biliare umana, poiché questa rara malattia congenita nei neonati condivide caratteristiche simili con la degenerazione dell'ary durante la metamorfosi allo stadio di punto sierologico. Abbiamo avuto per la prima volta l'idea di questo metodo quando abbiamo trovato un articolo su Nature e abbiamo presentato il video online durante la riunione del laboratorio, che illustrerà la procedura; la dimostrazione sarà effettuata da Ann Scott, una studentessa laureata del nostro laboratorio, dopo aver preparato la soluzione salina tamponata al fosfato e il tampone fosfato, o pb, secondo il protocollo descritto nel testo.

In una cappa, preparare 400 millilitri di idrogel mescolando acqua distillata, acrilamide al 40%, bis-acrilamide al 2%, PBS 10X, paraformaldeide al 16%, saponina e persolfato di ammonio. Preparare un litro di soluzione di chiarificazione composta da SDS al 4% e acido borico 0,2 molare, e preparare 500 millilitri di glicerolo all'80% nella cappa. Aliquotare 10 millilitri di soluzione monomerica di idrogel in provette centrifuga da 15 millilitri.

Dissezionare il campione di tessuto e posizionare il tessuto in ogni provetta contenente fissativo idrogel a quattro gradi Celsius per due giorni. Dopo l'incubazione sotto cappa, polimerizzare il tessuto fissato aggiungendo cinque microlitri di temid. Quindi mescolare accuratamente e lasciare incubare i campioni a temperatura ambiente per due o tre ore.

Dopo l'incubazione, rimuovere accuratamente il gel in eccesso per chiarificare i campioni di tessuto. Posizionare ciascun campione in 15 millilitri di soluzione chiarente e incubare a 50 gradi Celsius e 70 giri al minuto per diversi giorni, fino a quando non diventano trasparenti. Cambiare la soluzione chiarente almeno una volta al giorno e rimuovere qualsiasi gel in eccesso.

Trasferire i campioni in 15 millilitri di PB 0,1 M con 0,1% di Triton X-100 a 37 gradi Celsius e 70 giri al minuto per tutta la notte. Ripetere l'incubazione altre due volte con tampone fresco. Ora che il tessuto è stato chiarificato e privato di qualsiasi gel in eccesso, immergere i campioni nell'anticorpo primario in PB con Triton X-100 e incubare a 37 gradi Celsius e 70 giri al minuto per due giorni. Dopo l'incubazione, utilizzare 15 millilitri di PB con 0,1% di Triton X-100 per lavare i campioni di tessuto a 37 gradi Celsius e 70 giri al minuto per tutta la notte.

Ripetere il lavaggio per tre volte; dopo aver rimosso l'ultimo tampone di lavaggio, aggiungere la soluzione di anticorpo secondario fluorescente in PB con 0,1% Trix 100 e siero bloccante e incubare al buio a 37 gradi Celsius e 70 giri al minuto per un giorno. Dopo aver lavato i campioni tre volte in 10 millilitri di PB con Tritton X 100 a 37 gradi Celsius e 70 giri al minuto durante la notte, eseguire tre lavaggi notturni in PBS. Infine, incubare il tessuto chiarificato in glicerolo al 80% coperto con stagnola durante la notte.

L'acquisizione di immagini mediante microscopia confocale viene quindi eseguita al buio o in luce fioca, anche se in questo video le luci sono accese per fini di visualizzazione. Diversi eventi di sviluppo importanti si verificano nel sistema biliare epatico durante la metamorfosi della lampreda, ad esempio, come mostrato qui, il dotto biliare e la cistifellea subiscono apoptosi e degenerano. Dopo aver utilizzato il metodo di chiarificazione modificato e aver effettuato la colorazione con il marcatore delle cellule epatiche citocheratina 19 e con il marcatore antiapoptotico BCL2, è stata impiegata la microscopia confocale a scansione laser per eseguire sezioni ottiche attraverso il fegato integro.

La colorazione ha rivelato che il processo degenerativo si verifica negli stadi metamorfici dal due al quattro. I pannelli superiori provengono dall'estremità anteriore e quelli inferiori dall'estremità posteriore. Qui viene mostrato l'albero biliare e qui si osservano cellule apoptotiche scure dall'aspetto dendritico e i canalicoli circostanti e i dotti epatici nel fegato.

Questa figura rappresenta immagini tridimensionali ricostruite a partire da serie Z confocali di tre fegati, prelevati in stadi metamorfici compresi tra il secondo e il terzo, marcati con anticorpi diretti contro la citocheratina 19 e BCL2; l'albero biliare e le cellule apoptotiche scure dall'aspetto dendritico, insieme ai canalicoli circostanti e ai dotti biliari, sono indicati rispettivamente da frecce bianche e nere. Qui è mostrata una sezione ottica confocale dei dotti biliari di un campione in stadi metamorfici compresi tra il secondo e il terzo, con goccioline biliari nel lume. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come chiarificare l'intero tessuto per ulteriori analisi di imaging.

Non dimenticare che lavorare con paraform, aldeidi e soluzioni di poliacrilamide può essere estremamente pericoloso, e precauzioni come indossare guanti e utilizzare la cappa chimica devono sempre essere adottate durante l'esecuzione di questa procedura.