Un metodo Chiarimento Nuovo per visualizzare biliare degenerazione Durante fegato Metamorfosi in mare Lamprey ( Petromyzon marinus)

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di chiarire l'intero fegato e la giunzione con l'intestino per analisi globali, strutturali e cellulari della degenerazione biliare. Nella lampreda C metamorfica. Ciò si ottiene fissando prima i tessuti nella soluzione di idrogel monomero.

Successivamente, l'idrogel viene polimerizzato con i tessuti fissati. Quindi la membrana plasmatica del tessuto fissato viene rimossa e il tessuto diventa trasparente. Infine, viene eseguita la colorazione con immunofluorescenza laser della pelle e la microscopia confocale viene utilizzata per mostrare i cambiamenti strutturali e cellulari globali durante la degenerazione biliare in Lampry metamorfica.

Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave in campo biomedico, come i connettomi nel sistema nervoso centrale e, nel nostro caso, la degenerazione biliare durante la metamorfosi del punto sierico. Le implicazioni di questa tecnica si estendono alla terapia o alla diagnosi delle vie biliari umane o dell'atresia perché questa rara malattia congenita infantile condivide caratteristiche simili con la degenerazione ariosa durante la metamorfosi del punto sierico. Abbiamo avuto l'idea di questo metodo per la prima volta quando abbiamo trovato un articolo su Nature e presentato il video online durante il nostro incontro di laboratorio dimostrando che la procedura sarà Ann Scott, una studentessa laureata del nostro laboratorio Dopo aver realizzato soluzione salina tamponata con fosfato e tampone fosfato o pb, secondo il protocollo di testo.

In una cappa aspirante, preparare 400 millilitri di idrogel combinando acqua distillata, 40% acrilammide 2% bis acrilammide 10 XPBS, 16% paraforma, aldeide, saponina e ammonio per solfato. Preparare un litro di soluzione di chiarificazione composta da SDS al 4% e acido borico molare allo 0,2% e preparare 500 millilitri di glicerolo all'80% per preparare il tessuto nella cappa aspirante. Eloqua 10 millilitri di soluzione di idrogel monomero in provette da centrifuga da 15 millilitri.

Sezionare il campione di tessuto e posizionare il tessuto in ciascuna provetta di idrogel a quattro gradi Celsius per due giorni. Dopo l'incubazione sotto cappa aspirante, polimerizzare il tessuto fissato aggiungendo cinque microlitri di temid. Quindi mescolare bene e lasciare che i campioni incubino a temperatura ambiente per due o tre ore.

Dopo l'incubazione, rimuovere accuratamente il gel in eccesso per eliminare i campioni di tessuto. Mettere ciascuno in 15 millilitri di soluzione chiarificante e incubare a 50 gradi Celsius e 70 RPM per diversi giorni fino a quando non diventano trasparenti. Cambiare la soluzione schiarente almeno una volta al giorno e rimuovere il gel in eccesso.

Trasferire i campioni in 15 millilitri di PB molare 0,1% con Triton X 100 allo 0,1% a 37 gradi Celsius e 70 RPM durante la notte. Ripetere l'incubazione altre due volte con un tampone fresco. Ora che il tessuto è pulito e privo di gel in eccesso, immergere i campioni nell'anticorpo primario in PB tritton X 100 e incubare a 37 gradi Celsius e 70 RPM per due giorni dopo l'incubazione, utilizzare 15 millilitri di PB con 0,1% di tritton X 100 per lavare i campioni di tessuto a 37 gradi Celsius e 70 RPM durante la notte.

Ripetere il lavaggio tre volte dopo aver rimosso il tampone di lavaggio finale, aggiungere una soluzione di anticorpi secondari fluorescenti in PB con 0,1% Trix 100 e siero bloccante e incubare al buio a 37 gradi Celsius e 70 RPM per un giorno. Dopo aver lavato i campioni tre volte in 10 millilitri di PB tritton X 100 a 37 gradi Celsius e 70 RPM durante la notte, eseguire tre lavaggi notturni in PBS. Infine, incubare il tessuto chiarificato in glicerolo all'80% coperto con un foglio per una notte.

L'imaging al microscopio confocale viene quindi eseguito in condizioni di oscurità o scarsa illuminazione, anche se le luci sono accese in questo video a scopo di visualizzazione. Diversi importanti eventi di sviluppo si verificano nel sistema biliare HEPA durante la metamorfosi della c. lampre, ad esempio, come mostrato qui, il dotto biliare e la cistifellea subiscono apoptosi e degenerano. Dopo aver utilizzato il metodo di chiarificazione modificato e la colorazione con il marcatore delle cellule epatiche citocheratina 19 anti anti apoptotico, è stata utilizzata la microscopia confocale a scansione laser BCL two per eseguire il sezionamento ottico attraverso il fegato intatto.

La colorazione ha rivelato che il processo degenerativo avviene negli stadi metamorfici da due a quattro. I pannelli superiori provengono dalla parte anteriore e i pannelli inferiori dall'estremità posteriore. Qui è mostrato l'albero biliare e qui ci sono cellule apoptotiche dall'aspetto dendritico scuro e canalicoli circostanti e strumenti del dotto nel fegato.

Questa figura rappresenta immagini tridimensionali ricostruite della serie Z confocale di tre fegati tra gli stadi metamorfici due e tre marcati con anticorpi contro la citocheratina 19 e BCL due, l'albero biliare e le cellule apoptotiche dall'aspetto dendritico scuro e i canalicoli circostanti e gli strumenti del dotto sono contrassegnati rispettivamente da frecce bianche e nere. Qui è mostrata una sezione ottica confocale dei dotti biliari di un campione tra gli stadi metamorfici due e tre con goccioline biliari nel lume. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come chiarire l'intero tessuto per ulteriori analisi di imaging.

Non dimenticare che lavorare con soluzioni di paraforma, aldeide e poliacrilammide può essere estremamente pericoloso e che durante l'esecuzione di questa procedura è necessario prendere sempre precauzioni come indossare guanti e utilizzare la cappa aspirante.