Chemioterapia-indotta vascolare Tossicità - in tempo reale In vivo Imaging di Vessel Impairment
7 gennaio 2015
Descriviamo qui il metodo di imaging basato sulla microscopia fluorescente confocale a fibre (FCFM), che fornisce una modalità innovativa per comprendere i fenomeni fisiologici a livello cellulare e subcellulare in soggetti animali.
L'obiettivo generale di questa procedura è quello di utilizzare un microscopio confocale a fibre ad alta definizione per visualizzare il sistema vascolare e la sua risposta a vari stimoli. Ciò si ottiene calibrando prima il microscopio e poi iniettando l'animale per via endovenosa con destrina fitzy per facilitare la visualizzazione dei vasi sanguigni, i vasi vengono quindi ripresi con il microscopio a fluorescenza confocale fibroma in tempo reale, durante e dopo il trattamento sperimentale. In definitiva, questa piattaforma di imaging molecolare in vivo può essere utilizzata per valutare la potenziale tossicità vascolare di agenti come i chemioterapici in un modello animale.
In generale, le persone che non conoscono questo metodo possono avere difficoltà perché la configurazione di un sistema e l'acquisizione di un'immagine stabile possono essere impegnative. A dimostrare la procedura sarà il Dr.Sef, un postdoc del laboratorio. Prima di preparare il mouse per l'imaging, accendere il microscopio a fluorescenza confocale in fibra e collegare la micro sonda mini zero 30.
Calibrare il dispositivo secondo le istruzioni del produttore. Quando il microscopio è pronto, posizionare il mouse in posizione supina su un tavolino di polistirolo, quindi fissare il mouse al tappetino con del nastro chirurgico. Quindi incidere la pelle sotto l'inguine di un topo ICR femmina di sette-otto settimane per rivelare i vasi arteriosi femorali, mantenendo il sito dell'incisione umido con soluzione fisiologica.
Utilizzare una lampada rossa per riscaldare la coda per circa 10 secondi quando le vene della coda si sono dilatate, inserire un ago da 27 gauge e mezzo pollice attaccato a una siringa da un millilitro riempita di soluzione salina in una delle vene. Iniettare soluzione fisiologica per assicurarsi che la vena sia aperta. Quindi sostituire con cura la siringa di soluzione fisiologica con una siringa contenente 10 milligrammi per millilitro, Fitz Dextrin.
Quindi, iniettare 100 microlitri di Fitz Dextrin nella vena caudale e collegare una siringa contenente otto milligrammi per chilogrammo di doxorubicina all'ago. Quindi spostare la micro sonda mini zero 30 su un campo visivo adatto dopo la regolazione sull'asse Z. Fissare la sonda sul sito dell'incisione.
Le parti più difficili della procedura sono trovare un campo visivo adeguato e mantenere la sonda in posizione per garantire che sia l'animale che la sonda non si muovano durante l'iniezione o si allentino a causa della respirazione dell'animale. Fissiamo la sonda con molto nastro adesivo. Ora attendi che il segnale iniziale svanisca fino a quando non è visibile un segnale chiaro e focalizzato.
Quindi, dopo aver registrato il flusso sanguigno basale per un breve periodo di stabilizzazione, circa il 32°, somministrare 100 microlitri di trattamento attraverso lo shunt della vena caudale. Monitorare il flusso della destrina iniettata continuamente per 10 minuti con l'unità di scansione laser impostata sulla lunghezza d'onda di 488 nanometri. Infine, nel software associato al microscopio a fluorescenza confocale per fibromi, utilizzare il pulsante del diametro sul righello superiore per misurare i vasi sanguigni.
La doxorubicina induce una rapida vasocostrizione di piccoli vasi di diametro inferiore a 15 micrometri entro due-cinque minuti dal trattamento con una completa scomparsa della fluorescenza della Dextrin Fitz entro otto minuti. In questo esperimento rappresentativo, alcuni animali hanno mostrato una riduzione del segnale fluorescente nel vaso sanguigno e un aumento del segnale nell'area circostante i vasi all'interno della regione perivascolare. Pochi secondi dopo la somministrazione di doxorubicina in questi topi, la somministrazione della destrina ad alto peso molecolare ha indotto un aumento della permeabilità dei vasi, con conseguente perdita del segnale dal vaso sanguigno nel tessuto circostante.
Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere completata in pochi minuti se eseguita correttamente.
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Panoramica
Questo articolo descrive il metodo della microscopia confocale fluorescente in fibra (FCFM) per l'imaging dei fenomeni fisiologici a livello cellulare e subcellulare in soggetti animali. La tecnica permette la visualizzazione in tempo reale della vascolarizzazione e delle sue risposte a vari stimoli.
Componenti chiave dello studio
Area della scienza
- Neuroscienze
- Biologia cellulare
- Tecniche di imaging
Sfondo
- La microscopia confocale in fibra fornisce capacità di imaging ad alta definizione.
- È particolarmente utile per studiare le risposte vascolari in modelli animali vivi.
- Esistono sfide nella configurazione del sistema e nella cattura di immagini stabili.
- Il fitzy dextrin viene utilizzato per migliorare la visualizzazione dei vasi sanguigni.
Obiettivo dello studio
- Visualizzare la vascolarizzazione e la sua risposta agli stimoli in tempo reale.
- Valutare la potenziale tossicità vascolare di agenti come i chemioterapici.
- Dimostrare la tecnica FCFM per i ricercatori nuovi al metodo.
Metodi utilizzati
- Calibrazione del microscopio confocale in fibra.
- Iniezione endovenosa di fitzy dextrin nell'animale.
- Imaging in tempo reale dei vasi sanguigni durante e dopo il trattamento.
- Dimostrazione della procedura da parte di un postdoc addestrato.
Risultati principali
- Viabilizzazione di successo della vascolarizzazione in soggetti vivi.
- L'imaging in tempo reale permette la valutazione delle risposte vascolari.
- Possibili applicazioni nella valutazione della tossicità vascolare dei farmaci.
- Identificazione delle sfide affrontate dai nuovi utenti della tecnica.
Conclusioni
- FCFM è uno strumento prezioso per l'imaging molecolare in vivo.
- Migliora la comprensione delle risposte fisiologiche a livello cellulare.
- Si raccomanda ulteriore formazione e pratica per un uso efficace.
Domande frequenti
Executive Industry Relevance
Real-time in vivo imaging of vascular responses enables early detection of chemotherapy-induced vascular toxicity, a critical factor in preclinical safety assessment. This approach supports mechanistic de-risking by distinguishing vascular from cardiotoxic mechanisms, informing go/no-go decisions in oncology pipeline prioritization. The platform provides quantitative, reproducible vascular metrics that enhance predictive confidence in lead identification stages.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of vascular toxicity mechanisms independent of direct myocyte injury, clarifying target-related vascular liabilities.
- Operational Value: Provides real-time, quantitative readouts of vessel impairment for hypothesis testing in discovery biology.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates standardized, high-resolution vascular imaging data suitable for assay development and compound screening.
- Operational Value: Supports reproducible visualization of blood vessel dynamics across test conditions, enabling reliable compound evaluation.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Bridges discovery findings to preclinical validation by modeling acute vascular events that may precede end-organ injury.
- Operational Value: Facilitates longitudinal, within-subject vascular monitoring using each animal as its own control, reducing variability.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery continuum from early target validation through lead identification to preclinical safety assessment, providing real-time vascular response data at each stage.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of vascular toxicity mechanisms and pathway clarification in vivo.
- Screening: Enables assay-ready visualization of vascular responses with quantitative diameter and permeability measurements.
- Analytics: Delivers real-time, sub-cellular vascular metrics including vasoconstriction onset and leakage quantification.
- Translational Research: Connects acute vascular imaging findings to preclinical models of vascular morbidity and cardiovascular risk.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable imaging platform for vascular toxicity profiling across multiple therapeutic modalities.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Mechanistic de-risking of vascular toxicity through direct visualization of vessel impairment dynamics.
- Operational Value: Standardized, reproducible imaging workflow with internal controls and real-time monitoring.
- Strategic Value: Informs early go/no-go decisions by identifying vascular liabilities before significant investment.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of candidates based on vascular safety profiles.
Implementation Considerations
- Expertise in intravital microscopy and surgical vessel exposure is required for reliable data acquisition.
- Instrumentation includes fibered confocal fluorescence microscope, microprobe, and laser scanning unit with 488 nm wavelength capability.
- Cross-team standardization depends on consistent probe stabilization, injection techniques, and image analysis protocols.
- Adaptation considerations include vessel size thresholds (<15 μm) and timing of measurements relative to compound administration.
- Practical limitations include challenges in maintaining probe stability during animal respiration and injection procedures.
