Misurare il osmotica dell'acqua Permeabilità Coefficiente (P _F) Di celle sferiche: protoplasti impianto isolato come un esempio

L'obiettivo generale del seguente esperimento è quello di conoscere la funzione delle acquaporine determinando il coefficiente di permeabilità all'acqua osmotica, o PF, dei protoplasti vegetali. Ritaglia un pezzo da una foglia senza epidermide assiale e mettilo su una soluzione isotonica. Trasferire i pezzi in una soluzione enzimatica e incubare per 20 minuti a 28 gradi Celsius, quindi in una soluzione isotonica fresca.

Quindi, raccogliere i protoplasti contenenti la soluzione con una punta tagliata. Come secondo passo, preparare una camera sperimentale. Fissare un vetrino coprioggetti alla parte inferiore del vetrino utilizzando grasso al silicone.

Quindi rivestire il fondo della camera con una colla a carica positiva e riempire la camera con una soluzione isotonica. I protoplasti isolati vengono quindi aggiunti alla camera e la camera viene posizionata delicatamente sul tavolino del microscopio. Successivamente, i protoplasti vengono esposti a una soluzione ipotonica mentre vengono registrati video per catturare il loro andamento temporale di rigonfiamento.

Successivamente, l'andamento del tempo di rigonfiamento viene analizzato numericamente da un software che include procedure di curfitting al fine di determinare il PF di ciascun protoplasto in base ai risultati dell'analisi numerica ottenuti che mostrano differenze nel PF indotte, ad esempio, dall'espressione di diversi geni dell'acquaporina. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della fisiologia della membrana cellulare, come la regolazione della funzione dell'acquaporina. Sebbene questo metodo possa fornire informazioni sull'acqua matica, la permeabilità delle piante acquatiche sono autoctone o geneticamente modificate.

Può essere applicato anche ad altri sistemi come l'origine di interesse esposta all'ide. Prima di iniziare questa procedura, preparare le soluzioni isotoniche e ipertoniche necessarie e verificarne l'osmolarità. Utilizzando un oter OSM, l'osmolarità di ciascuna soluzione deve essere entro il 3% del valore target.

Riempi una capsula di Petri da 10 centimetri con circa sei gocce di soluzione isotonica. Sbucciare il sigillo ABBA o abbassare l'epidermide di una foglia di opsys di coniglio e tagliare la foglia sbucciata in quadrati di circa quattro per quattro millimetri. Posizionare i piccoli pezzi sulle gocce della soluzione isotonica con il lato assiale esposto rivolto verso il basso e toccando la soluzione.

Successivamente, sciogliere 5,7 milligrammi della miscela enzimatica in 165 microlitri di soluzione isotonica in una provetta da 1,5 millilitri e mescolare delicatamente pipettando per circa un minuto fino a quando non si sarà sciolta. Metti diverse gocce simili della soluzione enzimatica nella stessa capsula di Petri. Trasferire i pezzi di foglia sulla soluzione enzimatica. Gocce.

Chiudere il piatto e sigillare il coperchio con un giro di perfil. Far galleggiare il piatto a bagnomaria a 28 gradi Celsius per 20 minuti. Dopo 20 minuti, aggiungere diverse altre gocce della soluzione isotonica al piatto usando una pinza.

Solleva ogni pezzo di foglia per il bordo per trasferirlo in una nuova soluzione isotonica Drop e poi in sequenza a una seconda goccia. Agitare il pezzo di foglia nella seconda goccia per rilasciare i protoplasti utilizzando un puntale di pipetta da 100 microlitri tagliato. Raccogliere le gocce con i protoplasti in un tubo da 1,5 millilitri.

Preparare il sistema di profusione riempiendo una colonna con la soluzione isotonica e un'altra colonna con la soluzione ipotonica. Aprire la valvola per far fluire un po' di soluzione ipotonica per riempire il tubo fino al collettore di ingresso. Dopo essersi assicurati che non vi siano bolle d'aria intrappolate, chiudere la valvola.

Ripetere per la soluzione isotonica. Sigillare un vetrino coprioggetto utilizzando grasso siliconico per creare un fondo per la camera all'interno del vetrino in plexiglass per rendere il fondo della camera appiccicoso per i protoplasti, rivestirlo con solfato di protamina a carica positiva o poli L lisina. Utilizzare la punta di una pipetta per stendere questa colla sul vetrino coprioggetti.

Attendi uno o due minuti. Sciacquare tre o quattro volte con la soluzione isotonica e agitare via la soluzione rimanente. Riempire la camera con la soluzione isotonica.

Quindi utilizzare un puntale della pipetta tagliato per aggiungere una goccia di protoplasti contenenti soluzione alla camera. E attendi tre o quattro minuti affinché i protoplasti si depositino. Coprire la camera con un coperchio trasparente che tocchi la superficie della soluzione.

Evitare di intrappolare le bolle d'aria sottostanti. Posizionare delicatamente un vetrino su un tavolo da microscopio rovesciato e collegarlo collegato al sistema di perfusione e alla pompa che protegge dalle bolle d'aria nel tubo. Attivare il flusso della soluzione isotonica per una perfusione costante a un millilitro al minuto.

Per registrare le variazioni di volume, scegliere un campo di visualizzazione con il maggior numero possibile di celle di forma sferica e con un contorno di cella ben focalizzato sul perimetro più grande. Registra un 62° video di protoplasti immobili selezionati a una velocità di un'immagine al secondo o un hertz. Avviare la registrazione con un lavaggio di 15 secondi della soluzione isotonica e passare alla soluzione ipertonica per 45 secondi.

Salva il filmato in formato Tiff all'indirizzo Per analizzare una serie di immagini di una cellula rigonfia, utilizzare Image Explorer e i plug-in per l'analizzatore di protoplasti nel software Image J. Avvia l'immagine J.To apri il filmato, fai clic su File nel pannello Immagine J, quindi consecutivamente sui menu a discesa man mano che si aprono l'importazione. Quindi Esplora immagini.

Evidenzia il filmato scelto. Fare clic destro su di esso, quindi a sinistra. Fare clic su analizzatore di protoplasti.

Nella prima immagine, usa il mouse per disegnare cerchi attorno ai protoplasti selezionati. Quindi fare clic su OK. Nella tabella dei parametri di rilevamento che appare per avviare l'algoritmo di rilevamento dei protoplasti, fare clic su locale nel pannello superiore dell'immagine dei protoplasti.

Quindi elaborare. Nel menu a discesa, esamina i cerchi verdi attorno ai protoplasti selezionati durante il film. Utilizzando il cursore inferiore, salva i risultati in un file Excel.

L'analisi viene eseguita fotogramma per fotogramma. Pertanto, nel caso di più di una cella, è necessario l'ordinamento per separare le righe appartenenti a ciascuna cella Qui. I tre corsi temporali sono mostrati in un foglio Excel prima e dopo l'ordinamento con i valori dell'area convertiti da pixel a micrometri quadrati.

Ogni volta il corso viene poi esportato in un file di testo separato. Per iniziare questa procedura, collegare la camera al sistema di perfusione e alla pompa e accendere l'indicatore di flusso dello stampo per una velocità di perfusione costante di un millilitro al minuto, registrare un 62° video alla velocità di un hertz. Avviare la registrazione con 15 secondi di matrice dell'indicatore e poi passare alla soluzione ipertonica Per 45 secondi, interrompere la registrazione.

A filo con l'indicatore. Muori di nuovo per almeno 30 secondi. Prima di iniziare un nuovo filmato, registrare e salvare cinque o sei filmati per analizzare i filmati.

Per ottenere un andamento temporale medio della trasmittanza dello stampo dell'indicatore di modifica, avviare l'immagine J fare clic sul file. Quindi apri e cerca il film. Per ogni filmato, disegna un rettangolo verticale largo 10 pixel in qualsiasi punto della prima immagine del filmato, fai clic sull'immagine nel pannello principale Immagine J.

Quindi fare clic su ritaglia nel menu a discesa. Per allineare i 60 fotogrammi in una riga, fare clic sull'immagine e quindi fare clic consecutivamente nei menu a discesa mentre aprono le pile e creano il montaggio. Disegna un rettangolo orizzontale alto un pixel in qualsiasi punto dell'intera riga di immagini e fai clic su Analizza nel pannello principale Immagine J.

Quindi, fare clic su Profilo di stampa. Nel menu a discesa, copia gli elenchi dei dati di trasmittanza in un file Excel. Fare la media dei corsi temporali di trasmittanza ottenuti dai filmati sierologici dei getti degli stampi.

Genera una base in tempo reale moltiplicando il numero sequenziale dell'immagine per 0,1. Salvare l'andamento temporale medio in un file di testo per calcolare i vari parametri dell'andamento temporale dell'osmolarità. Utilizza il programma di fitting MATLAB PF fit, disponibile per l'uso.

Gratuito. I dettagli sul download e l'utilizzo di questo programma sono disponibili nel testo del protocollo. Nel pannello di adattamento dell'indicatore.

Importa i dati dell'andamento temporale medio della trasmittanza del colorante dell'indicatore. Inserire manualmente i parametri dell'esperimento corrente, le ipotesi iniziali dei parametri con la formica H.Descrivendo l'andamento temporale della concentrazione di colorante indicatore possono anche essere modificate. Fare clic su run per visualizzare il grafico dell'andamento temporale dell'indicatore di concentrazione DAI e dell'osmolarità del bagno modellata.

Un buon adattamento ai dati è essenziale per determinare il coefficiente di permeabilità all'acqua. Passa al pannello di adattamento del volume. Scegli per importare il file di dati dell'area.

Scegliere l'ultimo raccordo dell'indicatore come sorgente del parametro. Scegliere la classe del modello. Inizia con due.

I parametri PF pf lento PF e ritardo devono essere inizializzati, ad esempio, come mostrato, ma sono possibili anche altri valori. Mark verifica che tutti e tre i parametri siano adattati. Fare clic su Esegui.

Quindi osserva la cifra intermedia e regola il parametro di ritardo e la lunghezza della registrazione, se necessario. Esamina il grafico dei risultati per valutare l'adattamento, la qualità e registrare l'errore di adattamento. Modificare i parametri di inizializzazione di alcune pieghe ciascuno ed eseguire nuovamente.

Ripetere questa procedura più volte, iniziando con diverse combinazioni di parametri di inizializzazione, mirando al valore più basso dell'errore di adattamento al fine di determinare il coefficiente di permeabilità all'acqua o pf e confrontare l'attività di diverse acquaporine I protoplasti di Mesil da una foglia di opsys di coniglio sono stati isolati e trasformati separatamente con tre costrutti genici con geni dell'acquaporina da un coniglio, Opsia e labirinto. I protoplasti sono stati marcati mediante co-ran con un vettore che codifica una proteina fluorescente verde potenziata. Per ciascuna cellula sono stati ottenuti l'andamento temporale delle variazioni di volume cellulare in seguito all'esposizione alla provocazione ipotonica, nonché l'andamento temporale della variazione di osmolarità del bagno durante la provocazione ipotonica, i valori di PF sono stati derivati per ciascuna cellula.

Utilizzando il programma PF FIT, è stato osservato che i valori di PF dei PROTOPLAST trasformati con ciascuna delle tre acquaporine erano significativamente più alti del PF della cellula di controllo trasformata con la sola GFP. Una volta padroneggiata, questa tecnica può fornire l'analisi di alcune decine di cellule in pochi giorni sperimentali se eseguita correttamente. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come determinare la permeabilità all'acqua SMO in protoplasti isolati o altre cellule focali sottoposte a un saggio ipotonico.

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