La valutazione non invasiva della Cardiac Anomalie in Experimental Autoimmune miocardite da Risonanza Magnetica Imaging Microscopy nel mouse

L'obiettivo generale di questa procedura è accertare anomalie funzionali cardiache mediante l'immagine dei cuori in animali vivi affetti da malattia cardiaca infiammatoria. Questo viene ottenuto innanzitutto inducendo la malattia, ad esempio la miocardite. Il secondo passaggio consiste nel preparare l'animale per l'immagine mediante microscopia a risonanza magnetica e posizionarlo nel supporto per animali.

Successivamente, il topo viene posizionato all'interno del magnete per acquisire le immagini cardiache. L'ultimo passaggio consiste nell'analizzare i parametri funzionali cardiaci utilizzando il software Segment. In definitiva, questa tecnica viene utilizzata per calcolare il volume telediastolico e la frazione di eiezione in topi affetti da miocardite autoimmune.

Il principale vantaggio di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti, come l'istopatologia, è che è non invasiva e fornisce una visione tridimensionale ad alta risoluzione del cuore. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nel campo della cardiologia relative alla diagnosi delle malattie cardiache infiammatorie. In generale, le persone nuove rispetto a questo metodo potranno incontrare difficoltà a causa della scarsa familiarità con il preparativo degli animali per l'acquisizione di immagini mediante risonanza magnetica microscopica.

Pertanto, la dimostrazione visiva di questo metodo è fondamentale. Iniziare il protocollo preparando innanzitutto una soluzione peptidica per indurre miocardite autoimmune, sciogliendo il peptide della catena pesante alfa della miosina cardiaca 334-352 in soluzione salina tamponata al fosfato fino a una concentrazione finale di due milligrammi per 1,5 millilitri. Successivamente, preparare la tossina della pertosse aggiungendo un millilitro di soluzione salina tamponata al fosfato sterile 1x a un flaconcino contenente 50 microgrammi di tossina della pertosse liofilizzata.

Per ottenere una concentrazione stock di 50 nanogrammi per microlitro. Prelevare quindi 20 microlitri della soluzione stock in un tubo sterile da 1,5 millilitro e aggiungere 980 microlitri di soluzione salina fosfato sterile 1x per ottenere una concentrazione di lavoro di 1 nanogrammo per microlitro. Preparare inoltre l'adjuvante completo di Freund o CFA aggiungendo 40 milligrammi di estratto di Mycobacterium tuberculosis H37RV o MTB a 10 millilitri di CFA per ottenere una concentrazione finale di 5 milligrammi per millilitro.

Ora preparare l'emulsione di CFA per ottenere un'aliquote di 1,5 millilitri di emulsione: aggiungere 750 microlitri di soluzione del peptide della catena pesante alfa della miocina cardiaca, peptide 3 34 a 3 52, in un tubo da 1,5 millilitri e prelevare un volume uguale di CFA integrato con estratto MTB in un altro tubo da 1,5 millilitri. Successivamente, utilizzando una siringa da tre millilitri con blocco a baionetta, aspirare prima la soluzione peptidica, seguita dall'estratto C-F-A-M-T-B. Collegare la siringa a un rubinetto a tre vie e connettere l'altra uscita del rubinetto a una siringa vuota da tre millilitri.

Regolare il foro aperto del rubinetto. In modo che la miscela di peptidi CFA fluisca da una siringa all'altra con una resistenza ragionevolmente elevata. Mescolare spingendo ripetutamente il contenuto da una siringa all'altra per circa un minuto, quindi posizionare l'intero apparato sul ghiaccio per circa tre minuti.

Ripetere questa procedura almeno 10 volte. Verificare la consistenza dell'emulsione posizionando con attenzione una piccola goccia su acqua stagnante in un becher di vetro da 100 millilitri. La goccia non dovrebbe disperdersi nell'acqua; in caso contrario, continuare a mescolare fino a raggiungere la consistenza desiderata.

Trasferire il contenuto dell'emulsione da siringhe da tre millilitri in una siringa da un millilitro. Collegare la siringa da un millilitro al rubinetto a tre vie sostituendo una delle due siringhe da tre millilitri precedentemente collegate. Quindi, fissare un ago da 27 e mezzo gauge.

Iniettare 150 microlitri di emulsione peptidica CFA in dosi frazionate per via sottocutanea nelle due regioni inguinali di topi femmine aj. di sei-otto settimane di età. Somministrare quindi 100 microlitri di sospensione di tossina pertussica per via intraperitoneale a ciascun animale al giorno zero e al giorno due dopo l'immunizzazione. Ripetere la procedura di immunizzazione al giorno sette somministrando 150 microlitri di emulsione peptidica CFA in dosi frazionate per via sottocutanea su entrambi i lati dello sterno.

Preparare questa emulsione fresca come descritto. Quindi, al giorno 21, sottoporre gli animali all'immagine MRM per la preparazione all'acquisizione. Posizionare innanzitutto ogni topo in una camera di induzione anestetica contenente una miscela di aria fluorata con 2% di ISO, dotata di un tappetino riscaldante per mantenere il calore.

Quindi trasferire l'animale in un apposito supporto per animali. Fissare la testa con una barretta per il morso per immobilizzare l'animale in posizione prona. Il muso deve essere inserito nel cono nasale per mantenere l'anestesia.

Accendere il riscaldatore ad aria calda con il tubo di uscita inserito nel vano verticale dello scanner per mantenere la temperatura corporea dell'animale durante l'esperimento. Mantenere l'anestesia al 1-2% di isoflurano con una portata di due millilitri al minuto per tutta la durata della sessione di imaging. Verificare il livello di anestesia eseguendo una compressione del dito del piede.

Successivamente, impostare un sensore pneumatico a cuscino e una sonda per la temperatura rettale per monitorare la respirazione e la temperatura corporea durante tutta la sessione di imaging. Un sensore di pulsossimetria a fibra ottica dovrebbe inoltre essere applicato alla caviglia sinistra e il piede deve essere fissato con un laccio a cappio e bloccato con del nastro adesivo per mantenerlo in posizione. L'imaging verrà ottenuto sincronizzando i segnali respiratori e cardiaci, senza l'uso di alcun agente di contrasto.

Per ottenere immagini tridimensionali ad alta risoluzione di microscopia a risonanza magnetica, si dovrebbe utilizzare un magnete verticale a largo foro da 9,4 Tesla. Dopo aver preparato l'animale, posizionare il mouse nello scanner con il cuore al centro del campo visivo. Successivamente, eseguire l'interfaccia di imaging, selezionare il nuovo tipo di studio nel menu della barra dei comandi, aprire la pagina di taratura, quindi selezionare avvio della sonda, taratura e autoscala.

Utilizzare le manopole di accordo remoto poste all'estremità della bobina per accordare la bobina RF alla frequenza di risonanza del protone di 400 megahertz. Successivamente, passare alla pagina di pre-scan. Per eseguire la calibrazione della frequenza e della potenza, premere il pulsante rapido x, Y, Z per aprire la pagina di shim.

Quindi selezionare tutte le iterazioni ed eseguire l'autoshimming. Selezionare una sequenza scout. Modificare il campo visivo a 35 millimetri.

Mantenere le altre impostazioni predefinite ed eseguire la sequenza. Se il cuore non si trova al centro del campo visivo, regolare la posizione del supporto per l'animale, rituningare la bobina RF e riacquisire l'immagine preliminare. Quindi selezionare la sequenza gem.

Immettere i parametri di acquisizione mostrati qui nella scheda "acquire" per ottenere due piani ortogonali lungo l'asse corto e l'asse lungo del cuore. Successivamente, selezionare la sequenza cine per acquisire le immagini cine dell'asse corto con pulsossimetria e misurare i parametri del ventricolo sinistro, nonché quelli anatomici e funzionali. Immettere i parametri mostrati qui per ottenere la sequenza cine a gradiente eco.

Regolare la posizione e l'angolo delle sezioni di imaging in base alla vista dell'asse lungo del cuore. Quindi eseguire la sequenza. Al termine dell'imaging.

Convertire le immagini acquisite in formato DICOM utilizzando la scheda IO e trasferire i file corrispondenti al centro dati per l'elaborazione. Al termine della procedura di imaging, permettere all'animale di riprendersi dall'anestesia all'interno di una gabbia con coperchio filtrante. Non lasciare il topo incustodito fino a quando non abbia riacquistato una coscienza sufficiente da mantenere una posizione sterno-abdominale.

Qui, il software di segmentazione viene utilizzato per analizzare i parametri anatomici e funzionali del ventricolo sinistro. Iniziare caricando nel software le immagini cine in formato DICOM. Quindi selezionare MRGE come tecnica di imaging, cine come tipo di immagine e asse corto a livello midventricolare.

Per il piano di visualizzazione dell'immagine, specificare i timeframe da utilizzare per la fine della diastole e la fine della sistole usando rispettivamente le voci di menu impostare il timeframe corrente alla fine della diastole e impostare il timeframe corrente alla fine della sistole nel menu modifica. Successivamente, utilizzare i pulsanti di comando del VS e poi quelli di endo ed EPI nel pannello in basso a destra. Per disegnare manualmente il ventricolo sinistro, l'endocardio e l'epicardio, rimuovere i muscoli papillari premendo il corrispondente pulsante di comando.

Per aumentare l'accuratezza dei calcoli, leggere i parametri quantificati del ventricolo sinistro, come volume diastolico, volume sistolico, volume d'espulsione e frazione di eiezione, nel pannello in alto a destra. Quindi utilizzare il pulsante di comando mis e successivamente il pulsante di comando del calibro di misurazione per misurare i parametri del ventricolo sinistro, come lo spessore della parete e il diametro ventricolare. Infine, assicurarsi di utilizzare l'opzione salva entrambi i pacchetti di immagini e la segmentazione per salvare le immagini, inclusa la segmentazione in formato dot mat, in modo da poterle rielaborare secondo necessità.

L'angolo secondo cui il cuore è stato sezionato per l'acquisizione dell'immagine in vista a due camere può essere osservato qui. In questo caso, si può notare un aumento approssimativo di 1,5 volte dello spessore del ventricolo sinistro, indicativo di difetti strutturali nei cuori di topi affetti da miocardite autoimmune sperimentale rispetto a topi sani. La gittata cardiaca, misurata in base al volume del ventricolo sinistro e alla frazione di eiezione durante la diastole, era ridotta nei topi affetti da miocardite autoimmune rispetto ai topi sani.

Infine, i cuori dei gruppi trattati sopra descritti sono stati valutati per l'infiammazione mediante valutazione istologica con colorazione ematossilina ed eosina; tale analisi ha evidenziato infiltrati multifocali di linfociti nei cuori di topi con miocardite, ma non in quelli sani. Durante l'esecuzione di questa procedura, è fondamentale garantire che la temperatura corporea dell'animale rimanga costante, in modo che la frequenza cardiaca e quella respiratoria non subiscano variazioni significative durante gli esperimenti. Ciò è essenziale per ottenere risultati riproducibili.

Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione della tecnica microscopica di risonanza magnetica per valutare le anomalie funzionali delle malattie cardiache infiammatorie come la miocardite nei topi. Ma non dimenticare che lavorare con campi magnetici elevati può essere estremamente pericoloso, pertanto il supporto per l'animale e gli altri componenti devono essere non magnetici.