Name: Valutazione del cancro ovarico Spheroid attaccamento e linvasione delle cellule mesoteliali in tempo reale (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-05-20T19:20:00.000+00:00
Duration: 14 min 25 s
Description: Scopri un metodo di analisi in tempo reale per quantificare l'invasione delle cellule del cancro ovarico attraverso il rivestimento mesoteliale. Questa tecnica consente misurazioni continue del processo metastatico nel tempo.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Questo lavoro è stato supportato da una CASS Science Foundation e Medicina di Grant; (MB); un Health &amp; Medical Research Council of Australia Nazionale Progetto Grant (KLS, 338.516); e Operational Support Program infrastrutture del Governo del Victoria (Australia).

1. Preparazione di cellule, dei media e reagenti <ol><li> Preparazione di-metilcellulosa contenente Piano <ol><li> Sciogliere 1.5 g di metilcellulosa in 100 ml di sterile Dulbecco Modified Eagle Medium (DMEM) (senza additivi) in un pallone da 250 ml. </li><li> Riscaldare la soluzione sul basso in un forno a microonde per 5 min; fare attenzione ad evitare bollente. </li><li> Una volta che la polvere metilcellulosa è semi-sciolto, aggiungere un agitatore magnetico pulito e mezzi per prendere il volume a 125 ml. </li><li> Mescolare, invertito, e agitare a temperatura ambiente per 1,5 ore, seguita da agitazione a 4 ° C per una notte. </li><li> Dividere la soluzione altrettanto in quattro provette da 50 ml e centrifugare per 1,5 ore a 2.300 x g. </li><li> Raccogliere il chiaro, surnatante altamente viscoso (circa il 90-95% delle azioni), un&#39;aliquota in sterili provette da 50 ml e conservare a 4 ° C per un massimo di 3 mesi. </li></ol></li><li> Cultura ed etichettatura di cellule <ol><li> Mantenere linee cellulari di carcinoma ovarico in monostrato in un tissue cultura incubatore a 37 ° C, 5% CO 2 in terreni di coltura appropriato (DMEM per le cellule KGN 17 e MCBD110: M199 per le linee cellulari OVCA429 e OVCA433 18) supplementato con 10% di siero fetale bovino (FBS), 2 mM L -glutamina e 1% di penicillina-streptomicina. </li><li> Mantenere le cellule mesoteliali umane LP9 in M199: Hams mezzi F12 contenente 15% FBS, 10 ng / ml Epidermal Growth Factor (EGF) e 400 ng / ml di idrocortisone, in un incubatore a 37 ° C, 5% CO 2. </li><li> Cellule seme nel formato desiderato pallone e crescono a circa il 75% di confluenza. Celle di raccolta di tripsinizzazione con 0,05% tripsina / EDTA, centrifugare a 186 xg per 5 minuti, e lavare pellet di cellule due volte con PBS. </li><li> Contare le cellule utilizzando un emocitometro. </li></ol></li><li> Facoltativo fluorescente metodo di etichettatura cellulare <ol><li> Risospendere le cellule tumorali ad una concentrazione finale di 1 x 10 6 cellule / ml in 1 ml di preriscaldata PBS/0.1% BSA. </li><li> Aggiungere 2 ml di 5 mM magazzino cellule Trsoluzione CSFE asso (o altra etichetta cella preferita che è trattenuta a lungo termine) a cellule ad una concentrazione finale di 10 mM e incubare a 37 ° C per 10-15 min a bagnomaria. </li><li> Estinguere la reazione con 1 ml di ghiaccio mezzo freddo contenente 10% FBS e ri-pellet per centrifugazione. Risospendere in 10 ml di mezzo di crescita preriscaldata adeguato (vedere il punto 1.2.1). </li><li> Cellule seme in un 2 pallone 75 centimetri filtro livellata e cultura a 37 ° C, 5% di CO 2. </li><li> Controllare cellule al microscopio a fluorescenza per verificare che il livello di etichettatura fluorescenza è sufficiente per il rilevamento. Una volta che le cellule raggiungono circa il 75% di confluenza, raccolto e contano come nei passaggi 1.2.3 e 1.2.4 di cui sopra. </li></ol></li></ol> 2. Generazione di Spheroids in metilcellulosa <ol><li> Calcolare il volume delle cellule tumorali ovariche da Sezione 1 necessarie per la generazione sferoide (per un totale di 300.000 cellule sono richiesti per ogni esperimento pieno piastra a 96 pozzetti). Noa te: se si utilizza linee cellulari diverse da quelle qui presentate, le densità di cellule per la produzione di sferoide uniforme possono avere bisogno di essere ottimizzato per ogni linea. </li><li> Per calcolare la diluizione di cellule in mezzi metilcellulosa, innanzitutto sottrarre il volume della cella richiesta (passo 2.1) da 15 ml. </li><li> Aggiungere 3 ml di metilcellulosa soluzione madre (per fare 20% metilcellulosa finale) per un volume di terreno di coltura appropriato per ciascuna linea cellulare, pari a 15 ml meno il volume delle cellule e mescolare accuratamente capovolgendo. </li><li> Aggiungi 300.000 cellule al medium contenente metilcellulosa e miscelare delicatamente per inversione. </li><li> Pipettare 150 microlitri della miscela cellule / metilcellulosa / media (per un totale di 3000 cellule / pozzetto) in ciascun pozzetto di una piastra di coltura a 96 pozzetti fondo concavo e coltura a 37 ° C, 5% CO 2 per 1-4 giorni o fino a formare sferoidi uniformi (1 sferoide / pozzetto è tipicamente osservata). </li></ol> 3. RTCA Cellulari Invasion saggi NOTE: letture dell&#39;impedenza sono espressi come indice cellulare (CI), un parametro adimensionale che rappresenta una variazione relativa in cella impedenza misurata rappresenta lo stato della cella. Per l&#39;analisi, importare i dati in un foglio di calcolo, ad esempio Microsoft Excel. <ol><li> Piatto Preparazione <ol><li> Lavorando in gruppi di 4 pozzetti alla volta, aggiungere 50 microlitri matrice (diluito 1:10 in siero privo di mezzi di coltura) a ciascun pozzetto della camera superiore di una piastra a 16 pozzetti RTCA CIM per garantire che la superficie totale è coperto . Rimuovere 30 ml di matrice immediatamente, ma lentamente, per sbarazzarsi di qualsiasi liquido in eccesso. </li><li> Incubare la piastra a 37 ° C per 4 ore prima dell&#39;uso in un incubatore di coltura tissutale. </li><li> Aggiungere 30 ml di mezzo privo di siero (SFM) appropriati per ciascuna linea cellulare di cancro alla camera superiore e 160 microlitri di media con o senza siero (secondo il vostro disegno sperimentale) alla camera inferiore. </li><li> Montare la piastra CIM cliccando camera bassa nella camera superiore e equilibrmangiato in un incubatore a 37 ° C per 1 ora in un incubatore di coltura tissutale. </li></ol></li><li> Programmazione dello strumento RTCA <ol><li> Aprire il programma RTCA e selezionare la scheda &#39;Layout&#39;. Evidenziare tutti i pozzetti sperimentali. </li><li> Fai clic destro su pozzi e selezionare &#39;Attiva pozzi&#39;; quindi compilare in condizioni sperimentali e nomi di cella, se lo desideri. </li><li> Per aggiungere passaggi o sottofasi al programma, selezionare la scheda &#39;Pianificazione&#39; e fare clic destro su &#39;Aggiungi un gradino&#39;. Il primo passo è un fondo preprogrammato sweep, che è integrata automaticamente nel programma una volta sola &#39;aggiungere un passaggio&#39; viene scelto. </li><li> Inserire i dettagli del programma desiderato per la fase 2 del programma RTCA, che registrerà le letture durante la creazione del monostrato LP9. Aggiungere gli intervalli di tempo tra le letture dell&#39;impedenza selezionando la scheda &#39;Intervallo&#39; e digitando &#39;15 minuti &#39;. Aggiungi la durata sperimentale selezionando l&#39;&#39;Durata&#39; scheda did entrare in un tempo compreso tra 12-24 ore. </li><li> Per aggiungere fasi successive, selezionare la scheda &#39;Pianificazione&#39; e fare clic destro su &#39;Aggiungi un gradino&#39; e inserire i dettagli dei passaggi aggiuntivi, come sopra. Fase 3 del programma RTCA dirigerà lo strumento per effettuare le letture durante l&#39;invasione sferoide; Inserisci il &#39;5 min &#39;sotto la&#39; Intervallo &#39;scheda e &#39;48 ore&#39; nella scheda &#39;Durata&#39;. </li><li> Selezionare &#39;Plate&#39; nella barra dei menu e salvare. </li></ol></li><li> Generazione di LP9 monostrato e misurazione dei Spheroid Invasion <ol><li> Posizionare la piastra CIM in strumento RTCA e programma aperto dal precedente passaggio 3.2. Prima di aggiungere le cellule, selezionare &#39;Esegui&#39; nella barra dei menu e poi su &#39;Start&#39;. Verrà automaticamente eseguita Uno sfondo sweep (Fase 1 nelle istruzioni del software RTCA). </li><li> Rimuovere la piastra CIM dallo strumento seguendo lo sweep sfondo e posto in una cappa di coltura tissutale. </li><li> Piatto 50,000 LP9 cellule risospese in 160 microlitri SFM nella camera superiore di ciascuna piastra CIM bene. </li><li> Porre la piastra in strumento RTCA e le letture ogni 15 minuti, mentre il monostrato LP9 sta creando notte (Fase 2 del programma RTCA). </li><li> Harvest sferoidi tumorali generate nella fase 2 &#39;Generazione di sferoidi in metilcellulosa&#39;, sopra. <ol><li> Asetticamente, tagliare 1 millimetro la parte superiore di una punta di pipetta 1 ml e utilizzare per recuperare delicatamente il contenuto di ogni bene. Trasferire in una provetta sterile. </li><li> Centrifugare sferoidi a 120 xg per 8 minuti, e rimuovere metilcellulosa contenente il mezzo aspirando delicatamente. </li><li> Lavare sferoidi altre due volte con PBS, centrifugazione a 120 xg per 8 minuti per far sedimentare sferoidi dopo ogni lavaggio. </li><li> Per ogni bene sperimentale, risospendere un totale di 10 sferoidi in 160 ml di mezzo senza FBS. </li><li> Pausa l&#39;esperimento RTCA selezionando &#39;Esegui&#39; dalla barra dei menu e di controllo &amp;# 8216; Pause &#39;. Rimuovere la piastra CIM dallo strumento, e posizionare in una cappa di coltura di tessuti. Aspirare fuori il supporto di ogni bene e sostituirlo con i media sferoide contenenti (10 sfere in 160 microlitri) o di mezzi freschi per i pozzi di controllo solo LP9. </li></ol></li><li> Riportare la piastra allo strumento RTCA. Selezionare &#39;Esegui&#39; dalla barra dei menu e controllare &#39;Abort passo&#39;. Il programma si sposterà automaticamente alla fase successiva. Per riprendere l&#39;esperimento, selezionare &#39;Esegui&#39; dalla barra dei menu e verificare &#39;Start / Continue&#39;. Fase 3 nel programma RTCA avvierà. </li></ol></li><li> Analisi dei dati <ol><li> Per determinare il livello di invasività cellulare sferoide, sottrarre i valori ottenuti per il monostrato LP9 solo dalle singole letture ottenute per le linee cellulari di carcinoma ovarico in ogni tempo di valutazione. </li><li> Per tracciare &#39;invasione sferoide&#39;, normalizzare tutti i valori per il punto di tempo in cui gli sferoidi sono stati aggiunti alla piastra, da setting quel punto il tempo a &#39;0 &#39;. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Ferlay, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Estimates+of+worldwide+burden+of+cancer+in+2008%3A+GLOBOCAN%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Cancer%22%5BJournal%5D)">Estimates of worldwide burden of cancer in 2008: GLOBOCAN.</a> Int J Cancer. 127, 2893-2917 (2008).</li>
<li>Ahmed, N., Stenvers, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Getting+to+know+ovarian+cancer+ascites%3A+opportunities+for+targeted+therapy-+based+translational+research%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Oncology%22%5BJournal%5D)">Getting to know ovarian cancer ascites: opportunities for targeted therapy- based translational research.</a> Frontiers in Oncology. 3, (2013).</li>
<li>Karst, A. M., Drapkin, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ovarian+cancer+pathogenesis%3A+a+model+in+evolution%5BTitle%5D)+AND+%22J+Oncol%22%5BJournal%5D)">Ovarian cancer pathogenesis: a model in evolution.</a> J Oncol. 2010, (2010).</li>
<li>Lengyel, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ovarian+cancer+development+and+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Pathol%22%5BJournal%5D)">Ovarian cancer development and metastasis.</a> Am J Pathol. 177, 1053-1064 (2010).</li>
<li>Shield, K., Ackland, M. L., Ahmed, N., Rice, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multicellular+spheroids+in+ovarian+cancer+metastases%3A+Biology+and+pathology%5BTitle%5D)+AND+%22Gynecol+Oncol%22%5BJournal%5D)">Multicellular spheroids in ovarian cancer metastases: Biology and pathology.</a> Gynecol Oncol. 113, 143-148 (2009).</li>
<li>Hudson, L. G., Zeineldin, R., Stack, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phenotypic+plasticity+of+neoplastic+ovarian+epithelium%3A+unique+cadherin+profiles+in+tumor+progression%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Exp+Metastasis%22%5BJournal%5D)">Phenotypic plasticity of neoplastic ovarian epithelium: unique cadherin profiles in tumor progression.</a> Clin Exp Metastasis. 25, 643-655 (2008).</li>
<li>Burleson, K. M., Boente, M. P., Pambuccian, S. E., Skubitz, A. P. Disaggregation and invasion of ovarian carcinoma ascites spheroids. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBurleson%2C+KM+%22J+Transl+Med%22">J Transl Med</a>. 4, 6(2006).</li>
<li>Burleson, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ovarian+carcinoma+ascites+spheroids+adhere+to+extracellular+matrix+components+and+mesothelial+cell+monolayers%5BTitle%5D)+AND+%22Gynecol+Oncol%22%5BJournal%5D)">Ovarian carcinoma ascites spheroids adhere to extracellular matrix components and mesothelial cell monolayers.</a> Gynecol Oncol. 93, 170-181 (2004).</li>
<li>Burleson, K. M., Hansen, L. K., Skubitz, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ovarian+carcinoma+spheroids+disaggregate+on+type+I+collagen+and+invade+live+human+mesothelial+cell+monolayers%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Exp+Metastasis%22%5BJournal%5D)">Ovarian carcinoma spheroids disaggregate on type I collagen and invade live human mesothelial cell monolayers.</a> Clin Exp Metastasis. 21, 685-697 (2004).</li>
<li>Kenny, H. A., Kaur, S., Coussens, L. M., Lengyel, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+initial+steps+of+ovarian+cancer+cell+metastasis+are+mediated+by+MMP-2+cleavage+of+vitronectin+and+fibronectin%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">The initial steps of ovarian cancer cell metastasis are mediated by MMP-2 cleavage of vitronectin and fibronectin.</a> J Clin Invest. 118, 1367-1379 (2008).</li>
<li>Kenny, H. A., Nieman, K. M., Mitra, A. K., Lengyel, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+First+Line+of+Abdominal+Metastatic+Attack%3A+Breaching+the+Mesothelial+Cell+Layer%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Discov%22%5BJournal%5D)">The First Line of Abdominal Metastatic Attack: Breaching the Mesothelial Cell Layer.</a> Cancer Discov. 1, 100-102 (2011).</li>
<li>Hattermann, K., Held-Feindt, J., Mentlein, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spheroid+confrontation+assay%3A+a+simple+method+to+monitor+the+three-dimensional+migration+of+different+cell+types+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Anat%22%5BJournal%5D)">Spheroid confrontation assay: a simple method to monitor the three-dimensional migration of different cell types in vitro.</a> Ann Anat. 193, 181-184 (2011).</li>
<li>Laib, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spheroid-based+human+endothelial+cell+microvessel+formation+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Spheroid-based human endothelial cell microvessel formation in vivo.</a> Nat Protoc. 4, 1202-1215 (2009).</li>
<li>Latifi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+characterization+of+tumor+cells+from+the+ascites+of+ovarian+cancer+patients%3A+molecular+phenotype+of+chemoresistant+ovarian+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Isolation and characterization of tumor cells from the ascites of ovarian cancer patients: molecular phenotype of chemoresistant ovarian tumors.</a> PLoS One. 7, (2012).</li>
<li>Davidowitz, R. A., Iwanicki, M. P., Brugge, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+mesothelial+clearance+assay+that+models+the+early+steps+of+ovarian+cancer+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">In vitro mesothelial clearance assay that models the early steps of ovarian cancer metastasis.</a> J Vis Exp. (60), (2012).</li>
<li>Iwanicki, M. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ovarian+cancer+spheroids+use+myosin-generated+force+to+clear+the+mesothelium%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Discov%22%5BJournal%5D)">Ovarian cancer spheroids use myosin-generated force to clear the mesothelium.</a> Cancer Discov. 1, 144-157 (2011).</li>
<li>Nishi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+and+characterization+of+a+steroidogenic+human+granulosa-like+tumor+cell+line%2C+KGN%2C+that+expresses+functional+follicle-stimulating+hormone+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Establishment and characterization of a steroidogenic human granulosa-like tumor cell line, KGN, that expresses functional follicle-stimulating hormone receptor.</a> Endocrinology. 142, 437-445 (2001).</li>
<li>Xu, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+outcome+of+heregulin-induced+activation+of+ovarian+cancer+cells+depends+on+the+relative+levels+of+HER-2+and+HER-3+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">The outcome of heregulin-induced activation of ovarian cancer cells depends on the relative levels of HER-2 and HER-3 expression.</a> Clin Cancer Res. 5, 3653-3660 (1999).</li>
</ol>

Quota di accesso aperto pagata da ACEA Biosciences, Inc. e MIMR-PHI Institute of Medical Research.

Invadere le cellule tumorali ovariche interagire con una varietà di tipi di cellule sulla superficie del peritoneo, comprese fibroblasti, adipociti e cellule mesoteliali, e la comunicazione bidirezionale tra cellule tumorali e cellule peritoneali è pensato di svolgere un ruolo chiave nel guidare il processo metastatico 2. Una volta masterizzato, il protocollo qui descritto è facilmente adattabile allo studio di queste interazioni nel microambiente peritoneale, ad esempio, mediante l&#39;aggiunta di citochine esogene, fattori di crescita, o inibitori specifici verso le camere superiori o inferiori della piastra CIM bene o manipolazione genetica del cancro o linee cellulari peritoneale. Inoltre, questo metodo può essere usato con cellule di tumore ovarico primari raccolti di fresco da asciti maligne e / o cellule peritoneali primari per avere una visione diretta nelle segnali regolatori e le interazioni cellulari che regolano la creazione di una lesione metastatica all&#39;interno della cavità peritoneale <sup&gt; 2. L&#39;uso dello strumento RTCA per misurare la capacità invasiva delle cellule singole o sferoidi offre diversi vantaggi rispetto ai tradizionali saggi endpoint singoli e analisi di immagini time-lapse. Lo strumento RTCA misura invasione cellulare a intervalli definiti in continuo nel corso di un saggio, che può essere ore o giorni. Ciò consente la determinazione delle variazioni del tasso di invasione nel tempo, che supera i limiti dei dosaggi singoli endpoint. Ad esempio, esaminando i dati invasione delle diverse linee cellulari di cancro in un singolo endpoint (Figura 2), ad esempio, 3 ore, potrebbe aver portato alla conclusione erronea che KGN e OVCA433 cellule erano molto più invasivo rispetto OVCA429 cellule. Un altro vantaggio di questa tecnologia è che lo strumento RTCA misura variazioni di impedenza elettrica. Ciò significa che le analisi possono essere eseguiti senza etichettare le cellule con un agente esogeno, che potrebbe avere effetti indesiderati su phen cellulareotype o funzione. Questo diventa particolarmente importante quando si studiano le cellule tumorali ovariche primarie derivate da asciti maligne, con cui è essenziale mantenere manipolazioni al minimo in modo da evitare di introdurre cambiamenti molecolari e fenotipici che non riflettano la loro natura in vivo 2. Inoltre, l&#39;uso dello strumento RTCA consente la raccolta di dati quantitativi in ​​tempo reale, che non solo evita la perdita di tempo analisi associati microscopia time-lapse ma anche consente la rapida determinazione della chiave finestre sperimentali per l&#39;ottimizzazione del saggio. Ciò è particolarmente utile quando si confrontano gli effetti di una serie di fattori di invasione sferoide, fattori come diversi possono esercitare i loro effetti massimi a diversi intervalli di tempo o con differenti profili notevolmente nel tempo. Anche se questo protocollo è suscettibile di modifiche (ad esempio, l&#39;uso di matrici diverse ECM, diverse linee di cellule di cancro, o target diverso cells), se ciò, è importante notare che diverse condizioni sperimentali devono prima essere ottimizzati. Ad esempio, prima di iniziare studi di invasione sferoide, il numero ottimale di cellule tumorali / piastra CIM bene dovrebbe innanzitutto essere determinata mediante saggio del numero di cellule titolazioni in coltura monostrato. Il numero ottimale di sferoidi da utilizzare per ben si basa quindi su questa analisi. Ad esempio, nel metodo corrente, sferoidi comprendono circa 3.000 cellule ogni momento della generazione. Se iniziali numero di cellulare titolazioni indicano che 30.000 cellule in monostrato sono ottimali per il rilevamento nell&#39;invasione analisi, poi 10 sferoidi sono aggiunti per piastra CIM bene. Inoltre, per lo svolgimento di esperimenti di co-coltura, è importante studiare i comportamenti del &#39;bersaglio&#39; monostrato cellulare separatamente al fine di determinare se queste cellule sono intrinsecamente invasiva, in quanto ciò potrebbe confondere i risultati. Nell&#39;esempio mostrato, sferoidi tumorali sono placcati su di un Monola cella LP9yer, con e senza FBS aggiunto in fondo così come un chemoattractant. In parallelo, le cellule vengono coltivate LP9 soli, sotto ogni condizione di trattamento. Analogamente, quando si studia la capacità invasiva delle cellule e sferoidi, è anche importante esaminare le loro capacità migratorie e per distinguere i due comportamenti (cioè invasione richiede la digestione proteolitica di una barriera ECM mentre la migrazione non). Per fare questo, omettere la barriera ECM (Passi 3.1.1 - 3.1.3) e condurre il test in parallelo con la barriera ECM in luogo. Quest&#39;ultima misura &#39;invasione&#39; può essere corretto al precedente provvedimento &#39;migrazione&#39;, se lo si desidera. Infine, è importante notare che le informazioni ottenute dalle misure di impedenza elettrica non sono complete: una volta cellule hanno invaso nella camera inferiore, cambiamenti nella loro attaccamento, la diffusione, la proliferazione e sul lato inferiore della membrana possono contribuire ai cambiamenti rea impedenzaammaccature. Pertanto, questa metodologia è più informativa se usato in combinazione con altri saggi di redditività sferoide cellulare, l&#39;adesione, la migrazione e la morfologia al fine di valutare complessivamente comportamenti delle cellule sferoidali. Ad esempio, idealmente, al fine di comprendere appieno le interazioni sferoidali-mesoteliale, co-culture separate dovrebbero essere ripreso periodicamente al microscopio a fase standard in modo che le valutazioni qualitative della sferoide morfologia e la salute possono essere effettuate in parallelo con saggi RTCA quantitativi di invasione. Se viene eseguita la fase di etichettatura facoltativa, poi i comportamenti delle singole cellule tumorali possono essere determinate mediante microscopia a fluorescenza come disgregano dal sferoide e interagiscono con le cellule mesoteliali non marcati. Un ulteriore vantaggio di etichettatura fluorescenza delle cellule tumorali quando co-coltura con un secondo tipo di cellule è che è poi possibile confermare che solo le cellule tumorali hanno invaso le barriere cellulari ed ECM. <p class="jove_content"&gt; In sintesi, questo metodo rappresenta un elevato throughput analisi quantitativa di cancro ovarico sferoide invasione delle barriere mesoteliali e ECM. Attraverso l&#39;aggiunta di citochine esogene, fattori di crescita, o inibitori specifici verso le camere superiori o inferiori della piastra CIM così, questo metodo permette una rapida determinazione dei fattori che regolano le interazioni tra cellule ovariche sferoidali cancro invasione attraverso mesoteliali e barriere Matrix oltre tempo.

Il cancro ovarico ha il più alto tasso di mortalità di tutti i tumori ginecologici 1. In tutto il mondo, ci sono ~ 230.000 casi e 100.000 decessi dovuti alla malattia ogni anno 1. La maggior parte dei pazienti (&gt; 75%) sono diagnosticati dopo che il cancro si è già metastatizzato, quando il trattamento è ulteriormente complicata da una maggiore resistenza alla chemioterapia e la prognosi è infausta 2. I pazienti con stadio III-IV malattia metastatica hanno 5 anni i tassi di sopravvivenza di solo il 30-40% 3. Pertanto, vi è una necessità urgente di una migliore comprensione dei comportamenti cellulari alla base metastasi del cancro ovarico per trattare efficacemente la malattia avanzata. L&#39;attuale modello di metastasi del cancro ovarico propone diverse fasi nel processo metastatico, ciascuno dei quali si verifica in un microambiente distinto che incide sul comportamento del tumore. Metastatico delle cellule tumorali ovariche inizialmente cadono dal sito del tumore primario e sopravvivere in un nonadherstato ent nel fluido peritoneale come singole cellule o strutture multicellulari tridimensionali, definito aggregati multicellulari o sferoidi 2,4,5. Le cellule che non fanno sferoidi in sospensione sono più suscettibili a anoikis 2,4,5. Sferoidi esibiscono anche una maggiore resistenza a chemioterapici, contribuendo alla malattia residua e successiva ricorrenza del cancro 2,4,5. Un secondo passo fondamentale nella metastasi del cancro ovarico è il passaggio di aggregati da cluster free-floating ai tumori secondari stabiliti all&#39;interno della parete peritoneale e omento 5,6. Interazioni cellula-cellula e cellula-substrato sono stati implicati nella formazione di aggregati, la sopravvivenza e l&#39;adesione alla matrice extracellulare (ECM) prodotta dal rivestimento mesoteliali del peritoneo 4-11. Al momento, questi processi sono poco conosciuti. Per definire i meccanismi coinvolti nella diffusione dei tumori ovarici, sferoidi possono essere generATED da linee cellulari di cancro stabiliti con metodi di coltura non aderenti, mantenendo le cellule in sospensione o aggiungendo metilcellulosa ai terreni di coltura 12,13 o coltivando cellule su piastre basso attaccamento 2,14. Quando coltivate in questo modo, le cellule tumorali ovariche assemblano in aggregati multicellulari o sferoidi che presentano analoghe proprietà cellulari, molecolari e biochimici a quelli degli aggregati tumorali presenti in vivo 2,14. Dopo la formazione, sferoidi possono essere successivamente raccolti dal mezzo nonadherent e ripiastrate su una varietà di superfici solide per ulteriori studi funzionali. Questo rappresenta un progresso rispetto saggi in coltura monostrato, che non modellare accuratamente i comportamenti di cellule tumorali ovariche metastatizzanti all&#39;interno di un ambiente nonadherent come fluido intraperitoneale. La capacità invasiva delle sferoidi tumorali può essere valutata in saggi endpoint tradizionali Boyden camere 2 </sup&gt;, ma questo approccio può essere fuorviante, come l&#39;invasione delle cellule di cancro ovarico è un processo dinamico nel tempo. Un metodo real-time recente è stato ideato utilizzando time-lapse video microscopia della clearance cellule mesoteliali invadendo sferoidi tumorali ovariche 15,16; Tuttavia, l&#39;analisi di dati time lapse richiede tempo e può essere personale. Qui, una rapida, metodo quantitativo per valutare i comportamenti invasivi di sferoidi tumorali ovariche in tempo reale è descritto. In primo luogo, un modello cellulare sferoide-mesoteliali è stato stabilito che rappresenta la fase di metastasi del cancro ovarico quando sferoidi multicellulari attaccarsi e invadere il rivestimento peritoneale a formare tumori secondari. Poi metodologia per un analizzatore in tempo reale cellulare (RTCA, vedere la tabella Materiali per i dettagli dell&#39;azienda) è stato adattato per condurre quantitativi reali misure di tempo della capacità invasiva delle differenti linee di cellule di cancro ovarico coltivate come sferoidi e testati in questo modello. Nel RTCA instrumento, risposte cellulari vengono monitorati in continuo nel corso di un saggio, senza la necessità di etichette esogeni, da variazioni di impedenza elettrica di misura. Piastre di coltura appositamente progettati hanno microelettrodi oro rivestite situati sotto una membrana microporosa all&#39;interfaccia tra le camere superiori e inferiori di un 2 concamerate bene (piastre «CIM»). La posizione degli elettrodi nella camera inferiore consente la misurazione delle variazioni di impedenza elettrica come cellule invadono attraverso un ECM o ECM / barriera cellulare. L&#39;interfaccia membrana tra le 2 camere di ciascuna piastra CIM bene viene dapprima rivestito con il componente ECM di interesse. Nel sistema modello cellulare sferoide-mesoteliali, l&#39;interfaccia è rivestita con uno strato di Matrigel (vedere la tabella Materiali per i dati aziendali), per imitare il complesso ECM sottostante il rivestimento mesoteliali del peritoneo, seguito da un monostrato confluente di mesoteliali umano &#39; &quot;cellule bersaglio. Infine, preformati sferoidi tumorali ovariche sono annuncided. Cellule sferoidali cancro ovarico devono invadere attivamente attraverso lo strato di cellule bersaglio e la matrice per raggiungere la camera inferiore e alterare le letture di impedenza elettrica. Cellule bersaglio in proprio sono valutati anche per garantire che essi non invadono attraverso lo strato di matrice e sono adatti per l&#39;uso in questo saggio.

<table><tbody><tr><td>xCELLigence RTCA DP Analizzatore</td><td>ACEA biosciences</td><td>RTCA DP</td><td></td></tr><tr><td>xCELLigence Piastre CIM&nbsp;</td><td>ACEA biosciences</td><td>5665817001</td><td></td></tr><tr><td>Cell TraceTM CFSE&nbsp;</td><td>Sonde molecolari</td><td>C34554</td><td></td></tr><tr><td>Metilcellulosa (4.000 centiposi)</td><td>Sigma</td><td>M0512</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)</td><td>Life Technologies&nbsp;</td><td>11966-025</td><td></td></tr><tr><td>Medio 199&nbsp;</td><td>Tecnologie per la vita&nbsp;</td><td></td><td></td>11150067</tr><tr><td>Ham's F-12 Mix di nutrienti</td><td>Life Technologies&nbsp;</td><td></td><td></td>11765062</tr><tr><td>Fattore di crescita epidermico (EGF)</td><td>PeproTech&nbsp;</td><td>100-15</td><td></td></tr><tr><td>Idrocortisone&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>H4001</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin EDTA</td><td>Gibco-Invitrogen</td><td>15400-054</td><td></td></tr><tr><td>Piastra di coltura concava a 96 pozzetti&nbsp;</td><td>Grenier Bio-One</td><td>650185</td><td></td></tr><tr><td>LP9 Linea cellulare mesoteliale umana</td><td>Coriell Institute for Medical Research&nbsp;</td><td></td><td></td>AG07086</tr><tr><td>Matrice Matrigel ridotta con fattore di crescita</td><td>BD Biosciences&nbsp;</td><td>Codice 354230</td><td></td></tr></tbody></table>

valutazione del cancro ovarico spheroid attaccamento e l&#39;invasione delle cellule mesoteliali in tempo reale

Assessment of Ovarian Cancer Spheroid Attachment and Invasion of Mesothelial Cells in Real Time

Tumori ovarici metastasi versando nel liquido peritoneale e disperdendo ai siti distali all&#39;interno del peritoneo. Colture monostrato non modellare accuratamente i comportamenti delle cellule tumorali in un ambiente non aderente, come le cellule tumorali intrinsecamente aggregano in strutture multicellulari che contribuiscono al processo metastatico legandosi e invadendo il rivestimento peritoneale di formare tumori secondari. Per modellare questa importante fase di metastasi del cancro ovarico, aggregati multicellulari, o sferoidi, possono essere generati da linee cellulari di carcinoma ovarico istituiti conservato in condizioni non aderenti. Per simulare il microambiente peritoneale incontrato dalle cellule tumorali in vivo, un modello di co-coltura sferoide-mesoteliali stato stabilito in cui preformate sferoidi sono placcati su di un monostrato di cellule mesoteliali umano, formata su una barriera matrice extracellulare. Metodi sono stati poi sviluppati utilizzando un analizzatore di cella in tempo reale per condurre reale quantitativamisure di tempo della capacità invasiva delle differenti linee di cellule di cancro ovarico coltivate come sferoidi. Questo approccio consente la misura continua di invasione per lunghi periodi di tempo, che ha diversi vantaggi rispetto saggi endpoint tradizionali e analizza immagine microscopia tempo reale più laborioso. In breve, questo metodo permette una rapida determinazione dei fattori che regolano le interazioni tra cellule ovariche sferoidali cancro invasione attraverso mesoteliali e matrice ostacoli nel tempo.

Sferoidi tumorali ovariche possono essere generati da molti tipi di linee cellulari da loro coltura in sospensione o per la raccolta delle cellule tumorali primarie da ascite maligna 2,14. Qui due linee cellulari epiteliali cancro ovarico, OVCA433 e OVCA429, e una linea tumorale delle cellule della granulosa ovarica, KGN, sono stati utilizzati per generare sferoidi (Figura 1A). In questo metodo, le cellule sono coltivate in pozzetti fondo a U mentre sospeso in media che è stato fatto viscoso con l&#39;aggiunta di metilcellulosa. In queste condizioni, molte cellule tumorali ovariche presentano una capacità intrinseca di aggregare per formare sferoidi 13. Seguendo coltura durante la notte sospesa in metilcellulosa / media, tutte e tre le linee cellulari formate strutture sferoidali compatte di circa 400-500 micron di diametro (Figura 1A). Nel frattempo, la piastra RTCA CIM viene preparato, dapprima rivestendo l&#39;interfaccia membrana porosa con matrice e poi un monostrato confluente di mes umanicellule othelial (figura 1b). Una volta formate, sferoidi sono poi trasferiti alla piastra CIM preparato. Sferoidi tumorali prelevate vengono piastrate in cima al monostrato LP9 e valutati come descritto di seguito. Immagini al microscopio di fase standard (o al microscopio a fluorescenza, se la fase di marcatura delle cellule è stata seguita opzionale) di colture parallele sono periodicamente prelevati a favorire l&#39;interpretazione dei dati RTCA (Figura 1C). È informativo per valutare sia il livello basale di invasione di una linea cellulare di cancro, nonché invasione chemoattractant indotta. Tipicamente, invasività basale viene misurata mediante l&#39;aggiunta di SFM ad entrambe le camere superiore ed inferiore. Mezzi completi (10% FBS), che contiene molti potenziali fattori chemiotattici, viene utilizzato nell&#39;esempio corrente di esaminare &#39;chemiotattico indotto&#39; invasione (Figura 2). Studi paralleli di LP9 sole cellule mesoteliali hanno confermato che queste cellule sono minimamente ininvasiva oltre 2 giorni sotto sia basale o &#39;chemoattractant&#39; condizioni indotte e quindi erano un buon tipo di cellule da utilizzare in saggi di co-coltura con cellule di cancro ovarico (Figure 2A e 2B). Al contrario, sferoidi tumorali ovariche generati utilizzando una qualsiasi delle tre linee cellulari esposte la capacità di invadere verso un chemiotattico (FBS) (Figure 2A-2C). Il principale vantaggio di utilizzare gli strumenti in tempo reale RTCA oltre saggi endpoint tradizionali è che i cambiamenti nel comportamento delle cellule / sferoide possono essere quantificati nel corso del tempo. Sopra il test 2 giorni, la KGN, OVCA429, e linee cellulari OVCA433 tutti esposti la capacità di invadere verso un chemiotattico (indicato aumentando indici cellulari) ma bassi livelli basali di invasione (Figura 2C). Le linee cellulari esposte tassi simili di invasione, come indicato dalle piste parallele delle curve (Figura 2C); Tuttavia, la curva OVCA429 esposto un elevato asintoto superiore,che ha indicato un livello massimo superiore di invasione rispetto alle altre linee cellulari. Inoltre, le linee cellulari esposte differenze nei loro tempi di insorgenza di invasione, con le cellule KGN invadere rapidamente le cellule e matrice barriere e la OVCA433 e OVCA429 cellule prendono 3-5x più di invadere rispettivamente (Figura 2D). È importante sottolineare che i loro comportamenti allo scoppio della invasione non sono risultati predittivi della loro capacità complessiva di invasione (Figure 2C e 2D). Ciò suggerisce diverse capacità intrinseche delle linee cellulari del cancro ma anche può indicare che diversi fattori possono disciplinare precoci e tardivi comportamenti invasivi di sferoidi. <img alt="Figura 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51655/51655fig1highres.jpg" width="500" /> Figura 1 generazione Spheroid e il modello sperimentale di impostare una:.. Homaghi sotto microscopio a contrasto di fase sferoidi formando in metilcellulosa / media (in alto) e della linea cellulare di corrispondenza cresciuto come un monostrato (in basso) B:. schematico che mostra il RTCA 2 camerata piastra CIM ben impostato, in cui preformato cancro ovarico sferoidi sono placcati su di un monostrato di un LP9 mesoteliali strato / barriera matrice nella camera superiore e supporti ± FBS come fattore chemiotattico è aggiunto alla camera inferiore. Elettrodi sotto l&#39;interfaccia del provvedimento 2 camere crescente impedenza elettrica come più cellule invadono le barriere al minor camera C:. Immagini di sferoidi KGN sulla parte superiore del monostrato LP9 al microscopio a contrasto di fase (sinistra) o microscopia a fluorescenza (a destra). Barre di scala = 100 micron. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51655/51655fig1highres.jpg" target="_blank">cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> .. Figura 2 in tempo reale i dati ovarico sferoide cancro invasione A - B: risultati rappresentativi da un&#39;invasione test RTCA condotta con e senza FBS nella camera di fondo di un piatto CIM bene. Invasione delle cellule KGN viene confrontato con cellule mesoteliali LP9. I risultati sono mostrati come media ± SD cellulare Indice dai pozzi triplice copia agli hr timepoint 24 (A) e oltre un intero periodo di test due giorni (B) C - D:. Un confronto tra la capacità invasiva delle KGN, OVCA429, e la cella OVCA433 linee raffigurati nelle 24 ore (C) e in modo più dettagliato in un periodo di tempo 2,5 hr (D).

Ovarico invasione delle cellule di cancro nel rivestimento mesoteliali del peritoneo è un processo dinamico nel tempo. Utilizzando un analizzatore in tempo reale, la capacità invasiva delle cellule tumorali ovariche in una cella modello di co-coltura sferoide-mesoteliali può essere quantificato in periodi di tempo prolungati, fornendo approfondimenti fattori che regolano il processo metastatico.

Valutazione del cancro ovarico Spheroid attaccamento e l&#39;invasione delle cellule mesoteliali in tempo reale

Ovarian cancers metastasize by shedding into the peritoneal fluid and dispersing to distal sites within the peritoneum. Monolayer cultures do not ...

L'obiettivo generale di questa procedura è quantificare rapidamente in tempo reale l'invasione delle cellule del carcinoma ovarico in un modello di co-coltura con cellule mesoteliali asteroidi che riproduce la metastasi. Questo risultato si ottiene innanzitutto generando cellule del carcinoma ovarico da linee cellulari coltivando le cellule in condizioni non aderenti in metilcellulosa. Il secondo passaggio consiste nel preparare un analizzatore cellulare in tempo reale, una piastra CIM, rivestendo la camera superiore della pozzetta a doppia camera con matrigel per mimare la membrana basale sottostante il mesotelio della cavità peritoneale e lo stesso rivestimento mesoteliale.Successivamente, i steroidi del cancro ovarico vengono raccolti e aggiunti alle camere superiori delle pozzette della piastra per l'analizzatore in tempo reale. L'ultimo passaggio consiste nel programmare e avviare l'analizzatore cellulare in tempo reale, che effettuerà rilevamenti periodici a intervalli predeterminati per un periodo prolungato del saggio. Alla fine, i risultati ottenuti rappresentano il processo di invasione continuo, utilizzato per determinare i fattori chiave che regolano le cellule del cancro ovarico durante l'attraversamento di barriere cellulari e della matrice.Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti, come i saggi standard di invasione delle cellule tumorali, è che questo approccio consente misurazioni continue dell'invasione delle cellule tumorali per periodi di tempo prolungati. A differenza di un saggio endpoint singolo, che non cattura appieno la natura dinamica delle metastasi del carcinoma ovarico, sebbene questo metodo venga utilizzato per ottenere informazioni sul cancro ovarico, può essere applicato anche allo studio di diversi tipi di processi metastatici, come il cancro al seno o l'invasione delle cellule tumorali attraverso uno strato endoteliale. Allo stesso modo, può essere impiegato per studiare l'invasione cellulare normale, come l'invasione dei trofoblasti durante l'impianto dell'embrione. Per preparare le cellule del carcinoma ovarico per l'etichettatura fluorescente delle cellule.Prima di tutto, raccogliere le cellule al 75% di confluenza e risospendere le cellule a una concentrazione finale di un milione di cellule per millilitro in un millilitro di PBS pre-riscaldato per ogni 0,1% di BSA. Aggiungere la quantità ottimale di steroidi per pozzetto e manipolare gli steroidi con attenzione sono passaggi fondamentali per il successo di questa procedura. Successivamente, aggiungere due microlitri di una soluzione stock di Cell Trace CSFE a cinque millimolari alle cellule, ottenendo una concentrazione finale di 10 micromolari, e incubare a 37 gradi Celsius per 10-15 minuti. In un bagno a temperatura controllata, bloccare la reazione con un millilitro di mezzo freddo ghiacciato contenente il 10% di FBS e ri-pellettizzare mediante centrifugazione. Risospendere in 10 millilitri di mezzo di crescita pre-riscaldato appropriato e seminare le cellule in un fiasco da coltura da 75 centimetri quadrati con tappo filtrante, a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica, fino a quando il livello di marcatura fluorescente risulti adeguato per la rilevazione.Iniziare questa procedura misurando il volume di mezzo di coltura appropriato per ciascuna linea cellulare, pari a 15 millilitri meno il volume di cellule necessario per la generazione delle sferoidi. Aggiungere tre millilitri di soluzione madre di metilcellulosa al mezzo di coltura per ottenere una concentrazione finale di metilcellulosa del 20% e mescolare accuratamente mediante inversione delicata. Aggiungere 300.000 cellule al mezzo contenente metilcellulosa e mescolare accuratamente mediante inversione delicata; pipettare 150 microlitri della miscela di cellule e metilcellulosa in ciascun pozzetto di una piastra di coltura a 96 pozzetti con fondo concavo.Questo porterà a una coltura con un totale di 3000 cellule per pozzetto a 37 gradi Celsius, 5% di anidride carbonica per uno a quattro giorni o fino alla formazione uniforme di PHE. Tipicamente, un singolo steroido per pozzetto viene osservato nell'analizzatore cellulare in tempo reale o nel saggio di invasione cellulare RTCA che utilizza una piastra CIM a due camere RTCA a 16 pozzetti. Lavorando in gruppi di quattro pozzetti alla volta, aggiungere 50 microlitri di matrice in ciascun pozzetto della camera superiore della piastra per assicurare che l'intera superficie sia ricoperta.Rimuovere immediatamente, ma lentamente, 30 microlitri di matrice per eliminare qualsiasi liquido in eccesso. Incubare la piastra a 37 gradi Celsius per quattro ore prima dell'uso in un incubatore per colture cellulari. Dopo quattro ore, aggiungere 30 microlitri di mezzo privo di siero, appropriato per ciascuna linea cellulare tumorale, nella camera superiore e 160 microlitri di mezzo con o senza siero.Secondo il disegno sperimentale relativo alla camera inferiore, assemblare la piastra CIM inserendo la camera inferiore in quella superiore ed equilibrare in un incubatore a 37 gradi Celsius. Per un'ora in un incubatore per colture cellulari, aprire il programma RTCA e selezionare la scheda layout. Evidenziare tutte le pozzette sperimentali, fare clic con il tasto destro sulle pozzette e selezionare l'opzione per attivare le pozzette.Quindi compilare le condizioni sperimentali e i nomi dei cicli secondo necessità. Per aggiungere passaggi o sottopassaggi al programma, selezionare la scheda programma e fare clic con il tasto destro su aggiungi un passaggio. Il primo passaggio è una scansione di fondo preprogrammata, che viene automaticamente incorporata nel programma.Dopo aver selezionato l'aggiunta di un passaggio, inserire i dettagli desiderati del programma per il secondo passaggio del programma RTCA, che registrerà le letture durante lo sviluppo del monostrato di nove cellule mesoteliali umane LP. Aggiungere gli intervalli di tempo tra le letture di impedenza selezionando la scheda intervallo e inserendo 15 minuti. Aggiungere la durata dell'esperimento selezionando la scheda durata e inserendo un tempo compreso tra 12 e 24 ore.I passaggi successivi vengono aggiunti nello stesso modo. Il passaggio tre del programma RTCA indirizzerà lo strumento a effettuare letture durante l'invasione da parte di frid. Inserire cinque minuti nella scheda intervallo e 48 ore nella scheda durata.Selezionare "Plate" sulla barra del menu e salvare. Per iniziare questa procedura, posizionare la piastra CIM nello strumento RTCA e aprire il programma salvato in precedenza. Selezionare "Execute" sulla barra del menu, quindi avviare: verrà automaticamente eseguita una scansione di fondo.Dopo la scansione di fondo, rimuovere la piastra CIM dallo strumento e posizionarla in una cappa a flusso laminare. Sospendere 50.000 cellule LP nine in 160 microlitri di mezzo privo di siero e aggiungerle nella camera superiore di ciascuna piastra CIM. Posizionare quindi la piastra nello strumento RTCA ed effettuare letture ogni 15 minuti mentre il monostrato di cellule LP nine si stabilizza durante la notte. Il giorno seguente, tagliare asetticamente un millimetro dalla punta superiore di una pipetta da un millilitro e utilizzarla per prelevare delicatamente il contenuto di ciascun pozzetto per ogni linea cellulare.Raccogliere 10 steroidi in un tubo sterile e centrifugare a 120 ×g per otto minuti, quindi rimuovere delicatamente il mezzo contenente metilcellulosa mediante aspirazione. Lavare le sferette due volte con PBS centrifugando ogni volta a 120 ×g per otto minuti, al fine di raccogliere gli steroidi in pellet dopo ogni lavaggio.Per ogni pozzetto sperimentale, risospendere un totale di 10 steroidi in 160 microlitri di mezzo senza PBS. Pausare l'esperimento RTCA selezionando "esegui" dalla barra del menu e spuntando l'opzione pausa. Rimuovere la piastra CIM dall'apparecchio e posizionarla in una cappa a flusso laminare per colture cellulari.Aspirare il mezzo da ogni pozzetto e sostituirlo con mezzo contenente steroidi. Riposizionare la piastra nell'apparecchio RTCA. Selezionare esegui dalla barra del menu e verificare il passaggio di interruzione.Il programma passerà automaticamente al passaggio successivo. Per riprendere l'esperimento, selezionare "execute" dalla barra del menu e verificare l'opzione "start continue". Il passaggio tre del programma RTCA avvierà in questo esperimento due linee cellulari di carcinoma ovarico epiteliale OVCA 4 33 e OVCA 4 29 e una linea tumorale di cellule della granulosa ovarica.I KGN sono stati utilizzati per generare steroidi dopo una coltura notturna e colture sospese in un mezzo contenente metilcellulosa con fondi a U. Tutte e tre le linee cellulari hanno formato strutture compatte di steroidi di circa 400-500 micrometri di diametro. I pannelli inferiori mostrano la linea cellulare corrispondente coltivata in un sistema a monolayer.Le barre rappresentano 100 micrometri una volta formati. I composti steroidei sono stati raccolti e seminati sopra un monostrato di cellule mesoteliali LP9 in una piastra R-T-C-A-C-I-M. Le immagini ottenute mediante microscopia a contrasto di fase o microscopia a fluorescenza di colture parallele sono state acquisite periodicamente per facilitare l'interpretazione dei dati RTCA.È istruttivo valutare sia l'invasione basale di una linea cellulare tumorale sia l'invasione indotta da chemiotassi. In questo esempio, l'invasività basale viene misurata aggiungendo mezzo privo di siero, o SFM, sia nella camera superiore sia in quella inferiore. Per esaminare l'invasione indotta da chemiotassi, si utilizza un mezzo completo contenente il 10% di FBS, che comprende numerosi possibili chemiotattici.Qui sono mostrati risultati rappresentativi di un confronto sull'invasione cellulare tra le cellule kgn e le cellule mesoteliali LP nine. Il saggio di invasione RTCA &egrave; stato eseguito con e senza FBS nella camera inferiore di una piastra CIM. I risultati sono mostrati come indice cellulare medio positivo meno deviazione standard (SD) da pozzetti triplicati al tempo di 24 ore e durante l'intero periodo del saggio di due giorni.Questi risultati confermano che le cellule LP9 sono minimamente invasive nel corso di due giorni sia in condizioni basali che indotte da chemiotattanti, e pertanto rappresentano un tipo cellulare adatto da utilizzare in saggi di co-coltura con cellule tumorali ovariche. Al contrario, le cellule KG e gli steroidi prodotti dalle cellule tumorali ovariche hanno mostrato la capacità di invadere in direzione di un chemiotattante. Questo grafico presenta i risultati di un confronto sulla capacità invasiva delle linee cellulari KGN-OVCA 429 e OVCA 433, rappresentati nel corso di un periodo di 24 ore durante il saggio di due giorni.Tutte e tre le linee cellulari hanno mostrato la capacità di invadere in direzione di un chemiotattante, come indicato dall'aumento degli indici cellulari. Le linee cellulari hanno mostrato tassi simili di invasione, come indicato dalle pendenze parallele delle curve. Tuttavia, la curva di OVCA 4 29 presenta un asintoto superiore più elevato, il che indica un livello massimo di invasione maggiore rispetto alle altre linee cellulari.Al contrario, i livelli basali di invasione di tutte le linee cellulari erano bassi. Inoltre, le linee cellulari hanno mostrato differenze nei tempi di insorgenza dell'invasione, come evidenziato da un'analisi più dettagliata dei dati di invasione su un periodo di 2,5 ore. Le cellule KGN invadono le barriere cellulari e della matrice rapidamente, mentre le cellule OVC 4 33 e OVC 4 29 impiegano rispettivamente tre e cinque volte più tempo per invadere.È importante notare che i loro comportamenti all'inizio dell'invasione non erano predittivi della loro capacità complessiva di invadere. Questo suggerisce diverse capacità intrinseche delle linee cellulari tumorali, ma potrebbe anche indicare che diversi fattori regolano i comportamenti invasivi precoci e tardivi degli steroidi. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere facilmente adattata per studiare diverse molecole di segnalazione e vie cellulari all'interno del microambiente peritoneale che influenzano il comportamento metastatico.Questo può essere ottenuto aggiungendo fattori di crescita esogeni, citochine o inibitori alla camera superiore o inferiore della piastra. In alternativa, è possibile manipolare geneticamente le cellule tumorali stesse o le cellule bersaglio peritoneali.

assessment-ovarian-cancer-spheroid-attachment-invasion-mesothelial

Research

Ricerca

JoVE Journal

Medicine

Medicina

Un test per misurare quantitativamente fattore di crescita trasformante (TGF)-β-indotta invasione in 3-dimensionale gel collagene è descritto. Questo saggio si avvale della MCF10A serie di linee cellulari, che rappresentano diversi stadi di sviluppo del cancro al seno. Questo metodo può essere adottato per essere utilizzato con altre linee cellulari e può essere utilizzato per indagare altri potenziali attivatori o inibitori di invasione.

Saggio sferoide Misura TGF-β-indotta Invasion

Il saggio di liquidazione mesoteliali qui descritto si avvale di cellule fluorescente e microscopia time-lapse video visualizzare e misurare quantitativamente le interazioni di sferoidi multicellulari di cancro ovarico e monostrati di cellule mesoteliali. Questo saggio modella i primi passi di metastasi del cancro ovarico.

In vitro test Clearance mesoteliali che modella i primi passi di metastasi del cancro ovarico

Descriviamo metodologie per la creazione...

Eterotipica tridimensionale<em&gt; In Vitro</emModellazione&gt; di stromale-epiteliali interazioni Durante iniziazione e la progressione del cancro ovarico

In questo video, dimostriamo lo sviluppo di un modello tridimensionale in vitro del rivestimento della cavità peritoneale. Questa coltura organotipica può aiutare a studiare l'adesione, l'invasione e la proliferazione delle cellule tumorali ovariche.

Modellazione delle metastasi del cancro ovarico nel rivestimento della cavità peritoneale: un metodo per stabilire un modello 3D in vitro del rivestimento peritoneale

Questo video descrive una tecnica per misurare quantitativamente l'interazione degli sferoidi del cancro ovarico con le cellule mesoteliali, utilizzando cellule marcate in fluorescenza e microscopia video time-lapse. Questo test in vitro modella l'interazione tra gli sferoidi delle cellule tumorali ovariche metastatizzanti e le cellule mesoteliali che rivestono la cavità peritoneale in vivo.

Saggio di clearance mesoteliale: una tecnica in vitro per quantificare la capacità di invasione degli sferoidi del cancro ovarico nei monostrati di cellule mesoteliali

L'invasione dei tessuti normali circostanti è una caratteristica distintiva dei tumori maligni. Forniamo qui un semplice saggio semi-automatico su micropiastra dell'invasione in una biomatrice 3D naturale che è stata esemplificata con una serie di modelli di tumori umani avanzati.

Tridimensionale (3D) Tumore Spheroid Invasion Assay

Delineiamo un protocollo che implementa approcci sia in vivo che ex vivo per studiare la colonizzazione del cancro ovarico dei tessuti adiposi peritoneali, in particolare dell'omento. Inoltre, presentiamo un protocollo per quantificare e analizzare le strutture cellulari immunitarie nell'omento, note come macchie lattiginose, che promuovono le metastasi del adiposo peritoneale.

In vivo ed ex vivo approcci per studiare il cancro ovarico metastatico colonizzazione delle strutture Lattea Spot in peritoneale adiposo

Le metastasi del cancro ovarico sono caratterizzate da numerose lesioni diffuse intra-peritoneali, tali da rendere difficile un'accurata quantificazione visiva del carico tumorale.  Qui descriviamo un metodo per la quantificazione in situ ed ex vivo del carico tumorale metastatico utilizzando cellule tumorali marcate con proteina fluorescente rossa (RFP) e imaging ottico.

La quantificazione di intra-peritoneale del cancro ovarico metastasi

Questo metodo valuta l'invasione delle cellule tumorali dagli sferoidi in una matrice 3D circostante.  Gli sferoidi vengono generati con il metodo della coltura a goccia sospesa e quindi incorporati in una matrice composta da materiali a membrana basale e collagene di tipo I.  L'invasione degli sferoidi viene successivamente monitorata.

Un Cancer Cell Saggio sferoide valutare Invasion in un Ambiente 3D

Qui, presentiamo un protocollo per costruire un modello tridimensionale in vitro del rivestimento della cavità peritoneale, composto da cellule mesoteliali umane primarie e fibroblasti stratificati con matrice extracellulare, come strumento per studiare l'adesione, l'invasione e la proliferazione delle cellule tumorali ovariche.

Modellazione Piazza precoci di cancro ovarico Diffusione in una cultura Organotipica della Cavità peritoneale umano

Per studiare la progressione del tumore ovarico in un modello fisiologicamente rilevanti, sferoidi multicellulari sono state coltivate in un Microdevice sotto flusso del fluido simulato. Questo modello 3D dinamica emula l'ambiente intraperitoneale con i componenti cellulari e meccanici in cui si verifica metastasi del cancro ovarico.

Modellazione Comportamento Ovarian Cancer multicellulare Spheroid in un Microdevice dinamica 3D peritoneale

Scopri un metodo di analisi in tempo reale per quantificare l'invasione delle cellule del cancro ovarico attraverso il rivestimento mesoteliale. Questa tecnica consente misurazioni continue del processo metastatico nel tempo.

Valutazione del cancro ovarico Spheroid attaccamento e l'invasione delle cellule mesoteliali in tempo reale

Esplora altri video