Identificazione delle proteine ​​partner di interazione in cellule di mammifero Uso SILAC-immunoprecipitazione quantitativi Proteomica

L'obiettivo generale di questa procedura è identificare i partner di interazione proteica per una data proteina di interesse. Ciò si ottiene coltivando prima le cellule in terreni di coltura cellulare contenenti arginina e lisina marcati con diversi isotopi stabili di carbonio e azoto. Il secondo passo consiste nel trasfettare i plasmidi e rivestire una proteina di interesse o un plasmide di controllo nelle cellule marcate.

Successivamente, le cellule vengono lisate e i campioni vengono immunoprecipitati dai lisati. Quindi volumi uguali di precipitati di controllo e campioni di immunoprecipitati vengono combinati e inviati per l'analisi lc MS MS. Il passo finale consiste nell'analizzare i dati della spettrometria di massa per identificare le proteine che interagiscono con la proteina di interesse.

In definitiva, la marcatura degli isotopi stabili degli amminoacidi in colture cellulari o nelle precipitazioni di amminoacidi silac è in grado di identificare un gran numero di interazioni dirette e indirette con una proteina di interesse dalle cellule di coltura tissutale. Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti, come il tap tagging, è che elimina la necessità per il ricercatore di inviare singole bande dalla spettrometria di massa. Ciò rimuove un'importante fonte di distorsione aumentando al contempo la sensibilità.

Sebbene questo metodo possa essere utilizzato per fornire informazioni sulle proteine cellulari, le interazioni proteiche possono essere applicate anche ad altri sistemi, come lo studio delle interazioni tra patogeni e ospiti. Per iniziare, raschiare le cellule HEK 2 93 T marcate SLAC, esprimendo la proteina di interesse marcata con GFP o il controllo GFP dal piatto di coltura cellulare in PBS ghiacciato, quindi centrifugare la sospensione cellulare a 220 volte G per cinque minuti a quattro gradi Celsius, lavare le cellule altre tre volte in 10 millilitri di PBS ghiacciato Risospendere il pellet cellulare in 200 microlitri di tampone di lisi cellulare contenente cocktail di inibitori della proteasi appena aggiunti tre a una concentrazione X e aggiungere cinque microlitri di cocktail di RNA per millilitro di tampone di lisi, incubare su ghiaccio per cinque minuti. Quindi centrifugare il lisato cellulare a 13.000 volte G per 10 minuti a quattro gradi Celsius e conservare il surnatante come lisato cellulare solubile.

Misurare la concentrazione proteica del lisato cellulare utilizzando il saggio A BCA. Quindi normalizzare la concentrazione proteica in ciascun campione di lisato in un volume finale di 500 microlitri utilizzando il tampone di lisi contenente inibitori della proteasi. Aggiungere 500 microlitri di tampone di diluizione contenente un cocktail di inibitori della proteasi tre a ciascuno dei lisati cellulari normalizzati per regolare il volume totale a un millilitro.

Conservare i lisati sul ghiaccio durante la preparazione delle perle anti GFP e conservare un'aliquota di 50 microlitri di ciascun campione da utilizzare per l'input del campione. Vorticare il liquame di perline per risospendere le perline. Quindi utilizzare un puntale per pipetta da 200 microlitri con il cutoff finale per trasferire 25 microlitri di perline per campione in una provetta nuova.

Per ogni 25 microlitri di impasto liquido di perle, aggiungere 20 volumi di tampone di diluizione per il lavaggio, centrifugare le perle a 2.700 volte G per cinque minuti. Lavare le perle altre volte con 20 volumi di tampone di diluizione. Quindi, aggiungere 100 microlitri di tampone di diluizione per 25 microlitri di liquame di perline.

Quindi utilizzare un puntale per pipetta da 200 microlitri con il cutoff finale per trasferire 85 microlitri di liquame di perle risolute a ciascuno dei lisati campione etichettati SLAC. Incubare i campioni con perle su un rotatore a quattro gradi Celsius per due ore dopo che i campioni sono stati incubati con le perle, centrifugare i campioni a 2.700 volte G per cinque minuti a quattro gradi Celsius. Conservare 50 microlitri di surnatante come campione non legato e scartare il resto del surnatante.

Risospendere le perle in ciascuna provetta in un millilitro di tampone di diluizione, quindi centrifugare a 2.700 volte G per cinque minuti a quattro gradi Celsius. Ripetere questa fase di lavaggio due volte per eluire le proteine dalle perline. Aggiungere 50 microlitri di due tamponi di caricamento XSDS a ciascun campione e riscaldare a 95 gradi Celsius per 10 minuti.

Una volta terminato il riscaldamento, centrifugare ogni campione a 2.700 volte G per cinque minuti a quattro gradi Celsius. Trasferire il surnatante in provette prelubrificate e conservarlo a una temperatura negativa di 80 gradi Celsius fino al momento dell'invio per l'analisi MS. Quindi mescolare volumi uguali di precipitati amminici di controllo e campione e inviare il campione combinato a una struttura di spettrometria di massa per l'analisi lc ms MS.

Prima di analizzare i dati della spettrometria di massa, copiare i dati grezzi in un nuovo foglio di calcolo. Quindi, in questo foglio di calcolo, rimuovere tutte le colonne ad eccezione di quelle contenenti il numero di accesso, il numero di rapporti peptidici univoci, il confronto dei campioni, la variabilità del rapporto e la descrizione delle proteine. Utilizzare la funzione di ordinamento di Excel per ordinare i dati in base al numero di peptidi e rimuovere le voci per le proteine prive di più di un peptide.

Quindi ordina per rapporto e rimuovi le proteine che mancano di rapporti SLAC. Quindi, convertire i rapporti slac in registrare due valori. L'uso della formula è uguale alle parentesi logaritmiche, al rapporto SLAC due e alle parentesi in cui il rapporto SLAC è sostituito dall'identificatore di cella.

Creare quindi una nuova colonna nel file Excel e calcolare Log due rapporti SLAC per tutte le colonne fittizie di esempio per la conversione di un rapporto di esempio in un rapporto di simulazione di esempio. Usa la formula uguale a uno diviso per rapporto. Apri il prisma GraphPad.

Seleziona nuova tabella dati e grafico Seleziona colonna dall'elenco sul lato sinistro della finestra e seleziona Inserisci dati di importazione. Immettere i valori di replica impilati nelle opzioni delle colonne. Premi Crea.

Quindi selezionare e copiare una determinata colonna del rapporto SLAC simulato di due esempi di log dal foglio di calcolo Excel nel nuovo file prisma. Quindi, fai clic sul menu di inserimento a discesa e seleziona nuova analisi. In Analisi colonna, selezionare la distribuzione di frequenza.

Mantieni le opzioni predefinite e fai clic su OK. Nella cartella dei risultati, sarà stata generata una nuova sezione dell'istogramma. Selezionare la sezione della distribuzione di frequenza, quindi fare clic sul menu a discesa di inserimento e selezionare la nuova analisi XY non lineare di regressione curve fit.

Fare clic su Distribuzione gaussiana e fare clic su OK. Nella finestra dei risultati che appare vengono fornite la media e la deviazione standard. Genera una soglia aggiungendo 1,96 deviazioni standard al ritorno medio al file Excel.

Creare una nuova scheda denominata aggiunta alla colonna A dell'etichetta combinata e copiare tutti i numeri di accesso di ognuno dei singoli esperimenti in questa singola colonna. Quindi, seleziona la scheda dati e quindi l'opzione Rimuovi duplicati. Quindi crea colonne per i rapporti SLAC e la variabilità dei rapporti di ciascun esperimento, nonché per la colonna di descrizione del nome della proteina.

Nella scheda descrizione, utilizzare la formula CERCA.VERT per raccogliere la descrizione di ogni numero di accesso. Trascinare la formula verso il basso nella colonna per inserire la descrizione della proteina, quindi utilizzare questa formula per ottenere i dati relativi al rapporto e alla variabilità dai singoli esperimenti. Per evidenziare le proteine interagenti nel set di dati combinato, prendere nota del valore di soglia per un particolare esperimento.

Seleziona la colonna del rapporto e fai clic sulla scheda Home. Seguito dalla formattazione condizionale, evidenzia le celle regole più regole, quindi seleziona lo stile Il formato classico vende solo che contengono un valore di vendita maggiore o uguale a. Nella casella, digitare il valore di deviazione standard 1,96 e fare clic su OK.

Valutare la variabilità del rapporto per ogni interazione positiva. Se si sottrae la percentuale di variabilità, l'hit scende al di sotto del valore di soglia. Questo dovrebbe essere trattato con cautela.

Ripetere l'operazione per ciascuna delle colonne dei risultati e confrontare tra gli esperimenti, le proteine evidenziate identificate in due o più esperimenti rappresentano un'interazione ad alta confidenza. L'analisi del western blot ha confermato la purificazione della proteina di interesse marcata con GFP. La mancanza di una banda DH gap nei campioni legati indica che le proteine non interagenti sono state esaurite dai campioni durante la fase di immunoprecipitazione, mentre la presenza di una banda EIF 4G in questi campioni indica che i partner di legame interagenti noti sono stati mantenuti.

Molte delle proteine leganti EIF quattro A identificate erano conservate tra le due isoforme. Le proteine che interagiscono con EIF quattro A sono identificate dall'alto rapporto LAC, mentre le proteine non specificamente legate in questo esperimento hanno rapporti inferiori a 0,96. In questo diagramma del complesso del fattore di iniziazione, le quattro proteine leganti l'EIF A che sono state identificate nell'esperimento di precipitazione amminica SLAC sono ombreggiate in rosso e bianco.

Secondo il rapporto SLAC log due, l'elevata copertura dei partner di legame diretti e indiretti dei quattro complessi EIF A uno e due illustra l'efficacia di questo approccio per identificare le interazioni proteiche Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare che mentre alcune variazioni nei livelli proteici possono essere compensate nella fase di analisi dei dati, È meglio se questo può essere evitato garantendo un'accurata normalizzazione dei livelli di input proteico ed evitando di perdere le perle di AROS durante le fasi di lavaggio.