La glutammina Flux Imaging Utilizzando sensori geneticamente codificato
31 luglio 2014
In questo articolo verrà illustrato come monitorare le dinamiche di glutammina in cellule vive usando FRET. I sensori geneticamente codificate permettono il monitoraggio in tempo reale delle molecole biologiche con una risoluzione subcellulare. Disegno sperimentale, i dettagli tecnici delle impostazioni sperimentali e considerazioni per le analisi post-sperimentali saranno discussi per i sensori di glutammina geneticamente codificati.
L'obiettivo generale di questa procedura è quello di visualizzare il trasporto di glutammina attraverso un trasportatore espresso eterologo in cellule vive utilizzando il trasferimento di energia di risonanza di prima qualità o i sensori FRET. Ciò si ottiene effettuando prima il sezionamento di sette cellule con un sensore di glutammina e un trasportatore. Il sensore è costituito da un donatore di tasti inserito in una proteina legante la glutammina batterica e da un accettore di tasti all'estremità C della proteina legante la glutammina.
Il secondo passo consiste nell'impostare un sistema di perfusione e visualizzare le cellule in tempo reale utilizzando un microscopio a fluorescenza invertita. Il passaggio finale consiste nell'analizzare le immagini e visualizzare la dinamica della glutammina. In definitiva, le attività del trasportatore in una singola cella possono essere rilevate utilizzando questi sensori di tasti.
Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti, come la misurazione basata sulla cromatografia, è che si ottiene una risoluzione temporale spaziale molto più elevata. Questa tecnica consiste in tre parti, trasfezione di cellule con proteine sensore, imaging in tempo reale e analisi post-sperimentale Cost. Sette cellule sono state utilizzate in questo esperimento a causa della loro bassa attività di trasporto endogeno della glutammina.
Seminare le cellule a circa il 70-80% di fluenza di co in DMEM più il 10% di siero cosmico di vitello o CCS e 100 unità per millilitro. Penicillina streptomicina in un piatto con fondo di vetro a otto pozzetti. Incubare a 37 gradi Celsius, 5% CO2, 100% di umidità per 24 ore.
Dopo 24 ore. Sostituire il terreno di coltura con DMEM più 10% CCS senza antibiotici, crescere durante la notte a 37 gradi Celsius, 5% CO2 100% di umidità il giorno della trasfezione. Aggiungere 0,4 microgrammi ciascuno del DNA plasmatico che codifica per il sensore di glutammina e lo scambiatore di aminoacidi obbligatorio etichettato m ciliegia A SCT da due a 50 microlitri di terreno privo di siero.
Aggiungere un microlitro di reagente di trasfezione a 50 microlitri di terreno privo di siero, mescolare delicatamente e incubare a temperatura ambiente per cinque minuti. Successivamente, mescolare la soluzione contenente il DNA con il reagente di trasfezione diluito e incubare a temperatura ambiente per 20 minuti. Dopo 20 minuti, aggiungere delicatamente la miscela di reagenti di trasfezione sopra le sette celle e mescolare delicatamente facendo oscillare la camera.
Incubare per 24 ore a 37 gradi Celsius, 5% di CO2 e 100% di umidità dopo 24 ore. Sostituire il terreno con DMEM più il 10% di CCS più 100 unità di penicillina streptomicina. Rimettere le cellule nell'incubatrice prima di iniziare la perfusione.
Preparare i tamponi di perfusione da A a F seguendo le ricette riportate nel manoscritto allegato. Collegare il tappo Cox a siringhe da 50 millilitri. Chiudere i rubinetti di chiusura e riempire le siringhe con le soluzioni di perfusione.
Aprire il rubinetto di arresto per un breve periodo di tempo per riempire lo spazio di testa nel rubinetto di arresto con il tampone. Successivamente accendi la gravità a otto canali. Alimentare il sistema di perfusione con una matita di perfusione e selezionare la modalità manuale.
Sotto l'opzione di selezione della funzione. Posizionare un contenitore per rifiuti sotto la matita per perfusione. Per il successo di questo esperimento, è importante impostare la perfusione in modo da ridurre al minimo la deriva e il trascinamento della soluzione.
Attivare manualmente le porte premendo i numeri corrispondenti e riempire i tubi con acqua. Utilizzando una siringa da 10 millilitri, chiudere le porte, posizionare le siringhe contenenti i tamponi da A a F sulle porte da uno a sei del sistema di perfusione e aprire i rubinetti di arresto. Dopodiché.
Riaprire le porte per sostituire l'acqua nel tubo con i tamponi. La portata dovrebbe essere di circa 0,8 millilitri al minuto. Premere una volta Annulla sul controller di perfusione per tornare al menu di selezione delle funzioni.
Passare all'opzione di modifica del programma, quindi digitare il protocollo di perfusione indicato in questa tabella. Salvare il programma di perfusione. Le cellule vengono visualizzate da 48 a 72 ore dopo la trasfezione.
Lavare due volte i pozzetti della capsula con fondo di vetro con il tampone di perfusione A, facendo attenzione a non lavare via le cellule. Posizionare il piatto inferiore in vetro sul tavolino del microscopio a fluorescenza. Collegare il sistema di perfusione alla camera.
Se si utilizza una camera aperta, installare un'altra pompa che rimuova la soluzione di perfusione dalla camera. Aprire il software di imaging del libro di diapositive. Avviare una nuova diapositiva utilizzando la funzione di messa a fuoco, trovare le celle coex che esprimono il sensore e A SCT due M ciliegia utilizzando i set di filtri appropriati.
Regola il guadagno facendo clic sulla scheda della fotocamera e facendo scorrere la barra di scorrimento sotto il guadagno. Inoltre, regolare l'impostazione del filtro a densità neutra dal menu a discesa del filtro a densità neutra. Fare clic su acquisizione immagine, quindi nella finestra di acquisizione, specificare i filtri da utilizzare.
Le immagini saranno acquisite in tre canali. Eccitazione del donatore, eccitazione del donatore, missione accettoria e missione accettoria dell'eccitazione dell'accettore. Fare clic sul pulsante di prova per regolare il tempo di esposizione digitando il tempo di esposizione desiderato nella casella Accanto alle impostazioni del filtro, tutti e tre i canali devono essere esposti per lo stesso periodo di tempo.
Disegna una regione di interesse utilizzando lo strumento regioni. Selezionare time-lapse nella casella del tipo di acquisizione. Specificare quindi l'intervallo e i punti temporali per l'esperimento.
Quindi, disegna una regione in un'area senza celle fluorescenti da utilizzare per la sottrazione dello sfondo. Fare clic con il pulsante destro del mouse sulla regione disegnata e quindi impostarla come sfondo. Idealmente, le cellule che non esprimono i sensori dovrebbero essere utilizzate come regione di fondo per tenere conto sia dell'autofluorescenza che della fluorescenza di fondo rilevate dalla telecamera.
Selezionare il programma desiderato nell'opzione Seleziona funzione di esecuzione dei programmi, passare al programma salvato e quindi premere Invio sul controller di perfusione. Il programma è ora caricato e premendo un tasto qualsiasi si avvia la perfusione per garantire che sia la perfusione che l'esperimento di imaging inizino contemporaneamente. Fare clic sul pulsante di avvio nella finestra di acquisizione contemporaneamente alla pressione di un tasto sul controller di perfusione.
Qui sono mostrati i tipici esperimenti di decorso temporale utilizzando cellule coex che esprimono il trasportatore a s CT due e sensori di glutammina fret con affinità di otto millimolari e 100 micromolari. L'afflusso di glutammina viene rilevato come la variazione dei rapporti di intensità della fluorescenza tra quello del donatore mtfp e quello dell'accettore Venere. L'afflusso di glutammina in presenza di alanina è anche dimostrato substrato.
Utilizzando i sensori è possibile esaminare anche le specificità dei trasportatori. Qui, le cellule sono state precaricate con glutammina e quindi vari aminoacidi sono stati aggiunti al perfuso extracellulare. Otto come previsto A ct due substrati hanno indotto glutammina flx, mentre gli amminoacidi non substrato non lo hanno fatto.
L'assenza di variazioni dell'efficienza dei tasti dopo l'aggiunta di un substrato può essere dovuta a diversi motivi, come la bassa capacità di assorbimento del substrato da testare, come mostrato nelle celle che esprimono il sensore da otto millimolari o il sensore da 100 micromolari. Ma ciò non esprime il trasportatore CT due per confermare che la variazione dell'efficienza dei tasti è dovuta al cambiamento effettivo del substrato e non al cambiamento di altri parametri. Lo stesso protocollo di perfusione viene eseguito utilizzando cellule che esprimono un sensore che si prevede sia saturo nella condizione sperimentale.
E in questo esempio, l'affinità del sensore è 1,5 micromolare. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come visualizzare la dinamica dei metaboliti utilizzando i sensori di fret. Non dimenticare che la coltura cellulare deve essere trattata in modo appropriato seguendo le procedure operative standard in modo da ridurre al minimo il rischio di esposizione.
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Panoramica
In questo articolo viene illustrato l'utilizzo della FRET per monitorare la dinamica del glutammato in cellule vive. Vengono discussi il disegno sperimentale, i dettagli tecnici e le considerazioni per le analisi post-sperimentali mediante sensori genetamente codificati per il glutammato.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Neuroscienze
- Biologia cellulare
- Biophysica
Sfondo
- La glutammina è un amminoacido fondamentale coinvolto in diversi processi metabolici.
- Il monitoraggio della dinamica della glutammina può fornire informazioni sul metabolismo cellulare.
- I sensori FRET consentono l'imaging in tempo reale di molecole biologiche.
- I sensori codificati geneticamente permettono una risoluzione subcellulare in cellule vive.
Scopo dello studio
- Acquisire immagini del trasporto di glutammina in cellule vive.
- Utilizzare sensori FRET per monitorare l'attività dei trasportatori.
- Analizzare la dinamica della glutammina a livello di singola cellula.
Metodi Utilizzati
- Trasfettare le cellule con un sensore di glutammina e un trasportatore.
- Impostare un sistema di perfusione per l'acquisizione di immagini in tempo reale.
- Utilizzare un microscopio fluorescente invertito per l'acquisizione delle immagini.
- Analizzare le immagini per visualizzare la dinamica della glutammina.
Risultati principali
- Imaging riuscita del trasporto di glutammina in cellule vive.
- Rilevamento dell'attività dei trasportatori mediante sensori FRET.
- Monitoraggio in tempo reale della dinamica della glutammina ottenuto.
- Informazioni sui processi metabolici cellulari fornite dallo studio.
Conclusioni
- I sensori FRET sono efficaci per il monitoraggio della dinamica del glutammato.
- La metodologia consente un'analisi dettagliata dell'attività dei trasportatori.
- Questo approccio può migliorare la comprensione dei processi metabolici nelle cellule vive.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale Esecutiva
L'imaging in tempo reale del trasporto di metaboliti mediante sensori FRET codificati geneticamente consente un'analisi precisa della cinetica dei trasportatori e della specificità per il substrato a risoluzione di singola cellula. Questo approccio supporta la validazione degli obiettivi fornendo letture quantitative e dinamiche dell'attività dei trasportatori in cellule vive, riducendo l'ambiguità meccanicistica nelle fasi iniziali della scoperta. Il metodo aumenta la fiducia predittiva nell'identificazione dei composti promettenti collegando la funzione del trasportatore agli stati metabolici cellulari rilevanti nei modelli di malattia.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione dell'Obiettivo
- Valore scientifico: Consente l'osservazione diretta dell'attività del trasportatore di glutammina, supportando la validazione funzionale dei trasportatori di soluti come bersagli terapeutici.
- Valore operativo: Fornisce dati in tempo reale con risoluzione subcellulare che chiariscono la cinetica del trasportatore e la specificità del substrato, senza richiedere la lisi cellulare o saggi a punto fisso.
- Valore predittivo: Facilita la riduzione del rischio meccanicistico confermando il flusso mediato dal trasportatore in condizioni definite di substrato, migliorando la fiducia nelle ipotesi di interazione con il bersaglio.
Screening e sviluppo di saggi
- Valore scientifico: Genera variazioni quantitative del rapporto di fluorescenza che fungono da letture affidabili in tempo reale per valutare la funzione dei trasportatori in saggi su cellule vive.
- Valore operativo: Permette un monitoraggio standardizzato e riproducibile dell'attività dei trasportatori in diverse condizioni di perfusione, favorendo la scalabilità del saggio per lo screening di composti.
- Prontezza per lo screening: Consente il rilevamento di profili di flusso e di inibizione specifici per substrato, preparando il sistema per la valutazione degli effetti dei modulatori sull'attività dei trasportatori.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Continuità traslazionale: Supporta l'analisi rilevante per le malattie consentendo l'interrogazione specifica per tipo cellulare del trasporto del glutammato in modelli che esprimono trasportatori pertinenti.
- Allineamento preclinico: Fornisce letture metaboliche dinamiche che possono correlare con esiti fenotipici, sostenendo decisioni di avanzamento con rischio calibrato.
- Approfondimento meccanicistico: Aiuta a distinguere gli effetti specifici del trasportatore dalle alterazioni metaboliche fuori bersaglio, aumentando la fiducia sul bersaglio nella validazione preclinica.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Il metodo si integra nei flussi di lavoro della fase iniziale di scoperta consentendo una valutazione funzionale in tempo reale dei trasportatori dopo l'identificazione del bersaglio, fornendo informazioni per l'ottimizzazione del composto leader attraverso un profilo dinamico dell'attività.
- Biologia della scoperta: Supporta la verifica di ipotesi sulla funzione dei trasportatori visualizzando il flusso del substrato in cellule vive, chiarificando il ruolo biologico nelle vie metaboliche.
- Screening: Fornisce output quantitativi in tempo reale adatti per valutare gli effetti dei composti sulla cinetica e specificità del trasportatore in un formato basato sulla perfusione.
- Analisi: Genera misurazioni fluorimetriche raziometriche che consentono il confronto dell'attività del trasportatore in diverse condizioni, permettendo una selezione dei dati basata sull'evidenza.
- Ricerca traslazionale: Si collega alla continuità preclinica fornendo dati sul flusso di metaboliti in contesti cellulari rilevanti per la malattia, sostenendo studi meccanicistici allineati ai biomarcatori.
- Riutilizzo aziendale: Stabilisce una piattaforma di imaging riutilizzabile per il monitoraggio della dinamica dei trasportatori degli aminoacidi su multipli bersagli e linee cellulari.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Aumenta la fiducia predittiva nella validazione degli obiettivi riducendo l'incertezza riguardo al meccanismo del trasportatore e alla specificità del substrato.
- Valore operativo: Migliora la riproducibilità e la standardizzazione dei saggi sui trasportatori mediante perfusione controllata e imaging in tempo reale.
- Valore strategico: Perfeziona le decisioni di avanzamento o interruzione del progetto fornendo dati funzionali e dinamici che riducono i rischi nella selezione degli obiettivi nelle fasi iniziali del processo.
- Impatto sul portafoglio: Consente una priorizzazione adeguata ai rischi degli obiettivi di trasporto basata su profili di attività quantitativi e validati in cellule vive.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze nel clonaggio molecolare, nell'immagineggiamento di cellule vive e nel rilevamento di segnali basato sul FRET.
- Richiede l'accesso a un microscopio a fluorescenza invertito dotato di set di filtri per l'eccitazione e l'emissione di donatore/accettore e di un sistema di perfusione per lo scambio di soluzioni.
- Necessita della standardizzazione dell'efficienza di trasfezione, dei livelli di espressione del sensore e della sottrazione del fondo tra diversi esperimenti.
- Comporta considerazioni di adattamento per diverse coppie trasportatore-sensore, inclusi l'abbinamento di affinità e la validazione dell'espressione.
- È limitato dall'intervallo dinamico del sensore e da potenziali effetti di saturazione, che devono essere caratterizzati per una quantificazione accurata del flusso.
