Analisi del danno epiteliale Prodotto da Entamoeba histolytica Infezione

L'obiettivo generale di questa procedura è valutare le prime interazioni tra patogeni dell'ospite e il potenziale di invasione della TBA. Histolytica. Per prima cosa preparate i trofozoiti intatti, i trofozoiti, i lisati totali o i trofozoiti secreti. Quindi incubare le cellule epiteliali dell'ospite con concentrazioni appropriate dei diversi trofozoiti.

Ora utilizzando l'immunofluorescenza AM, analizzare le colture epiteliali trattate per selezionare le proteine ABA histolytica che interagiscono con le giunzioni strette delle cellule epiteliali misurano anche le alterazioni della barriera paracellulare da parte della resistenza elettrica transepiteliale. Nel loro insieme, i risultati possono dimostrare il disassemblaggio della giunzione stretta da parte di TBA Histolytica e anche individuare la partecipazione dei complessi selezionati in questo processo. I principali vantaggi di questa tecnica sono l'uso di diversi prodotti del parassita per valutare la traslocazione dei fattori istografici di Eva nell'epitelio ospite, nonché per dimostrare la partecipazione di questi eva.

I suoi fattori sull'apertura della giunzione di intere cellule nei primi tempi dell'infezione. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo dell'ameba ività, come la comprensione delle interazioni molecolari tra epiteliali e parassiti della diva. In generale, gli individui che non conoscono questo metodo avranno difficoltà perché non conoscono la proporzione appropriata dei tempi di incubazione delle due celle per la coincubazione, e anche come ottenere i diversi prodotti ELI e come misurare il TER.

Le implicazioni di questa tecnica si estendono alla nostra terapia degli ami perché questi fattori vir come il complesso E-H-C-P-A-D-H 112 potrebbero essere sfruttati come bersagli in nuove strategie di trattamento. Quattro. Questo metodo in vitro può fornire informazioni sulla partecipazione del fattore virale Anica all'interazione iniziale con il sito ospedaliero. Può anche essere applicato ad altri sistemi come l'inbivo, i modelli di infezione nei topi criceto, nei porcellini d'India e anche nelle biopsie intestinali umane. Cultura.

Le celle MDCK contengono 10 millilitri di mezzi DMEM integrati al 5% di anidride carbonica e 37 gradi Celsius. Cresce autenticamente una volta 10 al quinto trofozoite di vent ameba histolytica in 15 millilitri di TYIS 33, medio a 37 gradi Celsius. Per staccare i trofozoiti, raffreddare il tubo per cinque-10 minuti in un bagno di acqua ghiacciata.

Quindi trasferire la coltura in modo asettico in una provetta conica e centrifugare a 360 volte G per 10 minuti a quattro gradi Celsius. Ora, decantare accuratamente il surnatante. Aggiungere PBS ghiacciato al pellet e capovolgere più volte la provetta per disperdere le cellule dopo la centrifugazione.

Determinare il numero di trofozoiti utilizzando un emocitometro per ligiare, i trofozoiti si congelano in azoto liquido per un minuto, si scongelano a quattro gradi Celsius e vorticano vigorosamente. Ora attiva le proteasi presenti nei lisati con lo 0,02% di beta mercaptoetanolo. Diluire nove volte 10 ai sei trofozoiti in tre millilitri di PBS ghiacciato e trasferire le cellule in una provetta conica da 50 millilitri.

Ora posizionare la sospensione trofo con un angolo orizzontale inclinato di cinque gradi in un'incubatrice a 37 gradi Celsius per due ore per raccogliere i prodotti secreti, centrifugare la provetta a 360 volte G per 10 minuti. Utilizzare una siringa monouso e sterile per raccogliere con cura il surnatante, evitando la contaminazione dei campioni con trofozoiti dal pellet. Quindi, per eliminare le cellule trasferite, passare il surnatante attraverso una membrana di acetato di cellulosa da 0,22 micron.

Ora attiva le proteasi con beta mercaptoetanolo allo 0,02% per la coltura in immunofluorescenza. Le cellule MDCK su coperchio di vetro sterile scivolano all'interno di una piastra di coltura cellulare a 24 pozzetti. Ispezionare le cellule al microscopio invertito fino a raggiungere il 100% di confluenza.

Aggiungete le diverse condizioni dei trofozoiti diluiti in un millilitro di PBS caldo. Includere le condizioni di controllo delle cellule MDCK con PBS e senza e histolytica, così come le cellule MDCK con le diverse condizioni dei trofozoiti, ma che emettono incubazione con anticorpi primari. Posizionare la piastra di coltura nell'incubatrice per due o 30 minuti.

Successivamente, lavare le cellule epiteliali cinque volte con PBS freddo per eliminare le molecole non legate o i trofozoiti. Fissare e permeare le cellule con un millilitro di etanolo al 96% per minuti a meno 20 gradi Celsius in una camera umida. Estrarre con cura i vetrini dai pozzetti.

Rimuovere il liquido in eccesso dal bordo utilizzando carta da filtro e immergere il vetrino coprioggetto con le celle rivolte verso il basso in una soluzione bloccante BSA allo 0,5%. Incubare i campioni per un'ora a temperatura ambiente. Nel frattempo, prepara una miscela di anticorpi primari in PBS.

Sollevare i vetrini coprioggetto dalla soluzione bloccante. Asciugare il liquido in eccesso su carta da filtro. Trasferire le cellule nella soluzione anticorpale e incubare i campioni durante la notte a quattro gradi Celsius.

Lavare le cellule cinque volte con un millilitro di PBS per rimuovere le molecole non legate. Ora prepara una miscela dei due anticorpi secondari fluorescenti nel PBS. Incubare i campioni in anticorpi secondari per un'ora a temperatura ambiente al buio per la colorazione nucleare.

Incubare le cellule per tre minuti con 200 microlitri di soluzione dappy 0,05 millimolare a temperatura ambiente al buio. Ora, analizza i preparati mediante microscopia confocale attraverso sezioni Zack e piani XZ in esperimenti di coincubazione. Utilizzando inibitori della proteasi o un anticorpo specifico, incubare ogni condizione sperimentale per 20 minuti a quattro gradi Celsius con inibitori della proteasi o una coltura di anticorpi monoclonali.

Le cellule MDCK su supporti permeabili sterili transwell nel compartimento superiore, posizionare 100 microlitri di sospensione cellulare e nel compartimento inferiore posizionare 600 microlitri di terreno DMEM integrato. Posizionare i filtri transwell preparati nell'incubatore al microscopio invertito. Verificare che le celle siano confluenti al 100%.

Raccogliere e raccogliere il terreno dal compartimento superiore di ciascun pozzetto in 50 microlitri di questa miscela di fluidi. Aggiungere 50 microlitri di sospensione di trofozoiti o controllo PBS. Trasferire ora le miscele nella camera superiore di ciascun pozzetto contenente le celle MDCK.

Immergere immediatamente i due elettrodi dell'STX in ciascun pozzetto per misurare la resistenza elettrica transepiteliale. Assicurarsi che l'elettrodo più lungo tocchi la parte inferiore della camera inferiore e che l'elettrodo più corto sia coperto dal fluido nello scomparto superiore. Gli E histolytica sono stati coltivati in condizioni di accento e raccolti nella fase di crescita tardo logaritmica e stazionaria precoce.

Qui, il marcatore a giunzione stretta zero uno è stato utilizzato per visualizzare i contatti cellulari delle cellule epiteliali che sono stabilizzate da giunzioni strette e aderenti. L'immunofluorescenza con l'anticorpo monoclonale è stata utilizzata per studiare l'interazione del complesso derivato dall'ameba con l'applicazione sulla superficie epiteliale di trofozoiti, trofozoiti, lisati totali o prodotti secreti al monostrato epiteliale con conseguente colocalizzazione del complesso con giunzione stretta. Dopo 30 minuti, si è sviluppata una colorazione discontinua di ZO one ai bordi cellulari e l'internalizzazione nelle vescicole.

Questa interruzione è stata più evidente nei contatti delle cellule MDCK con trofozoiti e trofozoiti. La microscopia laser confocale a lisati totali ha indicato che il complesso di virulenza penetrava verso lo spazio intercellulare. La co-localizzazione con il contatto interrotto del parassita ze O one colorante, ha interrotto la funzione della barriera epiteliale e ha provocato un calo del 90% della resistenza elettrica transepiteliale.

La pre-incubazione dei trofozoiti con un anticorpo contro il complesso o con inibitori della proteasi ha determinato una protezione contro la goccia di TER assunta. Insieme. Questi dati suggeriscono che sia l'attività proteolitica che le proprietà adesive sono importanti fattori di virulenza di questo complesso durante l'invasione di e histolytica. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come analizzare i meccanismi con cui EMBA histolytica virale nei fattori apre giunzioni strette nei primi momenti di infezione Quando padroneggiare questa analisi del danno epiteliale può essere eseguita in tre ore una volta che i prodotti di lya e le colture cellulari sono pronti.

Durante l'ottenimento di questa procedura, è importante ricordare di attenersi ai tempi di interazione esatti per gli ioni Seguendo questa procedura. Altri metodi, come i saggi di immunoprecipitazione, possono essere eseguiti per rispondere a ulteriori domande, come le possibili associazioni tra enba, fattori di violenza istolitica e proteine epiteliali dopo lo sviluppo. Questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo delle interazioni alside per esplorare la patogenesi dell'AMS nei topi criceto, nei porcellini d'India e nei tessuti umani.