In Situ Rilevamento di Autoreattivi CD4 cellule T nel cervello e nel cuore Utilizzo Maggiore di Istocompatibilità Dextramers classe Complex II

L'obiettivo generale di questa procedura è rilevare le cellule T autororeattive con un elevato grado di specificità utilizzando trimmer di dex di classe II del MHC. In questo video, il cerebrale viene prelevato dal cervello di un topo con encefalomielite autoimmune sperimentale indotta dalla proteina lipidica della mielina. Questo viene ottenuto innanzitutto prelevando con attenzione i tessuti e preparando i blocchi di aros.

Il secondo passaggio consiste nel tagliare il tessuto inclusi in aros in sezioni spesse 200 micrometri utilizzando un viome. Le sezioni vengono quindi trasferite in camere per tessuti all'interno di una piastra a 24 pozzetti, dove vengono colorate e fissate. L'ultimo passaggio prevede il montaggio delle sezioni di tessuto su vetrini microscopici.

In definitiva, la microscopia confocale viene utilizzata per mostrare le cellule legate ai dex trimers e all'anticorpo CD4. Abbiamo concepito questa idea per la prima volta quando abbiamo dimostrato che i dextramer di classe II del MHC erano più sensibili dei tetramer convenzionali di classe II del MHC nel rilevare le cellule T CD4 autoriflessive specifiche per l'antigene. Generalmente, gli individui alle prime armi con questo metodo incontreranno difficoltà, poiché il taglio di tessuti freschi e la loro manipolazione risultano piuttosto complessi.

La dimostrazione visiva di questo metodo è fondamentale poiché le fasi di sezionamento, montaggio e analisi sono difficili da apprendere in quanto complesse. Oltre a Ting, due collaboratori di ricerca postdottorale, Chandy e Aaron del mio gruppo e Christian dal laboratorio della dottoressa Zoe, mostreranno questa procedura. Dopo l'eutanasia di topi con encefalomielite autoimmune sperimentale o EAE, rimuovere il cranio tagliando la calotta cranica in modo circolare utilizzando un paio di forbici curve e sollevare con cura le ossa craniche con pinze. Prelevare il cervello mediante dissezione tronca utilizzando un bisturi pulito.

Separare il rerum dal cervelletto. Posizionare il rerum in un tubo contenente soluzione salina fosfato fredda 1x o PBS e lasciare il tubo sul ghiaccio fino all'elaborazione. Posizionare il rerum in una cassetta istologica monouso con base profonda mantenuta sul ghiaccio.

Quindi versare nell'apposito cassetto dell'agarosio a basso punto di fusione tamponato con PBS al 4% fuso. Premere immediatamente con delicatezza il cervello mediante pinzette per immergere completamente il tessuto e lasciare il cassetto sul ghiaccio fino al termine della solidificazione. Una volta solidificato, rimuovere l'agarosio in eccesso da tutti i lati del tessuto inclusi ed esporre leggermente la superficie ventrale del cervello.

Successivamente, spalmare il blocco di tessuto Vibram con colla istantanea e trasferire il tessuto contenente gli aros sulla superficie incollata, posizionando la superficie ventrale esposta del cervello sulla colla per il sezionamento trasversale. Non spostare il tessuto una volta posizionato sul blocco. Posizionare il blocco del vibratome contenente il tessuto con gli aros su ghiaccio e lasciare asciugare la colla per 15 minuti.

Nel frattempo, posizionare le camere per tessuti preparate in una piastra a 24 pozzetti, mettendo una camera per pozzetto. Riempire i pozzetti contenenti le camere per tessuti con un millilitro di PBS 1X freddo e lasciare la piastra sul ghiaccio. Una volta che la colla è asciutta, abbassare la lama del vibram al livello della superficie superiore del tessuto.

Impostare la velocità del Vibram a 0,22 millimetri al secondo e iniziare il sezionamento con un movimento in avanti per ottenere sezioni spesse 200 micrometri. Utilizzando un pennello morbido per acquerello, trasferire una sezione cerebrale in ogni camera del tessuto. Nella piastra a 24 pozzetti, mantenere la piastra sul ghiaccio fino al completamento del sezionamento per prevenire il degrado del tessuto.

Successivamente, preparare una seconda piastra a 24 pozzetti aggiungendo 300 microlitri di un cocktail contenente IA di S myelin protio lipid protein 1 39 a 1 51 dextro e anticorpo CD four a tre dei pozzetti. Quindi aggiungere 300 microlitri del cocktail di controllo IA di S Tyler's murine encephalomyelitis virus 70 a 86 dextro e anticorpo CD four a un altro gruppo di tre pozzetti. Procedere quindi ad etichettare i pozzetti.

Quindi trasferire tre camere per tessuti contenenti le sezioni destinate alla colorazione con specifici dex trimmers nei tre pozzetti designati della piastra a 24 pozzetti, mettendo una camera per pozzetto. Analogamente, trasferire le tre camere per tessuti contenenti le sezioni destinate alla colorazione con dex streamers controllati in tali pozzetti. Coprire i pozzetti, uno per camera, con il coperchio.

Avvolgere la piastra con della carta d'alluminio e posizionarla su una piattaforma oscillante impostata su rotazione delicata per 1,5 ore al buio a temperatura ambiente. Al termine del periodo di incubazione, lavare le sezioni di tessuto trasferendole in una nuova pozzetta contenente un millilitro di soluzione di lavaggio PBS 1X fredda per almeno 10 minuti sulla piattaforma oscillante. Ripetere il lavaggio per tre volte.

Assicurarsi che le sezioni di tessuto non si secchino, poiché potrebbero aderire ai lati della camera. Fissare le sezioni trasferendo le camere di tessuto in una nuova pozzetta. Della piastra a 24 pozzette, contenente un millilitro di paraformaldeide al 4% in PBS filtrato, e incubare su una piattaforma oscillante per due ore con movimenti delicati di rotazione.

Dopo aver lavato le sezioni ulteriormente per tre volte, posizionare le sezioni colorate e fissate su un vetrino microscopico pulito. Utilizzando un pennello morbido per acquerello, rimuovere l'acqua in eccesso senza toccare la sezione e montare la sezione utilizzando un mezzo di montaggio. Coprire con una lamella microscopica e lasciare asciugare i vetrini a temperatura ambiente durante la notte.

Nella stanza oscura, utilizzare un microscopio confocale Nikon A one Eclipse 90 I per la scansione e l'acquisizione routinarie delle immagini. Per iniziare, aprire il software NIS elements AR e selezionare i canali tetraethyl, rumine, isothiocyanate o trit C e cyan cinque o SCI cinque dal pannello. Le lunghezze d'onda di eccitazione ed emissione per i canali Trit sea e sci-fi vengono visualizzate per impostazione predefinita.

Assegnare il colore falso verde per il canale Trit Sea e rosso per il canale SCI cinque. Posizionare il vetrino da esaminare sul palchetto del microscopio e mettere a fuoco manualmente con un ingrandimento di 100 volte. Impostare l'HV su 10 e l'offset su zero; fare clic su fuoco e regolare la tensione.

Per ottimizzare i laser, eseguire una scansione con messa a fuoco dall'alto verso il basso e impostare il livello Z per l'acquisizione delle immagini. Quindi fare clic su CH series ed acquisire l'immagine in modo sequenziale. Identificare le cellule T destro o positive per CD4 positive che appaiono come cellule puntiformi gialle in base alla colocalizzazione dei segnali generati dai canali rosso e verde.

Utilizzare un microscopio confocale Olympus FV 500 BX 60 per un'agevole enumerazione quantitativa dei linfociti T dextro o positivi per CD4. Per iniziare, aprire il software Fluovu. Selezionare i coloranti SSI3 e SCI5 dal menu a tendina e fare clic su Applica per caricare i rispettivi laser.

Posizionare il vetrino da esaminare sul tavolino del microscopio e metterlo a fuoco manualmente con ingrandimento basso facendo clic su fuoco mentre il laser SI tre è acceso e mettere a fuoco il focolaio infiammatorio. Cambiare l'obiettivo a un ingrandimento di 100 volte. Impostare la dimensione del file su cinque 12 su cinque 12 nel menu a tendina, fare clic su fuoco e regolare i valori di guadagno e offset del PMT per ottimizzare separatamente il laser per S SI tre e sci cinque, fare clic su Z stage quindi fare clic su fuoco mentre entrambi i laser sono accesi.

Impostare lo spessore dello stadio Z cliccando sulle frecce su e giù. Impostare l'intervallo Z a due micrometri. Cliccare su stop e scegliere.

Cercare 1, 2, 3. Quindi fare clic su X, y, Z e iniziare ad acquisire immagini in serie Z per l'area selezionata all'interno del focolaio infiammatorio; salvare le immagini seriali Z come file VI. Per salvare i file immagine, selezionare l'immagine dalla serie Z e quindi salvarla in formato TIFF.

Salvare sempre le immagini TIFF multicanale. Innanzitutto per proteggere i dati, il passo successivo consiste nell'esaminare tre sezioni accoppiate colorate con entrambi i set di dex trimmer. Inizialmente, acquisire le immagini seriali in Z scansionando i vetrini con un movimento orizzontale verticale verso l'alto e poi orizzontale verticale verso il basso, in modo da evitare la ripetizione di serie in Z all'interno dello stesso fuoco.

Dopo aver acquisito le immagini Z seriali, assegnare loro un nome identificando i numeri delle slide, il nome delle sezioni e il numero delle immagini Z seriali ottenute. Utilizzare il software ImageJ per contare le cellule T CD4 positive dextro in rapporto al numero totale di cellule T CD4 positive. Selezionare il tipo di contatore in ImageJ, spuntare "mostra tutto" ed iniziare il conteggio cliccando al centro di ogni cellula, continuando poi il conteggio su diverse immagini Z seriali mediante le frecce laterali.

Dopo aver contato tutti i linfociti T CD4, scegliere un altro tipo di contatore e contare i linfociti T CD4 positivi per la dextra positiva. Fare clic sulla scheda risultati per ottenere il numero totale di cellule contate con i due contatori diversi. Il rilevamento dei linfociti T CD4 specifici per la proteina proteolipidica della mielina o PLP è stato eseguito utilizzando sezioni cerebrali appena tagliate ottenute da topi con EAE e colorate con miscele contenenti anti-CD4 e dextra PLP 1-39 a 1-51 o dextra di controllo TMEV 70-86 mediante microscopia a scansione laser (LSCM).

L’analisi di sezioni cerebrali colorate in doppio evidenzia le cellule positive per i trimeri PLP 1 39 a 1 51 in rosso e le cellule positive per l’anticorpo CD4 in verde, mentre le cellule doppiamente positive appaiono in giallo. Le cellule colorate in doppio mostravano puntini punctiformi disposti lungo la periferia. Tale caratteristica era assente nelle sezioni colorate con il controllo TMEV 70 a 86.

È stata inoltre effettuata la rilevazione di cellule T CD4 specifiche per la miosina cardiaca mediante colorazione in situ con la catena pesante alfa della miosina cardiaca 334-352 Dexters. L'analisi di queste immagini mediante microscopia a scansione laser (LSCM) ha mostrato la presenza di cellule positive ai Dexters per MYHC 334-352 in rosso, cellule positive per CD4 in verde e cellule legate sia ai Dexters che a CD4 come cellule puntiformi gialle. La colorazione di fondo per i Dexters controllo con RNA 43-56 è risultata trascurabile. Una volta acquisita padronanza della tecnica, essa può essere eseguita in circa otto-dieci ore, a differenza dei tre giorni richiesti da altri protocolli pubblicati, se effettuata correttamente.

Nel tentativo di eseguire questo protocollo, è importante ricordare di preparare i reagenti in anticipo e seguire i passaggi in modo sistematico. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come sezionare e colorare i tessuti per l'analisi e il conteggio delle cellule T CD4 positive alla proteina C-reattiva negli organi bersaglio.