Isolamento rapida e purificazione di mitocondri per il trapianto da tessuto Dissociazione e Filtrazione Differenziale

L'obiettivo generale di questa procedura è isolare rapidamente i mitocondri puri e competenti per la respirazione dal tessuto di ratto. Ciò si ottiene associando e omogeneizzando prima i campioni di tessuto. I prossimi passi consistono nel mescolare la subina A nell'omogeneizzato e incubarla su ghiaccio.

Segue il filtraggio dell'omogeneizzato che si mescola in BSA e il filtraggio di nuovo. I passaggi finali consistono nella centrifugazione del filtrato e nella risospensione dei pellet mitocondriali nel tampone respiratorio. In definitiva, i risultati possono mostrare che i mitocondri isolati sono vitali e che la respirazione è competente attraverso l'analisi della respirazione e un test di luminescenza A TP.

Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti che riportano tempi di isolamento mitocondriale che vanno da 60 a cento minuti, è che i mitocondri vitali e competenti per la respirazione possono essere isolati in meno di 30 minuti. Allison Mackay, un tecnico di un laboratorio collaboratore dimostrerà il test di luminescenza A TP poco prima di iniziare. Sciogliere la subina A in un millilitro di tampone omogeneizzante e sciogliere anche il BSA in un millilitro di tampone omogeneizzante.

Ora inizia con la raccolta di due campioni di tessuto fresco utilizzando un punzone per biopsia da sei millimetri e conservali in un XPBS su ghiaccio in una provetta da centrifuga da 50 litri. Quando è pronto, trasferire il tessuto in una provetta C di dissociazione contenente cinque millilitri di tampone omogeneizzante ghiacciato. Quindi omogeneizzare il tessuto inserendo la provetta nella dissociazione tissutale e selezionando il ciclo di isolamento mitocondriale preimpostato.

Al termine, rimettere il tubo sul ghiaccio e aggiungere 250 microlitri di sub per liare una soluzione madre. Mescola questo per inversione. Quando la miscela appare uniformemente distribuita, incubare l'omogeneizzato su ghiaccio per 10 minuti.

Quindi, metti un filtro a maglie da 40 micron su una provetta da centrifuga conica da 50 millilitri e impacchettalo nel ghiaccio. Inumidire il filtro con un tampone omogeneizzante e gettare il tampone in un contenitore per rifiuti. Quindi, una volta che tutto è pronto, versare l'omogeneizzato nel filtrato.

Aggiungere 250 microlitri di soluzione madre BSA e mescolare per inversione. Tuttavia, questo passaggio dovrebbe essere saltato per l'analisi delle proteine mitocondriali. Ora preparatene altri due.

provette da centrifuga coniche da 50 millilitri su ghiaccio si adattano a una con un filtro da 40 micron e l'altra a un filtro da 10 micron. Bagnare entrambi i filtri con un po' di tampone omogeneizzante e scartare questo tampone. Quindi versare l'omogeneizzato prima attraverso il filtro da 40 micron e poi attraverso il filtro da 10 micron.

Queste fasi di filtrazione migliorano significativamente la purezza dei mitocondri. Ora dividi il filtrato tra due provette micro fuge pre-raffreddate da 1,5 millilitri e centrifugale a 9.000 g per 10 minuti a quattro gradi Celsius. Quindi rimuovere il surnatante e risospendere e unire i due pellet mitocondriali purificati.

In un millilitro di tampone per la respirazione ghiacciato, è fondamentale che l'intera procedura venga eseguita a quattro gradi Celsius. I mitocondri purificati possono ora essere testati per determinare l'attività metabolica dei mitocondri isolati. Un test di luminescenza A TP può essere eseguito utilizzando un kit di saggi A TP.

Per prima cosa, portare i reagenti del kit a temperatura ambiente. Successivamente, preparare la soluzione madre HT P e metterla sul ghiaccio. Il passo successivo consiste nell'aggiungere cinque millilitri di tampone di substrato alla soluzione di substrato liofilizzato.

Mescolate delicatamente e mettete al buio. Quindi aggiungere 100 microlitri di tampone respiratorio a ciascun pozzetto di una piastra a 96 pozzetti di colore nero opaco. Aggiungere 10 microlitri dei mitocondri preparati a pozzetti al di sotto degli standard A TP.

Ogni campione mitocondriale unico deve essere placcato in una piastra triplicata a tre pozzetti di tampone respiratorio da solo come controllo negativo. Continuare aggiungendo 50 microlitri di soluzione di lisi cellulare di mammifero ad ogni pozzetto una volta caricato. Incubare la piastra a 37 gradi Celsius per cinque minuti su un agitatore orbitale a 120 giri/min.

Durante l'incubazione, preparare diluizioni dello standard A TP che vanno da un 10° millimolare a un 10° micromolare. Dopo l'incubazione, aggiungere 10 microlitri di ciascuno degli standard A TP ai pozzetti corrispondenti indicati sulla mappa delle piastre. Quindi, aggiungere 50 microlitri della soluzione di substrato ricostituito a ciascuno.

Bene, quindi incubare nuovamente la piastra, come prima per cinque minuti. Procedere esaminando le piastre al lettore di targhe. Apri il software sotto.

Creare un nuovo elemento. Fare clic su esperimento. Quindi fare clic sul protocollo predefinito e fare clic su OK.

Nella colonna di sinistra, seleziona protocollo. Quindi procedura Successivamente, selezionare il ritardo e impostarlo su 10 minuti. Allora va bene, l'ingresso.

Ora seleziona, leggi e scegli la luminescenza dal menu a discesa. Regolare le altre impostazioni come segue. Tempo di integrazione dell'endpoint di tipo letto.

Un secondo. Il filtro imposta una posizione dell'ottica del foro di emissione, sensibilità massima 100, offset verticale sonda superiore di un millimetro. Dopo aver apportato queste modifiche alle impostazioni, fare clic su OK.

Fare clic sul layout della piastra e impostarlo di conseguenza. Fare clic su OK. Ora con tutto pronto, fai clic sull'icona della piastra di lettura nella riga superiore e fai clic su Leggi.

Quando lo spettrofotometro si apre, posizionare la piastra nella teglia con il pozzetto A nell'angolo in alto a sinistra. Ora si aprirà una casella che mostra la temperatura, fare clic su ok, quindi procedere con l'analisi dei dati. I campioni di muscolo scheletrico del peso di circa 0,18 grammi umidi hanno prodotto circa 24 miliardi di mitocondri in base al conteggio delle dimensioni delle particelle.

I campioni di fegato della stessa dimensione hanno dato qualche miliardo in più. Le letture dell'emocitometro dei mitocondri sono state sottostimate utilizzando il contatore di particelle. È stato ottenuto un tracciato rappresentativo, che mostra che i mitocondri isolati sono localizzati sotto un picco con un diametro medio di circa quattro decimi di micron.

Ciò è in accordo con i precedenti rapporti che utilizzano il test del biacido. La proteina mitocondriale è stata misurata a pochi milligrammi per grammo di tessuto dal muscolo scheletrico e dal fegato. Il prodotto era vitale e la respirazione competente.

Mitocondri isolati in un lasso di tempo compatibile per l'intervento terapeutico clinico e chirurgico. Le micrografie elettroniche a trasmissione hanno indicato che i mitocondri isolati erano tutti ammaccature di elettroni con danni inferiori a uno su 10.000, la contaminazione era inferiore a uno su centomila A TP dosaggio. I risultati hanno rivelato che i mitocondri erano vitali e che un contenuto di TP era di circa 11 o 15 nanomoli per milligrammo di proteina mitocondriale.

L'analisi della respirazione mitocondriale è stata condotta utilizzando un elettrodo di tipo Clark e ha rivelato che il consumo di ossigeno era di circa 180 MLE di ossigeno al minuto. Per ogni milligrammo di proteina mitocondriale, mentre i valori RCI erano ciascuno intorno a 2,5 con un punteggio epatico leggermente più alto. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in meno di 30 minuti se eseguita correttamente.