Isolamento rapida e purificazione di mitocondri per il trapianto da tessuto Dissociazione e Filtrazione Differenziale
6 settembre 2014
Un metodo rapido isolamento dei mitocondri da biopsie di tessuto mammiferi è descritto. Fegato di ratto o preparazioni muscolari scheletriche sono stati omogeneizzati con un dissociatore tessuto commerciale e mitocondri sono stati isolati per filtrazione differenziale attraverso filtri a rete di nylon. Tempo di isolamento mitocondriale è <30 min rispetto ai 60 - 100 min con metodi alternativi.
L'obiettivo generale di questa procedura è isolare rapidamente mitocondri puri e funzionali nella respirazione da tessuto di ratto. Questo viene ottenuto innanzitutto associando e omogeneizzando i campioni di tessuto. I passaggi successivi consistono nell'aggiungere la subin A all'omogenato e incubare il tutto sul ghiaccio.
Successivamente, si filtra l'omogenato, lo si mescola con BSA e si filtra nuovamente. I passaggi finali consistono nel centrifugare il filtrato e risospendere i pellet mitocondriali nel buffer per la respirazione. Alla fine, i risultati possono dimostrare che i mitocondri isolati sono vitali e capaci di respirazione mediante analisi della respirazione e un saggio di luminescenza dell'ATP.
Il principale vantaggio di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti, che riportano tempi di isolamento mitocondriale compresi tra 60 e cento minuti, è che mitocondri vitali e capaci di respirazione possono essere isolati in meno di 30 minuti. Allison Mackay, una tecnica di un laboratorio collaboratore, mostrerà l'assay di luminescenza dell'ATP poco prima dell'inizio. Sciogliere la subin A in un millilitro di buffer di omogeneizzazione e sciogliere anche l'albumina sierica bovina (BSA) in un millilitro di buffer di omogeneizzazione.
Ora inizi a raccogliere due campioni di tessuto fresco utilizzando un punch per biopsia di sei millimetri e conservarli in un XPBS su ghiaccio in un tubo da centrifuga da 50 litri. Quando pronto, trasferisca il tessuto in un tubo C per dissociazione contenente cinque millilitri di buffer di omogeneizzazione freddo. Quindi omogeneizzi il tessuto inserendo il tubo nell'apparecchio per dissociazione del tessuto e selezionando il ciclo preimpostato per l'isolamento dei mitocondri.
Una volta terminato, rimettere il tubo sul ghiaccio e aggiungere 250 microlitri di sub alla soluzione stock di lyin. Mescolare capovolgendo il tubo. Quando la miscela appare uniformemente distribuita, incubare l'omogenato sul ghiaccio per 10 minuti.
Successivamente, posizionare un filtro in maglia da 40 micron su un tubo conico da centrifuga da 50 millilitri e inserire il tubo nel ghiaccio. Inumidire il filtro con il buffer di omogeneizzazione e scartare il buffer in un contenitore per rifiuti. Quando tutto è pronto, versare l'omogenato attraverso il filtro per ottenere il filtrato.
Aggiungere 250 microlitri di soluzione madre di BSA e mescolare per inversione. Tuttavia, questo passaggio deve essere saltato per l'analisi delle proteine mitocondriali. Prepararne ora altre due.
Posizionare su ghiaccio due provette coniche da 50 millilitri, dotandone una con un filtro da 40 micron e l'altra con un filtro da 10 micron. Inumidire entrambi i filtri con un po' di buffer di omogeneizzazione e scartare questo buffer. Versare quindi l'omogenato prima attraverso il filtro da 40 micron e successivamente attraverso quello da 10 micron.
Questi passaggi di filtrazione migliorano notevolmente la purezza dei mitocondri. Dividere ora il filtrato tra due provette microcentrifuga da 1,5 millilitro precedentemente raffreddate e centrifugare a 9.000 ×g per 10 minuti a quattro gradi Celsius. Rimuovere quindi il soprannatante e risospendere e combinare i due pellet mitocondriali purificati.
In un millilitro di tampone per la respirazione ghiacciato, è fondamentale che l'intera procedura venga eseguita a quattro gradi Celsius. I mitocondri purificati possono ora essere analizzati per determinare l'attività metabolica dei mitocondri isolati. È possibile eseguire un saggio luminometrico dell'ATP utilizzando un kit per il saggio dell'ATP.
Per prima cosa, portare i reagenti del kit a temperatura ambiente. Successivamente, preparare la soluzione madre HT P e metterla sul ghiaccio. Il passaggio successivo consiste nell'aggiungere cinque millilitri di tampone substrato alla soluzione substrato liofilizzata.
Mescolare delicatamente e porre al buio. Quindi aggiungere 100 microlitri di tampone per la respirazione in ciascun pozzetto di una piastra a 96 pozzetti opaca nera. Aggiungere 10 microlitri di mitocondri preparati nei pozzetti al di sotto degli standard di ATP.
Ogni campione mitocondriale unico deve essere distribuito in triplice replicato, piastrando tre pozzetti contenenti solo tampone per la respirazione come controllo negativo. Procedere aggiungendo 50 microlitri di soluzione per la lisi di cellule di mammifero in ogni pozzetto una volta caricato. Incubare la piastra a 37 gradi Celsius per cinque minuti su un agitatore orbitale a 120 giri al minuto.
Durante l'incubazione, preparare diluizioni del campione standard di ATP che vanno da un decimo di millimolare a un decimo di micromolare. Al termine dell'incubazione, aggiungere 10 microlitri di ciascuno degli standard di ATP nei pozzetti corrispondenti indicati sulla mappa della piastra. Successivamente, aggiungere 50 microlitri della soluzione del substrato ricostituita in ciascun pozzetto.
Quindi incubare nuovamente la piastra, come in precedenza per cinque minuti. Procedere esaminando le piastre con il lettore di piastre. Aprire il software seguente.
Crea un nuovo elemento. Fai clic su esperimento. Quindi fai clic sul protocollo predefinito e clicca su ok.
Nella colonna di sinistra, selezionare il protocollo. Quindi procedura Avanti, selezionare ritardo e impostarlo su 10 minuti. Quindi ok, la voce.
Ora selezionare, leggere e scegliere luminescenza dal menu a tendina. Regolare le altre impostazioni come segue. Tipo di lettura: integrazione in punto finale.
Un secondo. Impostare la posizione delle ottiche del foro di emissione su uno, sensibilità massima 100, offset verticale della sonda superiore di un millimetro. Dopo aver apportato queste modifiche alle impostazioni, fare clic su ok.
Fare clic sul layout della piastra e configurarlo di conseguenza. Fare clic su OK. Ora che tutto è impostato, fare clic sull'icona di lettura della piastra nella riga superiore e quindi su leggi.
Quando si apre lo spettrofotometro, posizionare la piastra nel vassoio con il pozzetto A1 nell'angolo superiore sinistro. A questo punto si aprirà una finestra che mostra la temperatura; fare clic su OK, quindi procedere con l'analisi dei dati. Campioni di muscolo scheletrico del peso di circa 0,18 grammi al peso fresco hanno prodotto circa 24 miliardi di mitocondri, in base al conteggio delle particelle per dimensione.
Campioni di fegato delle stesse dimensioni hanno fornito alcuni miliardi in più. Le letture del citometro ematico per i mitocondri sono state sottostimate utilizzando il contatore di particelle. È stata ottenuta una traccia rappresentativa, che mostra come i mitocondri isolati siano localizzati sotto un unico picco con un diametro medio di circa quattro decimi di micron.
Questo è in accordo con precedenti rapporti che utilizzano il saggio con l'acido biacido. La proteina mitocondriale è stata misurata in pochi milligrammi per grammo di tessuto proveniente da muscolo scheletrico e fegato. Il prodotto era vitale e in grado di respirare.
Mitochondri isolati in un arco temporale compatibile con interventi terapeutici clinici e chirurgici. Le microfotografie al microscopio elettronico a trasmissione hanno indicato che i mitocondri isolati erano tutti densi agli elettroni, con danni inferiori a uno su 10.000 e contaminazione inferiore a uno su centomila in un saggio dell'ATP. I risultati hanno rivelato che i mitocondri erano vitali e che il contenuto di ATP era di circa 11-15 nanomoli per milligrammo di proteina mitocondriale.
L'analisi della respirazione mitocondriale è stata condotta utilizzando un elettrodo di tipo Clark e ha rivelato che il consumo di ossigeno era di circa 180 MLEs di ossigeno al minuto per ogni milligrammo di proteina mitocondriale, mentre i valori di RCI erano ciascuno intorno a 2,5, con un punteggio leggermente più alto per il fegato. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in meno di 30 minuti se effettuata correttamente.
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Panoramica
Questo articolo descrive un metodo rapido per isolare mitocondri puri e dotati di attività respiratoria da biopsie di tessuto di ratto. La procedura riduce in modo significativo il tempo di isolamento a meno di 30 minuti rispetto ai metodi tradizionali.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Neuroscienze
- Biologia cellulare
- Ricerca mitocondriale
Sfondo
- Le mitocondri sono essenziali per la respirazione cellulare e la produzione di energia.
- I metodi tradizionali di isolamento mitocondriale possono richiedere molto tempo.
- Le tecniche di isolamento rapido possono migliorare l'efficienza sperimentale.
- I mitocondri vitali sono fondamentali per studi metabolici accurati.
Scopo dello studio
- Sviluppare un metodo più rapido per isolare i mitocondri da tessuti di mammiferi.
- Garantire che i mitocondri isolati siano puri e funzionalmente competenti.
- Facilitare analisi successive della respirazione e saggi dell'ATP.
Metodi Utilizzati
- Omogeneizzazione di campioni di fegato di ratto o di muscolo scheletrico.
- Utilizzo di un dissociazione tissutale commerciale per una miscelazione efficiente.
- Filtrazione sequenziale attraverso filtri in rete di nylon.
- Risospensione dei pellet mitocondriali nel buffer per la respirazione.
Risultati principali
- Tempo di isolamento ridotto a meno di 30 minuti.
- I mitocondri isolati hanno dimostrato vitalità e capacità respiratoria.
- I risultati sono stati convalidati mediante analisi della respirazione e saggi di luminescenza dell'ATP.
- Il metodo mostra potenzialità per applicazioni più ampie nella ricerca metabolica.
Conclusioni
- Il metodo di isolamento rapido è efficace per ottenere mitocondri funzionali.
- Questa tecnica può semplificare i processi di ricerca negli studi sui mitocondri.
- Studi futuri potrebbero esplorarne l'applicazione in diversi tessuti mammiferi.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
L'isolamento rapido dei mitocondri in meno di 30 minuti consente una valutazione tempestiva della funzionalità per studi metabolici preclinici e screening terapeutici. Questo metodo supporta la validazione degli obiettivi fornendo mitocondri funzionali per la respirazione ottenuti da biopsie tissutali, riducendo la variabilità biologica nelle fasi iniziali della scoperta. Il protocollo standardizzato di dissociazione e filtrazione del tessuto migliora la riproducibilità tra laboratori, facilitando la generazione di dati coerenti per decisioni di avanzamento o interruzione nei programmi mirati ai mitocondri.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Target
- Valore scientifico: Consente l'analisi della funzione mitocondriale come bersaglio terapeutico nei modelli di malattie metaboliche.
- Valore operativo: Sostituisce l'omogeneizzazione manuale con una dissociazione dei tessuti standardizzata per una preparazione uniforme dei campioni.
- Valore predittivo: Produce mitocondri vitali per saggi di respirazione e di ATP, supportando la riduzione meccanicistica del rischio dei composti principali.
Sviluppo di Screening e Saggi
- Valore scientifico: Fornisce mitocondri purificati adatti per saggi ad alto contenuto di respirazione e basati sulla luminescenza.
- Valore operativo: Elimina i ripetuti passaggi di centrifugazione mediante filtrazione differenziale, aumentando la produttività.
- Prontezza per il saggio: Consente rese mitocondriali costanti (~2x10^10 per 0,18 g di tessuto) per schermature affidabili di composti.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Valore scientifico: Mantiene l'integrità mitocondriale e la competenza respiratoria, fondamentali per i test di efficacia preclinica.
- Valore operativo: Compatibile con i tempi clinici, permettendo l'isolamento entro le finestre temporali dell'intervento chirurgico.
- Continuità traslazionale: Favorisce l'allineamento dei biomarcatori tramite misurazioni del contenuto di ATP e del consumo di ossigeno.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Questo metodo si inserisce nel percorso di scoperta che va dalla validazione iniziale della proteina bersaglio alla valutazione mitocondriale preclinica, offrendo un passaggio rapido e riproducibile da effettuare prima dello screening dei composti o degli studi sull'efficacia.
- Biologia della scoperta: Supporta la verifica di ipotesi riguardo al malfunzionamento mitocondriale nei modelli di malattia mediante letture funzionali.
- Screening: Permette la preparazione di mitocondri pronti per saggi, con maggiore purezza grazie a una filtrazione sequenziale mediante filtri da 40µm e 10µm.
- Analisi: Produce risultati quantitativi per l’analisi della respirazione (consumo di ossigeno) e della luminescenza dell’ATP, facilitando il confronto tra condizioni diverse.
- Ricerca traslazionale: Si collega alla validazione preclinica attraverso mitocondri dotati di capacità respiratoria, adatti a test ex vivo.
- Riutilizzo aziendale: Un protocollo standardizzato che utilizza un dissociatore tessutale commerciale consente l’adozione incrociata tra laboratori e l’integrazione nei flussi di lavoro.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Affidabilità predittiva nell'interazione con i mitocondri grazie a saggi validati di respirazione e di ATP.
- Valore operativo: Tempi ridotti di isolamento (<30 min) ed eliminazione dei passaggi di centrifugazione in gradiente aumentano l'efficienza del laboratorio.
- Valore strategico: Consente un'iterazione più rapida nell'identificazione dei composti promettenti fornendo dati tempestivi sulla funzionalità mitocondriale.
- Impatto sul portafoglio: Favorisce la priorizzazione basata sulla riduzione del rischio eliminando i falsi positivi nei test di screening mirati ai mitocondri.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze nella manipolazione dei tessuti e nelle tecniche di saggio mitocondriale.
- È subordinato all'accesso a un dissociatore tessutale commerciale dotato di ciclo preimpostato per l'isolamento dei mitocondri.
- Necessita di filtri sterili in nylon a maglia (40µm e 10µm) e di centrifugazione a temperatura controllata (4°C, 9.000 x g).
- La standardizzazione tra diversi tipi di tessuto (ad esempio, muscolo scheletrico, fegato) potrebbe richiedere l'ottimizzazione dei parametri di dissociazione.
- Limite pratico: il metodo è stato convalidato su tessuti di ratto; l'estrapolazione a tessuti umani o di altri mammiferi richiede ulteriore validazione.
