In Vivo inseguimento 4-dimensionale di emopoietiche staminali e progenitrici celle di topo adulto cranica di Midollo Osseo

L'obiettivo generale di questa procedura è ottenere stack 3D ad alta risoluzione contenenti cellule staminali ematopoietiche e cellule progenitrici, e monitorarle nel tempo mediante imaging a lapse multipunto. Questo viene ottenuto etichettando innanzitutto le cellule staminali ematopoietiche e le cellule progenitrici, o HSC, con un colorante lipofilico. Le HSC vengono quindi iniettate in un topo ricevente.

Il topo viene preparato per la microscopia utilizzando un supporto personalizzato per la testa e un portacampioni per garantire un posizionamento stabile dell'animale. Successivamente, si ottengono serie ad alta risoluzione dei nicchi delle cellule staminali ematopoietiche e delle cellule progenitrici, e viene effettuata un'acquisizione temporale in più localizzazioni del midollo osseo contenenti HS PC; infine, la microscopia confocale intravitale e a due fotoni viene utilizzata per mostrare la localizzazione e il movimento delle HSC nello spazio midollare. Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti, come l'immunofluorescenza su sezioni di midollo osseo, è che siamo in grado di acquisire informazioni su una scala quadridimensionale, ovvero tre dimensioni più il tempo.

Le implicazioni di questa tecnica si estendono alla terapia delle malattie ematologiche poiché contribuiscono a comprendere dove indirizzare le cellule staminali ematopoietiche all'interno del midollo osseo per garantirne il corretto funzionamento. Abbiamo avuto per la prima volta questa idea per il metodo quando abbiamo realizzato quanto fosse fondamentale poter seguire nel tempo le cellule staminali ematopoietiche. Questo metodo ci aiuta a rispondere a tutte le domande nel campo della nicchia delle cellule staminali, in cui desideriamo sapere dove risiedono le cellule staminali e come si comportano nel tempo.

Per iniziare, raccogliere le cellule staminali ematopoietiche e le cellule progenitrici come dimostrato da questo laboratorio in un precedente video di JoVE e citato nel protocollo testuale. Successivamente, aggiungere il colorante lipofilico DID alla sospensione cellulare a una concentrazione finale di cinque micromolar. Vortexare immediatamente la sospensione per assicurare che il colorante non precipiti dalla soluzione e non etichetti in modo inefficace le cellule.

Incubare le cellule per 10 minuti a 37 gradi Celsius per lavare le cellule. Prima centrifugare a 500 ×g per cinque minuti e decantare il liquido. Quindi risospendere le cellule in 200 µL di PBS e raccoglierle in una siringa per insulina.

Si raccomanda una siringa per insulina piuttosto che una siringa convenzionale perché non presenta spazio morto nell'ago. Ciò consente la somministrazione dell'intera sospensione cellulare al topo per iniettare cellule in un topo irradiato letalmente tramite iniezione nella vena della coda. Posizionare innanzitutto il topo in una camera calda.

Una volta che la vena della coda appare vasodilatata, posizionare il topo nel contenitore di fissaggio. Inserire con attenzione l'ago nella vena della coda. Iniettare le cellule nella vena.

Non si deve incontrare alcuna resistenza durante l'iniezione. Lasciare il topo durante la notte. Per consentire alle cellule di migrare negli spazi del midollo osseo, anestetizzare il topo e monitorare l'insorgenza dell'anestesia profonda mediante il riflesso palpebrale.

Passare un batuffolo di cotone imbevuto di etanolo al 70% sulla parte superiore del cuoio capelluto. Fare attenzione a non far entrare alcun etanolo negli occhi del topo. Per esporre l'area del cranio da immaginare, praticare un piccolo taglio nella parte posteriore della testa tra le orecchie sollevando la pelle con la pinzetta mentre si tiene la pelle sollevata.

Fare scivolare le forbici sotto la pelle e tagliare delicatamente lungo il bordo esterno della zona da immagine. Pulire l'osso esposto con un bastoncino sterile inumidito con PBS sterile per mantenere l'osso umido. Questo evita un'eccessiva disidratazione e la formazione di cicatrici, che potrebbero compromettere la qualità dell'immagine.

Successivamente, mescolare una quantità adeguata di cemento dentale in una barchetta di cera fino a ottenere una pasta. Applicarla rapidamente sulla superficie inferiore del capo autoclavabile che verrà fissato al cranio. Prima che il cemento si indurisca, posizionare il capo sul cranio del topo, avendo cura di non far depositare il cemento dentale sull'area di imaging, e attendere che si solidifichi.

Applicare una piccola quantità di idrogel all'interno, che mantiene la superficie del cranio umida, avendo cura di non disturbare il cemento durante l'essiccazione. Quindi fissare il pezzo per la testa al supporto e assicurarlo in posizione. Utilizzare la vite assicurandosi che le scanalature si incastrino correttamente negli intagli del supporto.

Rimuovere l'idrogel con bastoncini di cotone sterili prima di trasferire al microscopio. Successivamente, inserire il supporto sul tavolino del microscopio e posizionare il tappetino riscaldante sotto il topo. Inserire la sonda del termometro rettale e fissare tutto al suo posto sul tavolino con del nastro adesivo.

Applicare una piccola goccia di unguento oftalmico sugli occhi del topo per evitare che si secchino durante l'anestesia. Il topo non deve mai essere lasciato incustodito durante il processo di imaging mentre è sotto anestesia. Per mettere a fuoco il cranio attraverso gli oculari.

Per prima cosa, riempire la finestra di imaging del cranio con acqua sterile purificata utilizzando una lente ad immersione in acqua. Abbassarla fino a farla toccare la goccia d'acqua. Mettere a fuoco la parte superiore del cranio utilizzando gli oculari del microscopio.

Posizionare l'area di imaging sulla sutura centrale e spostarsi verso la parte posteriore della testa per individuare la sutura coronale. Come posizione iniziale, impostare il software in modalità di acquisizione di immagini XY e di uno stack tridimensionale in Z. Impostare la velocità di imaging a 400 hertz e la risoluzione a 512 per 512 pixel.

Impostare il software in modo da acquisire più canali e impostare il metodo di raccolta per modificare le impostazioni tra stack o tra fotogrammi. Configurare tre impostazioni di acquisizione indipendenti. Spegnere l'illuminazione laser al termine dell'acquisizione di ogni stack.

Quindi impostare la prima scansione sequenziale per il segnale osseo di seconda armonica generata da due fotoni. Aprire l'otturatore per il laser a fotoni multipli e verificare che il guadagno e l'offset del laser a fotoni multipli siano correttamente configurati. Assicurarsi inoltre che la potenza del laser sia compresa tra il 12,5% e il 25% e che il laser sia acceso.

Selezionare un PMT appropriato come unico rivelatore e modificare il colore in bianco. Ripetere la procedura di configurazione del canale per autofluorescenza combinata e DID nell'impostazione secondaria. Eseguire la scansione utilizzando due PMT appropriati.

Modificare il colore del canale in verde per l'autofluorescenza e in rosso per il DID. Infine, configurare la terza e ultima scansione per la rilevazione della GFP. Impostare la potenza del laser della linea a 488 nanometri a circa il 15%. Selezionare un tubo fotomoltiplicatore appropriato, o PMT, come unico rilevatore attivo e modificarne il pseudocolore in verde.

Attivare una modalità di imaging in tempo reale per avviare una scansione di anteprima del canale selezionato e regolare il guadagno e l'offset del rilevatore per un'esposizione ottimale. Ripetere questa operazione per ogni scansione nella finestra sequenziale e salvare le impostazioni di queste scansioni multicanale per un facile riutilizzo. Quindi attivare l'acquisizione multiposizione, denominata mark and find in questo software, e reimpostare i punti coordinate.

Successivamente, scansionare l'area di imaging dell'osso a partire dall'intersezione tra la sutura sagittale e quella coronale. Scansionare la profondità dell'area del midollo osseo utilizzando sia l'autofluorescenza sia il DID in una vista composita. Quando viene rilevata una cellula, contrassegnare questa posizione come nuova coordinata facendo clic sull'icona "aggiungi nuova posizione" situata sul lato sinistro della finestra di marcatura.

Dopo aver esaminato il campo visivo corrente, spostare la piastra della distanza di un campo visivo. Ripetere questo procedimento per ogni campo visivo, spostandosi gradualmente lungo tutta la finestra di imaging a sinistra della sutura centrale, in direzione del naso del topo.

Una volta visibile la biforcazione della sutura centrale, spostarsi sul lato destro della sutura e ripetere la procedura. Scansionare il lato sinistro in direzione inversa. Contrassegnare le coordinate di eventuali nuove cellule di interesse utilizzando lo strumento di marcatura e ricerca.

Per rivedere i punti, impostare l'estremità superiore e inferiore di uno stack Zs attorno a ogni cellula per ciascuna posizione. Per ogni punto, regolare la messa a fuoco verso l'alto e verso il basso e impostare le posizioni Z superiore e inferiore per l'acquisizione di tre stack DZ. Aggiornare il singolo punto nella funzione mark and find, impostare l'intervallo Zack a cinque micrometri e la media per ogni canale di scansione sequenziale su un valore di qualità appropriato.

Acquisire uno stack di riferimento di alta qualità per ciascun punto di interesse avviando l'intera procedura di scansione. Al termine della scansione di alta qualità, attivare un'impostazione per l'acquisizione in time-lapse e le relative impostazioni. Impostare l'intervallo di tempo a cinque minuti e la durata complessiva alla lunghezza desiderata.

Applicare queste impostazioni alla scansione complessiva. Questo esempio mostra come acquisire più di tre punti modificando tali impostazioni, riducendo il tempo di scansione per consentire un intervallo di time-lapse di cinque minuti, diminuendo il numero di scansioni utilizzate per la media e limitando la risoluzione a 512 per 512 pixel. Passare alla scansione bidirezionale e/o aumentare la velocità di scansione a 600 hertz o superiore, quindi avviare l'acquisizione come in precedenza cliccando sul pulsante di avvio nel software dimostrativo.

Al termine dell'acquisizione delle immagini, eseguire l'eutanasia del topo come descritto nel protocollo testuale. Il supporto personalizzato per topo ad alta precisione, completo di finestra di imaging del cranio, permette un'acquisizione prolungata di HS PC marcati iniettati in topi riceventi sottoposti a irradiazione letale; qui mostrati sono sezioni 2D di stack 3D con risoluzione a singola cellula di aree del midollo osseo contenenti CSEH, di spessore approssimativo tra 90 e 120 micrometri, con segnale proveniente dal collagene. L'osso è mostrato in bianco, le cellule marcate con DID sono mostrate in rosso.

Le cellule autofluorescenti sono mostrate in giallo e le cellule osteoblastiche sono mostrate in verde. Qui viene mostrato un filmato in time-lapse 40× delle cellule HS PC identificate, con le HSC marcate con DID in rosso che migrano in prossimità delle cellule osteoblastiche in verde. Una volta padroneggiata, questa tecnica dovrebbe poter essere eseguita in circa un'ora per l'intervento chirurgico e l'acquisizione iniziale delle immagini, seguita dal tempo adeguato per l'acquisizione in time-lapse.

Dopo aver visto questo video, dovresti sentirti abbastanza sicuro nel configurare l'acquisizione di immagini del cranio del topo e nell'osservare più PC dell'HS nel tempo.