Un nuovo approccio Microdissezione per recuperare
5 giugno 2014
Microdissezione è stato ampiamente impiegato per l'esame di DNA, RNA e proteine nel tessuto. Microscopia laser capture (LCM) è il metodo più comunemente usato, ma una nuova tecnica di fresatura, mesodissection, è da poco disponibile. Dimostriamo estrazione di RNA da mesodissected in formalina paraffina fissati diapositive tessuti integrati di Mycobacterium tuberculosis granulomi.
L'obiettivo generale di questa procedura è eseguire la microdissezione di tessuti da sezioni in paraffina fissate e formolate. Questo viene realizzato innanzitutto creando un'immagine di riferimento a partire da una sezione colorata con ematossilina ed eosina rappresentativa. Il secondo passaggio consiste nel posizionare una sezione corrispondente non colorata, in paraffina fissata e formolata, sul piano dello strumento e allineare l'area di dissezione desiderata con l'immagine di riferimento.
Successivamente, l'area di dissezione viene annotata e un ago monouso per il maschio viene caricato con tampone e inserito nello strumento. L'ultimo passaggio consiste nel dissezionare il tessuto annotato. In definitiva, una combinazione di estrazione dell'RNA, amplificazione e RT-PCR viene utilizzata per dimostrare come il tessuto dissezionato possa essere impiegato per l'analisi dell'espressione genica globale di Mycobacterium tuberculosis all'interno dei granulomi polmonari provenienti da Reeses Maca infetti.
Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nel campo della ricerca sulla tubercolosi, come l'identità dei geni espressi da Mycobacterium tuberculosis in nicchie in vivo simili a quelle umane durante diversi stati infettivi della tubercolosi. Inoltre, questi dati aiuteranno a chiarire la regolazione dei patogeni, nonché le differenze metaboliche e fisiologiche presenti in questi distinti stati della malattia, generando così bersagli specifici per farmaci.
Lo strumento per la dissezione meso è dotato di un microscopio digitale integrato con il software di acquisizione immagini ID e di un joystick per il controllo delle posizioni dello stadio XY. Prima di iniziare questa procedura, calibrare lo strumento con il software di acquisizione immagini come descritto nel manoscritto allegato, al fine di creare un'immagine di riferimento. Posizionare innanzitutto un vetrino colorato con ematina ed eosina o con ematossilina ed eosina (H&E) sullo stadio e coprirlo con un coperchio opaco.
Quindi guidare lo strumento spostando la levetta verso l'area desiderata del vetrino h e d. Salvare l'immagine generata utilizzando la scheda acquisizione riferimento per allineare il tessuto da dissezionare. Fare clic sull'opzione disseziona tessuto nella schermata principale.
Nella scheda di configurazione, compilare il numero di accesso della dissezione dell'operatore, il numero di accesso di riferimento exci o il codice a barre, il numero del lotto, la dimensione e la descrizione del fluido di dissezione. Fare clic sulla scheda trova tessuto. Importare l'immagine di riferimento salvata in precedenza.
Posizionare un vetrino non colorato in formalina fissata e inclusa in paraffina, o FFPE. Applicare uno strato di spessore pari a cinque micron sulla piastra. Spostare la piastra nella stessa area mostrata nell'immagine di riferimento.
Fare clic sulla scheda allinea. Utilizzare il mouse e le frecce associate per allineare l'immagine di riferimento con l'immagine non colorata. Infine, annotare il vetrino facendo clic sulla scheda annota.
Utilizzare il mouse per disegnare un cerchio intorno all'area desiderata del vetrino che verrà microdissecata. Iniziare questa procedura riempiendo il contenitore monouso con il tampone desiderato, in questo esempio PKD Buffer, tirando e spingendo il pistone più volte con un movimento fluido. Assicurarsi di escludere le bolle d'aria.
Alzare l'asse Z premendo il pulsante dell'asse Z. Inserire il bit maschio usa e getta nello strumento. Inserire il bit maschio usa e getta nella parte superiore della macchina in modo che la linea bianca sullo strumento si allinei con la linea nera sul bit maschio usa e getta.
Premere il pulsante di ripristino dell'aspirazione per consentire al pistone di abbassarsi nella posizione corretta. Abbassare l'asse Z premendo nuovamente il pulsante dell'asse Z per iniziare la dissezione del tessuto; prima di tutto, aprire la scheda di dissezione. Successivamente, impostare le velocità del motore e dell'aspirazione su uno.
Selezionare la casella "show tracking". Questo consente all'utente di visualizzare l'area dissezionata durante il processo di dissezione. Tenere premuti contemporaneamente il pulsante di attivazione e il pulsante di aspirazione mentre si muove la leva in senso antiorario.
Continuare il dissezione in senso antiorario fino a quando l'aspirato non sarà pieno e la linguetta diventerà rossa. Per raccogliere prima il campione dissezionato, premere il pulsante dell'asse Z per sollevare l'asse, quindi posizionare una microprovetta da 0,5 microlitri sotto la punta del bocchettone maschio monouso e premere rapidamente la barra di controllo dell'aspirazione per espellere il campione nella microprovetta. Il frammento di tessuto sarà ora contenuto all'interno della microprovetta.
Premere il controllo della barra di aspirazione con una forza maggiore per espellere il consumabile mal bit usato. Il protocollo mostrato in questo video è stato utilizzato per microdissezionare granulomi polmonari da Resus Maca infettati con Mycobacterium tuberculosis o MTB in diverse fasi infettive. L'immagine di riferimento mostra un granuloma colorato con ematossilina ed eosina (H&E) proveniente da un Resus Maca attivamente infettato, con l'area di interesse da dissezionare delimitata in verde.
L'immagine centrale mostra la sezione FFPE corrispondente non colorata di spessore cinque micron prima della dissezione. Le aree sono state allineate utilizzando il software, e l'area di interesse corrispondente è delimitata in verde. L'immagine a destra rappresenta la stessa sezione FFPE non colorata dopo la dissezione, con l'area dissezionata indicata in blu.
L'RNA è stato successivamente estratto dai granulomi dissecati al meso in ogni stato infettivo, e questa tabella mostra i risultati. La concentrazione di RNA è stata ottenuta utilizzando un NanoDrop. L'RNA è stato quindi amplificato, purificato e trascritto a ritroso; i risultati della RT-PCR rispetto alla subunità ribosomiale 16 s confermano la presenza della subunità ribosomiale 16 s di MTB e quindi di MTB.
Nel campione microdissecato, il DNA genomico della ceppa CDC 1551 di MTB è stato utilizzato come standard seguendo questa procedura. Altri metodi, come l'estrazione di DNA-RNA e di proteine, possono essere eseguiti per rispondere a ulteriori domande riguardanti genomica, trascrittomica e proteomica. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come microdissecare campioni FFPE provenienti da granulomi polmonari.
Questa procedura non è limitata esclusivamente ai granulomi polmonari infettivi da MTB, ma può essere applicata anche a lesioni causate da altri patogeni.
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Panoramica
In questo articolo viene descritta una tecnica di microdissezione per l'estrazione di RNA da sezioni di tessuto fissato in formalina e inclusi in paraffina. Il metodo si concentra sulla mesodissectomia, una nuova tecnica di fresatura, e sulla sua applicazione ai granulomi di Mycobacterium tuberculosis.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Microdissezione
- Estrazione di RNA
- Ricerca su Mycobacterium tuberculosis
Sfondo
- La microdissezione è ampiamente utilizzata per analizzare DNA, RNA e proteine nei tessuti.
- La microscopia a cattura laser (LCM) è un metodo comune per la microdissezione.
- La mesodisseczione è una tecnica più recente che offre approcci alternativi.
- I tessuti fissati in formalina e inclusi in paraffina sono spesso utilizzati nella ricerca.
Scopo dello studio
- Dimostrare l'estrazione di RNA da tessuto mesodissecato.
- Esplorare l'applicazione della mesodisseczione nello studio di Mycobacterium tuberculosis.
- Potenziare le tecniche di analisi dell'espressione genica.
Metodi Utilizzati
- Creazione di un'immagine di riferimento mediante l'uso di vetrini colorati con ematina ed eosina.
- Allineamento dei vetrini non colorati con l'immagine di riferimento per la dissezione.
- Delimitazione dell'area di dissezione sui vetrini.
- Utilizzo dell'amplificazione mediante estrazione dell'RNA e della R-T-P-C-R per l'analisi.
Risultati principali
- Estrazione riuscita di RNA da tessuto mesodissecato.
- Dimostrazione delle capacità di analisi dell'espressione genica globale.
- Applicazione del metodo ai granulomi polmonari di Reeses Maca infetti.
Conclusioni
- La microdissezione è un metodo praticabile per l'estrazione di RNA dai tessuti.
- Questa tecnica può contribuire allo studio di Mycobacterium tuberculosis.
- Ulteriori ricerche potrebbero migliorare la comprensione dell'espressione genica nei tessuti infetti.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Metodo
Questo metodo consente il recupero mirato di trascritti specifici per il patogeno da granulomi FFPE archiviati, supportando la riduzione mirata dei rischi meccanicistici nella validazione di bersagli anti-infettivi. Fornendo rese quantitative di RNA da compartimenti tessutali definiti, migliora la fiducia predittiva nella scoperta precoce di farmaci antitubercolari. L'approccio affronta un collo di bottiglia fondamentale nel collegare fenotipi istopatologici a firme molecolari nei modelli preclinici.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Bersaglio
- Valore scientifico: Consente l'analisi dell'attività trascrizionale di Mycobacterium tuberculosis all'interno di nicchie granulomatose rilevanti per l'uomo.
- Valore operativo: Riduce la dipendenza da tessuti freschi utilizzando campioni FFPE archiviati per la verifica di ipotesi mirate.
- Valore scientifico: Permette la validazione funzionale di geni espressi dal patogeno come potenziali bersagli terapeutici, grazie al recupero diretto dei trascritti.
Sviluppo di Screening e Saggi
- Valore scientifico: Genera input di RNA adatti per saggi successivi di qPCR o sequenziamento al fine di misurare le variazioni nell'espressione genica in diversi stati di infezione.
- Valore operativo: Standardizza la preparazione dei campioni da sezioni FFPE, migliorando la riproducibilità nei flussi di lavoro trascrittomica focalizzati sui granulomi.
- Valore operativo: Consente la dissezione ad alto rendimento di multiple regioni di interesse per ogni vetrino con un tempo minimo di manipolazione manuale.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Valore scientifico: Facilita la correlazione tra la morfologia delle lesioni istopatologiche e i profili trascrizionali del patogeno nei modelli preclinici di tubercolosi.
- Valore operativo: Fornisce un collegamento tra l'identificazione delle lesioni basata sull'imaging e l'analisi molecolare nella stessa sezione di tessuto.
- Valore scientifico: Aumenta la fiducia sul bersaglio consentendo il rilevamento di trascritti del patogeno a bassa abbondanza in ambienti tissutali eterogenei.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Il metodo si inserisce nel percorso di scoperta che va dallo screening istopatologico alla validazione del bersaglio e all'ottimizzazione del composto leader nei programmi sulle malattie infettive.
- Biologia della scoperta: Supporta l'esplorazione basata su ipotesi dell'espressione genica dei patogeni in compartimenti tissutali anatomicamente definiti.
- Screening: Produce estratti di RNA standardizzati che consentono un profilo trascrizionale coerente tra diverse condizioni sperimentali.
- Analisi: Fornisce un rendimento quantificabile di acidi nucleici adatto alla normalizzazione e all'analisi comparativa dell'espressione genica.
- Ricerca traslazionale: Collega l'imaging a livello delle lesioni con letture molecolari per rafforzare la continuità traslazionale da preclinico a clinico.
- Riutilizzo aziendale: Stabilisce una piattaforma riutilizzabile per l'analisi trascrittomica basata su FFPE, applicabile a diversi modelli di malattie indotte da patogeni.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Aumenta la precisione della validazione degli obiettivi collegando dati molecolari a specifiche caratteristiche istopatologiche.
- Valore operativo: Riduce il tempo e il costo per campione rispetto alla microdissezione con laser, migliorando la produttività del laboratorio.
- Valore strategico: Riduce i rischi nella selezione degli obiettivi fornendo evidenze dirette dell'espressione genica del patogeno in nicchie patologiche rilevanti.
- Impatto sul portafoglio: Orienta le decisioni di avanzamento o interruzione dello sviluppo attraverso una misurazione oggettiva dell'interazione con l'obiettivo in modelli preclinici di tubercolosi.
Considerazioni sull'implementazione
- È richiesta una formazione sulle procedure di allineamento e annotazione del software dello strumento per un corretto targeting del tessuto.
- Il sistema di mesodissectomia e le punte di fresatura compatibili sono essenziali per il recupero del campione.
- La standardizzazione dei parametri di dissezione (velocità, aspirazione, volume del buffer) garantisce la riproducibilità tra diversi utilizzatori e sedi.
- Potrebbe essere necessaria un'adattamento del metodo per spessori di tessuto variabili o protocolli di fissazione diversi da sezioni FFPE di 5 µm.
- L'integrità dell'RNA è influenzata dall'età e dalle condizioni di conservazione del FFPE, richiedendo una valutazione del controllo qualità prima delle applicazioni successive.
Domande frequenti sulla biofarmaceutica
Chapters in this video
0:05
Title
1:33
Create Reference Image, Aligning Tissue for Dissected, and Annotate Slide
3:29
Load Consumable Mill Bit
4:20
Dissecting Tissue
4:59
Emptying and Removing Consumable Mill Bit
5:32
Results: Granulomas Caused by Mycobacterium tuberculosis can be Microdissected for RNA Extraction
6:58
Conclusion
