Un nuovo approccio Microdissezione per recuperare Mycobacterium tuberculosis Trascrizioni specifici da formalina paraffina fisso incorporato Lung granulomi

Microdissezione è stato ampiamente impiegato per l'esame di DNA, RNA e proteine ​​nel tessuto. Microscopia laser capture (LCM) è il metodo più comunemente usato, ma una nuova tecnica di fresatura, mesodissection, è da poco disponibile. Dimostriamo estrazione di RNA da mesodissected in formalina paraffina fissati diapositive tessuti integrati di Mycobacterium tuberculosis granulomi.

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di microsezionare il tessuto da vetrini formali e fissati inclusi in paraffina. Ciò si ottiene creando prima un'immagine di riferimento da un vetrino rappresentativo di Hematin ed Eoin. Il secondo passo consiste nel posizionare un corrispondente vetrino formale non colorato e fissato incorporato in paraffina sul tavolino dello strumento e allineare l'area di dissezione desiderata con l'immagine di riferimento.

Successivamente, l'area di dissezione viene annotata e una punta maschio consumabile viene caricata con il tampone e caricata nello strumento. Il passaggio finale consiste nel sezionare il tessuto annotato. In definitiva, una combinazione di amplificazione dell'estrazione dell'RNA e R-T-P-C-R viene utilizzata per mostrare come il tessuto sezionato possa essere utilizzato per l'analisi globale dell'espressione genica del Mycobacterium tuberculosis all'interno di granulomi polmonari da Reeses Maca infetta.

Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della ricerca sulla tubercolosi, come l'identità dei geni che il Mycobacterium tuberculosis esprime all'interno di nicchie in vivo simili a quelle umane durante diversi stati infetti di tubercolosi. Inoltre, questi dati aiuteranno a spiegare la regolazione dei patogeni, le differenze metaboliche e fisiologiche all'interno di questi distinti stati patologici. Generando così bersagli farmacologici specifici.

Lo strumento di dissezione meso è dotato di un microscopio digitale integrato con i due software di imaging ID e di un joystick per il controllo delle posizioni del tavolino XY. Prima di iniziare questa procedura, calibrare lo strumento con il software di imaging come descritto nel manoscritto allegato per creare un'immagine di riferimento. Per prima cosa posizionare un vetrino colorato di ematina ed eoina o h ed e sul tavolino e posizionare un coperchio opaco sopra il vetrino.

Quindi azionare lo strumento spostando il joystick nell'area desiderata della slitta h e d. Salvare l'immagine generata utilizzando la scheda di riferimento di acquisizione Per allineare il tessuto da sezionare. Fare clic sull'opzione seziona tessuto nella schermata iniziale.

Nella scheda di configurazione, inserire il numero di accesso alla dissezione dell'operatore, il numero di accesso di riferimento, il numero di eci o il codice a barre, il fluido di dissezione, il numero di lotto, la dimensione dell'exci e la descrizione. Fare clic sulla scheda Trova tessuto. Importare l'immagine di riferimento salvata in precedenza.

Posizionare una paraffina formale e fissa non colorata incorporata o FFPE. Far scorrere uno spessore di cinque micron sul palco. Spostare lo stage nella stessa area di quella raffigurata nell'immagine di riferimento.

Fare clic sulla scheda Allinea. Utilizzare il mouse e le frecce associate per allineare l'immagine di riferimento all'immagine non colorata. Infine, annota la diapositiva facendo clic sulla scheda Annota.

Utilizzare il mouse per disegnare un cerchio attorno all'area desiderata del vetrino che verrà microsezionato. Iniziare questa procedura riempiendo il bit di posta consumabile con il buffer desiderato in questo esempio Buffer PKD tirando più volte lo stantuffo verso l'alto e verso il basso con un movimento fluido. Assicurati di escludere le bolle d'aria.

Sollevare l'asse Z premendo il pulsante dell'asse Z. Caricare il bit di posta consumabile nello strumento. Far scorrere la punta maschio consumabile nella parte superiore della macchina in modo che la linea bianca sullo strumento sia allineata con la linea nera sulla punta maschio consumabile.

Premere il pulsante di ripristino dell'aspirazione per consentire l'abbassamento dello stantuffo nella posizione corretta. Abbassare l'asse Z premendo nuovamente il pulsante dell'asse Z per avviare prima la dissezione dei tessuti, aprire la scheda di dissezione. Quindi, portare il motore e le velocità di aspirazione su uno.

Seleziona la casella di monitoraggio dello spettacolo. Ciò consente all'utente di visualizzare l'area sezionata durante il processo di dissezione. Tenere premuto il pulsante di innesto e il pulsante di aspirazione mentre si sposta il joystick in senso antiorario.

Continuare a sezionare in senso antiorario fino a quando l'aspirato è pieno e la linguetta diventa rossa. Per raccogliere prima il campione sezionato, premere il pulsante dell'asse Z per sollevare l'asse, quindi posizionare un tubo per microfughe da 0,5 microlitri sotto la punta della punta maschio consumabile e premere rapidamente l'asta di controllo dell'aspirazione per espellere il campione nel tubo per microfuge. Il frammento di tessuto sarà ora contenuto all'interno del tubo per microfuge.

Premere l'asta di controllo dell'aspirazione con forza maggiore per espellere la punta di consumo usata. Il protocollo dimostrato in questo video è stato utilizzato per microsezionare i granulomi polmonari da Resus Maca infettati da mycobacterium tuberculosis o MTB in vari stadi infettivi. L'immagine di riferimento mostra un granuloma colorato con h e D da una reus Maca attivamente infetta con l'area di interesse da sezionare delineata in verde.

L'immagine centrale mostra il corrispondente vetrino FFPE non colorato di cinque micron di spessore prima della dissezione. Le aree sono state allineate utilizzando il software e l'area di interesse correlata è delineata in verde. L'immagine a destra raffigura la stessa dissezione del perno del vetrino FFPE non colorata con l'area sezionata rappresentata in blu.

L'RNA è stato successivamente estratto dai granulomi meso sezionati ad ogni stato infettivo e questa tabella mostra i risultati. La concentrazione di RNA è stata ottenuta utilizzando un NanoDrop. L'RNA è stato quindi amplificato, purificato e trascritto inversamente in CD N-A-R-T-P-C-R i risultati rispetto alla subunità ribosomiale 16 s confermano la presenza della subunità ribosomiale MTB 16 s e quindi di MTB.

Nei campioni di DNA genomico microdisetto del ceppo CDC 1551, MTB è stato utilizzato come standard Seguendo questa procedura. Altri metodi come D-N-A-R-N-A e l'estrazione di proteine possono essere eseguiti per rispondere a ulteriori domande su genomica, trascrittomica e proteomica. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come microsezionare campioni di FFPE da granulomi polmonari.

Questa procedura non si limita esclusivamente ai granulomi polmonari infetti da MTB, ma può essere applicata anche alle lesioni di altri agenti patogeni.