Fondamentale elementi tecnici di Freeze-frattura / Fermo-etch in Biological microscopia elettronica

Lo scopo del seguente esperimento è quello di generare una replica di campioni di carbonio platino di materiali biologici o di altro tipo per l'esame mediante microscopia elettronica a trasmissione. Per ottenere ciò, gli esemplari che vengono preparati come repliche doppie e singole sono sottoposti a velocità di congelamento ultra rapide per limitare la formazione di cristalli di ghiaccio. Quindi il campione congelato viene fratturato mediante manipolazione remota ad azoto liquido chiamato temperature sotto vuoto spinto, che divide la membrana attraverso il doppio strato lipidico, producendo una faccia extracellulare e una faccia che è prossimale all'aspetto citoplasmatico.

Come passaggio aggiuntivo facoltativo. Le caratteristiche sottostanti possono essere rivelate quando l'acqua viene incisa dalla superficie del campione fratturato posizionando il braccio del microtomo di raffreddamento sopra il tavolino del campione per creare un differenziale di temperatura, che fa sì che l'acqua si sublimi dalla superficie. Successivamente, una replica viene generata dall'evaporazione di carbonio e platino sulla superficie fratturata.

Il campione originale viene digerito dalla replica, che viene recuperata su una griglia di campioni per microscopia elettronica a trasmissione. In definitiva, la freeze etch della frattura da congelamento viene utilizzata per mostrare dettagli strutturali tridimensionali di membrane cellulari, array molecolari e nanomateriali dopo l'esame mediante microscopia elettronica a trasmissione. Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti come l'esame di sezioni ultrasottili è che gli oggetti di interesse possono essere visualizzati in tre dimensioni con risoluzione al microscopio elettronico.

Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della biologia cellulare e molecolare e delle nanotecnologie, come le caratteristiche dimensionali e strutturali delle membrane cellulari e l'organizzazione di array molecolari e nanomateriali. Ho avuto l'idea di questo metodo per la prima volta quando mi sono reso conto che studi simili erano stati condotti su proteste eucariotiche con importanti scoperte, ma che c'era stata un'attenzione limitata a temi rilevanti per la salute umana. Iniziare questa procedura con la preparazione di campioni biologici per il bordo di congelamento della frattura da congelamento, come descritto nel protocollo di testo.

Selezionare tronchetti di campioni in oro o rame di dimensioni e forma appropriate per il campione da processare utilizzando pinze di qualità fine e/o aghi per siringa di piccolo calibro. Posizionare piccoli frammenti del campione sulla parte superiore di un tronchetto metallico del campione. Ridurre il contenuto di liquido del campione a una consistenza appiccicosa, leggermente simile alla colla, prelevando il liquido dal bordo del tronchetto con carta da filtro per repliche singole.

Usa aghi per siringa di piccolo calibro per creare un cumulo di tessuto sul tronchetto per repliche doppie. Capovolgere un altro tronco, posizionarlo esattamente sopra il tronchetto e posizionarlo leggermente sulla superficie del campione. Creare un panino.

Non spingere il campione fuori tra i due tronchetti. Quindi, riempire due recipienti doppi isolati con azoto liquido. Il primo recipiente ospita un palo metallico contenente un piccolo pozzo, che viene utilizzato per liquefare un piccolo volume di gas propano da una bombola disponibile in commercio.

Il secondo recipiente è un recipiente di stoccaggio divisorio per il mantenimento di brevi esemplari congelati sotto azoto liquido. Utilizzare il propano solo in una cappa chimica certificata per tale uso. Fare attenzione ad evitare fonti di accensione estranee, utilizzare indumenti protettivi contro le temperature più basse e mantenere un'adeguata ventilazione poiché il propano è esplosivo.

Può causare lesioni da congelamento al contatto ed è un asfissiante. Utilizzando l'ugello della bombola posizionato nel propano, aprire bene la valvola della bombola e lasciare che il gas fluisca nel pozzo del primo recipiente dove si liquefarà il più rapidamente possibile. Prelevare il supporto del campione con una pinza di qualità fine e immergerlo nel gas liquefatto nel primo recipiente per alcuni secondi.

Quindi trasferire rapidamente nel secondo recipiente di contenimento dell'azoto liquido. Una volta che i campioni sono stati congelati, conservarli sotto azoto liquido fino al momento del trasferimento all'impianto di congelamento della frattura. Caricare i mozziconi d'oro in un tipo di libretto, in una doppia replica del portacampione o in un dispositivo di bloccaggio sotto azoto liquido e mantenerli lì fino al momento di posizionarli nella camera del campione.

Quando la camera ha raggiunto l'alto vuoto e lo stadio è stato chiamato alla temperatura dell'azoto liquido, spegnere la pompa, piegare la camera e posizionare i tronchetti montati sul tavolo del campione il più rapidamente possibile. Quindi accendere la pompa, ristabilire l'alto vuoto e utilizzare i controlli elettronici della temperatura del tavolino e del braccio per regolare la temperatura del tavolo del campione a -100 gradi Celsius. Dirigere anche l'azoto liquido al braccio del microtomo per portarlo alla temperatura dell'azoto liquido.

Al raggiungimento dell'alto vuoto, una temperatura di stadio di -100 gradi Celsius e il braccio del microtomo alla temperatura dell'azoto liquido aprono a distanza il supporto del campione a doppia replica, fratturando così i campioni sui supporti del campione come passaggio aggiuntivo opzionale. I campioni possono essere incisi per rivelare le caratteristiche sottostanti dopo la frattura Per ottenere l'incisione, utilizzare una lama di rasoio mantenuta in un morsetto sul braccio del microtomo per radere la superficie dei campioni. Posizionare il braccio del microtomo freddo sulle superfici fratturate per uno o diversi minuti per sublimare l'acqua al fine di rivelare le vere superfici cellulari, la matrice extracellulare e/o gli assemblaggi molecolari.

Quindi, attiva l'elettrone di platino e carbonio o la pistola di resistenza e lasciagli evaporare un sottile strato di platino di carbonio sulla superficie fratturata da un angolo di 30 gradi a 45 gradi. Ciò richiede in genere da 15 a 20 secondi, attiva l'elettrone di carbonio o la pistola di resistenza allo stesso modo ed evapora un sottile strato di carbonio sulla superficie del campione fratturato direttamente dall'alto a 90 gradi per dare supporto alla replica. Anche questo richiede in genere circa 15-20 secondi al completamento della replicazione, dell'ombreggiamento e della stabilizzazione del carbonio.

Spegnere la pompa a vuoto e la camera e rimuovere il supporto del campione dallo strumento Utilizzando un paio di pinze di qualità fine, rimuovere ogni mozzicone d'oro dal morsetto del libretto a doppia replica e lasciare scongelare per alcuni secondi prima di abbassare delicatamente il tronchetto su una superficie d'acqua in una piastra spot. Manovrare le repliche utilizzando un anello di filo sottile o una griglia per microscopio elettronico in rame convenzionale tenuta da una pinza di grado fine e trasferirle su un'altra piastra spot contenente il 5% di bicromato di sodio e il 50% di acido solforico per una o diverse ore. Questo bagno digerisce il materiale biologico effettivo del campione dalla replica.

Al termine della digestione, trasferire la replica su una superficie d'acqua pulita e recuperarla su una griglia di microscopia elettronica in rame standard. Conserva le repliche delle griglie di supporto in scatole a griglia disponibili in commercio, dove rimarranno stabili per anni. Con una manipolazione delicata o un esame ultra strutturale della frattura da congelamento, le repliche in mordenza, è possibile visualizzare le repliche in un microscopio elettronico a trasmissione a una tensione accelerata, in genere da 50 a 80 kilovolt.

Registrare le immagini rilevanti su pellicola TEM standard o con una fotocamera digitale ad alta risoluzione che risiede nella membrana cellulare alla base di ogni eucariote. Il cilio e il flagello sono una serie di particelle associate alla membrana organizzate in filamenti ENC che circondano l'asta del cilio e noti come collana ciliare. Array di particelle di membrana specializzate appaiono sul bordo luminale delle cellule epiteliali sottoposte a Clio Genesis.

Queste schiere di particelle rappresentano collane ciliari nascenti, che risiedono alla base della Celia emergente e matura. In vari studi epiteliali di fratture da congelamento rivelano una sofisticata organizzazione di strutture anastomizzanti a filamenti e scanalature che circondano l'aspetto apicale dei bordi basolaterali. La frattura attraverso le membrane cellulari epiteliali rivela facce di frattura plasmatica di giunzioni strette che appaiono come filamenti, mentre le facce di frattura extracellulare mostrano solchi complementari.

Le giunzioni gap compaiono nelle preparazioni per fratture da congelamento di una varietà di tessuti e sono rappresentate da dense schiere di particelle sulle facce delle fratture plasmatiche e da fosse complementari sulle fratture extracellulari. I volti sono mostrati qui come esempio di congelamento rapido con incisione profonda e ombreggiatura rotante. La cellula epiteliale è stata fratturata attraverso il citoplasma e si può vedere una faccia di frattura plasmatica dietro le punte di freccia.

Una vera superficie cellulare rivelata dalla successiva incisione Una volta padroneggiata. Questa tecnica può essere eseguita in un ciclo della durata di circa tre ore e produce da uno a tre campioni se eseguita correttamente. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare che le singole fasi sono molto interdipendenti e che un errore in una fase può rendere il risultato inadeguato per l'esame e la valutazione dopo il suo sviluppo.

Questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo della biologia cellulare e molecolare per esplorare come le mutazioni genetiche conferiscono anomalie strutturali nelle cellule, in modi che provocano condizioni patologiche e malattie.