Fondamentale elementi tecnici di Freeze-frattura / Fermo-etch in Biological microscopia elettronica

Lo scopo del seguente esperimento è generare una replica in carbonio e platino di materiali biologici o di altro tipo per l'esame mediante microscopia elettronica a trasmissione. Per raggiungere tale obiettivo, i campioni preparati come repliche doppie e singole vengono sottoposti a velocità di congelamento ultra-rapide per limitare la formazione di cristalli di ghiaccio. Successivamente, il campione congelato viene fratturato mediante manipolazione a distanza a temperature prossime a quella dell'azoto liquido e sotto alto vuoto, il che determina la separazione della membrana attraverso il doppio strato lipidico, producendo una faccia extracellulare e una faccia adiacente all'aspetto citoplasmatico.

Come passaggio aggiuntivo facoltativo. Le caratteristiche sottostanti possono essere rivelate quando l'acqua viene rimossa dalla superficie del campione fratturato posizionando il braccio del microtomo refrigerato sopra il piatto del campione per creare un gradiente di temperatura, che provoca la sublimazione dell'acqua dalla superficie. Successivamente, una replica viene generata mediante evaporazione di carbonio e platino sulla superficie fratturata.

Il campione originale viene digerito dalla replica, che viene raccolta su una griglia per microscopia elettronica a trasmissione. Fondamentalmente, la tecnica del freeze fracture e del freeze etch viene utilizzata per mostrare i dettagli strutturali tridimensionali delle membrane cellulari, degli ordinamenti molecolari e dei nanomateriali durante l'esame mediante microscopia elettronica a trasmissione. Il principale vantaggio di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti, come l'esame di sezioni ultrasottili, è che gli oggetti di interesse possono essere osservati in tre dimensioni con risoluzione microscopica elettronica.

Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nei campi della biologia cellulare e molecolare e della nanotecnologia, come le caratteristiche dimensionali e strutturali delle membrane cellulari e l'organizzazione di array molecolari e di nanomateriali. Ebbi per la prima volta l'idea di questo metodo quando mi resi conto che studi simili erano stati condotti su protisti eucariotici con scoperte importanti, ma che erano stati dedicati scarsi approfondimenti a temi rilevanti per la salute umana. Iniziare questa procedura con la preparazione dei campioni biologici per la fratturazione e il congelamento al bordo, come descritto nel protocollo testuale.

Selezionare supporti metallici per campioni in oro o rame delle dimensioni e della forma appropriate per il campione da processare, utilizzando pinzette di grado fine e/o aghi di siringa di calibro piccolo. Posizionare frammenti piccoli del campione sulla sommità di un supporto metallico per campioni. Ridurre il contenuto di liquido del campione a una consistenza appiccicosa, leggermente simile a colla, asportando il liquido dal bordo del supporto con carta da filtro per repliche singole.

Utilizzare aghi di siringa di piccolo calibro per creare un mucchietto di tessuto sul supporto per repliche doppie. Capovolgere un altro supporto, posizionarlo esattamente sopra il supporto e appoggiarlo delicatamente sulla superficie del campione. Creare un sandwich.

Non premere il campione fuori dai due supporti. Successivamente, riempire due contenitori doppi isolati con azoto liquido. Il primo contenitore ospita un'asta metallica contenente un piccolo pozzetto, utilizzato per liquefare un piccolo volume di gas propano proveniente da una bombola commercialmente disponibile.

Il secondo contenitore è un serbatoio di stoccaggio a compartimenti per il mantenimento temporaneo di campioni congelati in azoto liquido. Utilizzare il propano esclusivamente in una cappa chimica certificata per tale impiego. Prestare attenzione ad evitare fonti di accensione accidentali, indossare indumenti protettivi contro le basse temperature e garantire un'adeguata ventilazione, poiché il propano è esplosivo.

Può causare lesioni da congelamento al contatto ed è un asfissiante. Posizionando l'ugello del cilindro nel propano, aprire bene la valvola del cilindro e lasciare fluire il gas nel pozzetto del primo contenitore, dove si liquefarà il più rapidamente possibile. Prendere il supporto del campione con pinzette fini e immergerlo nel gas liquefatto nel primo contenitore per alcuni secondi.

Quindi trasferire rapidamente al secondo contenitore di azoto liquido. Una volta che i campioni sono congelati, conservarli in azoto liquido fino al momento del trasferimento nell'impianto di frattura criogenica. Caricare i supporti in oro per i campioni in un portacampioni a libro, di tipo doppio replice, o in un dispositivo a morsetto sotto azoto liquido e mantenerli in tali condizioni fino al momento di posizionarli nella camera del campione.

Quando la camera ha raggiunto il vuoto spinto e il piatto è stato portato alla temperatura dell'azoto liquido, spegnere la pompa, aprire la camera e posizionare rapidamente i portacampioni montati sul tavolo del campione. Quindi riaccendere la pompa per ristabilire il vuoto spinto e utilizzare i controlli elettronici della temperatura del piatto e del braccio per regolare la temperatura del tavolo del campione a meno 100 gradi Celsius. Inoltre, inviare azoto liquido al braccio del microtomo per portarlo alla temperatura dell'azoto liquido.

Raggiunto l'alto vuoto, impostare la temperatura dello stadio a meno 100 gradi Celsius e portare il braccio del microtomo alla temperatura dell'azoto liquido; quindi aprire a distanza il portacampioni a doppia replica, fratturando così i campioni sui supporti. Come passaggio aggiuntivo facoltativo, i campioni possono essere sottoposti a incisione per rivelare le strutture sottostanti dopo la frattura. Per effettuare l'incisione, utilizzare una lametta fissata in una pinza sul braccio del microtomo per raschiare la superficie dei campioni. Posizionare il braccio freddo del microtomo sopra le superfici fratturate per uno o più minuti, in modo da sublimare l'acqua e rivelare le vere superfici cellulari, la matrice extracellulare e/o gli assemblaggi molecolari.

Successivamente, attivare la pistola elettronica o a resistenza al platino-carbonio e lasciare che evapori uno strato sottile di platino-carbonio sulla superficie fratturata con un angolo compreso tra 30 e 45 gradi. Ciò richiede tipicamente circa 15-20 secondi; quindi attivare la pistola elettronica o a resistenza al carbonio nello stesso modo ed evaporare uno strato sottile di carbonio sulla superficie del campione fratturato direttamente dall'alto, a 90 gradi, per fornire sostegno alla replica. Anche questo passaggio richiede tipicamente circa 15-20 secondi, al termine della replica, dell'ombreggiatura e della stabilizzazione al carbonio.

Spegnere la pompa a vuoto e la camera ed estrarre il supporto del campione dallo strumento. Utilizzando una pinzetta di precisione, rimuovere ogni portacampione in oro dal morsetto del foglio di replica doppia e lasciarlo scongelare per alcuni secondi prima di abbassare delicatamente il portacampione su una superficie d'acqua in una piastra per analisi. Muovere le repliche utilizzando un filo sottile a forma di anello oppure una griglia di rame convenzionale per microscopio elettronico tenuta con pinzetta di precisione, e trasferirle in un'altra piastra per analisi contenente dicromato di sodio al 5% in acido solforico al 50% per un periodo da una a diverse ore. Questo bagno digerisce il materiale biologico effettivo dalla replica.

Al termine della digestione, trasferire la replica su una superficie pulita di acqua e recuperarla su una griglia standard in rame per microscopia elettronica. Conservare le griglie portanti delle repliche in appositi contenitori per griglie disponibili in commercio, dove rimarranno stabili per anni. Con un manipolo delicato o per l'esame ultrastrutturale mediante replica di congelamento-frattura, osservare le repliche in un microscopio elettronico a trasmissione a una tensione di accelerazione, tipicamente compresa tra 50 e 80 chilovolt.

Registrare le immagini pertinenti su pellicola standard per TEM o con una fotocamera digitale ad alta risoluzione localizzata nella membrana cellulare alla base di ciascun eucariote. Cilio e flagello sono un insieme di particelle associate alla membrana organizzate in filamenti ENC che circondano l'asse del ciglio e sono noti come collana ciliare. Appaiono specifici aggregati di particelle della membrana al bordo luminale delle cellule epiteliali che stanno subendo la ciliogenesi.

Questi raggruppamenti di particelle rappresentano collari ciliari nascenti, localizzati alla base dei cili emergenti e maturi. Diversi studi su sezioni congelate di epiteli rivelano un'organizzazione complessa di strutture anastomosanti a forma di cordoni e solchi che circondano l'aspetto apicale dei confini basolaterali. La frattura attraverso le membrane delle cellule epiteliali rivela facce di frattura plasmatiche delle giunzioni strette che appaiono come cordoni, mentre le facce di frattura extracellulari mostrano solchi complementari.

I giunzioni comunicanti compaiono nelle preparazioni in frattura congelata di diversi tessuti e sono rappresentate da dense file di particelle sulle facce di frattura plasmatiche e da fossette complementari sulla frattura extracellulare. Le facce mostrate qui sono un esempio di congelamento rapido con profonda mordenzatura e ombreggiatura rotatoria. La cellula epiteliale è stata fratturata attraverso il citoplasma ed è visibile una faccia di frattura plasmatica dietro le punte di freccia.

Una vera superficie cellulare rivelata da una successiva incisione, una volta padroneggiata. Questa tecnica può essere eseguita in un ciclo della durata di circa tre ore, producendo da uno a tre campioni se eseguita correttamente. Nel tentativo di eseguire questa procedura, è importante ricordare che i singoli passaggi sono molto interdipendenti e che un errore in uno di essi può rendere il risultato inadeguato per l'esame e la valutazione dopo lo sviluppo.

Questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo della biologia cellulare e molecolare per esplorare come le mutazioni genetiche conferiscano anomalie strutturali nelle cellule, in modi che provocano condizioni patologiche e malattie.