Effetto di Male Accessory Gland prodotti in deposizione delle uova in gasteropodi

L'obiettivo generale di questo protocollo è quello di caratterizzare gli effetti delle proteine del liquido seminale sul comportamento di deposizione delle uova di una specie ermafrodita simultanea. Ciò si ottiene isolando prima gli individui da una coltura di laboratorio standardizzata, seguita dalla dissezione degli organi bersaglio. In secondo luogo, gli spermatozoi vengono raccolti e viene prodotta una soluzione di trattamento.

Successivamente, le lumache vengono inseminate artificialmente. Poi vengono inseriti in un saggio biografico. In condizioni standard, le masse di uova vengono raccolte, scansionate e messe in BS individuali per la schiusa.

Dopo alcune settimane, i piccoli vengono contati e scansionati, dopodiché tutte le immagini possono essere analizzate utilizzando un software gratuito. Questo protocollo può aiutare a rispondere a domande sui processi di selezione sessuale mediati dalle proteine del liquido seminale. Poiché qui stiamo esaminando gli ermafroditi simultanei, possiamo anche capire se questi processi funzionano in modi simili o diversi come fanno in specie sessuate separate.

Per questo protocollo, abbiamo utilizzato il grande IL in les, che manteniamo presso la VU University di Amsterdam. Usiamo questa specie per studiare le questioni relative alla selezione sessuale e alla riproduzione. Negli Ermafroditi, a causa delle sue dimensioni corporee relativamente grandi, è sperimentalmente molto accessibile.

Inoltre, poiché viene utilizzato in molte discipline biologiche diverse come specie modello, sappiamo molto sulla biologia di base di questi animali. Mi chiamo Yumi. Sono dottore di ricerca presso il Dipartimento di Scienze Ecologiche.

In piena università, dimostrerò i seguenti protocolli. Iniziamo. Per eseguire una biosa affidabile, una coltura di laboratorio è più comunemente utilizzata per escludere le variabili in agguato.

L'acqua a basso contenuto di rame viene mantenuta a 20 gradi Celsius e il ciclo di luce-buio è di 12 per 12 ore. Presso la VU University, la coltura di laboratorio viene mantenuta in vasche di allevamento con ricambio d'acqua continuo. In condizioni standard, le lumache adulte vengono nutrite con lattuga alla libido e separate in base alla loro classe di età.

Una volta che le lumache sono state rimosse dalla struttura di allevamento, saranno considerate in uso e non potranno essere restituite alle vasche di riproduzione. Prima di iniziare la procedura, avrai bisogno di uno stereomicroscopio, una piastra di dissezione con spilli, piccole forbici chirurgiche, pinze, una siringa riempita con soluzione di cloruro di magnesio e alcuni tovaglioli di carta per sopprimere la lumaca, penetrare nel piede con l'ago per iniezione con un angolo di 45 gradi e applicare delicatamente una pressione continua fino a quando la lumaca si rilassa e rimane estesa. Rimuovi l'ago per iniezione e assicurati che la lumaca sia soppressa.

Quindi, prendi la pinza e rimuovi con cura il guscio. Seguendo la curvatura a metà, raschiare delicatamente il muscolo ulare dal guscio. Quindi attorcigliare delicatamente la lumaca fuori dal suo guscio seguendo la direzione di avvolgimento del guscio.

Ora la lumaca è stata rimossa dal suo guscio e il guscio può essere scartato. Successivamente, posizionare la lumaca sulla piastra di dissezione e posizionare uno spillo attraverso l'estremità posteriore del piede. Quindi posizionare uno spillo attraverso la testa.

Metti un po' di tensione sulla lumaca e posiziona lo spillo nel piatto. Ora la lumaca è pronta per la dissezione. Accendere la luce dello stereomicroscopio e regolare il microscopio.

Prima di effettuare la prima incisione, è importante localizzare il por femminile. Questo sarà in seguito un punto di riferimento. Fai una prima incisione appena sotto il bordo del mantello e taglia verso il por femminile.

Fai un giro intorno al poro bonno verso la testa. Assicurati di tagliare solo la pelle e di non colpire alcun organo e taglia in linea retta. Per questo studio, sezioniremo la ghiandola prostatica e le vescicole seminali rispettivamente per il liquido seminale e lo sperma.

Si prega di notare che per le riserve complete di sperma e liquido seminale, le lumache devono essere isolate per una settimana e alimentate ad libido. La dissezione è la stessa spiegata in precedenza. Le vescicole seminali si trovano nella parte posteriore dell'animale.

Successivamente, la ghiandola prostatica sarà sospesa in soluzione salina e messa su ghiaccio. Più tardi. Questi saranno miscelati con le soluzioni di trattamento.

Prima dell'iniezione intravaginale, gli spermatozoi raccolti verranno aggiunti al liquido seminale o alle singole proteine in una dose pertinente. Per questa tecnica di inseminazione artificiale, avrai bisogno di una siringa da un millilitro contenente la soluzione di prova montare un ago per iniezione sulle siringhe, assicurandoti che non ci siano bolle bloccate nelle siringhe per l'iniezione, utilizzare con attenzione il tubo di silicone. Far scorrere il tubo di silicone sull'ago per iniezione.

Assicurarsi che il tubo sia forato e rimuovere l'aria dal tubo. Prima dell'iniezione, la lumaca deve essere sedata. Questo seguirà lo stesso protocollo del capitolo due.

Alla lumaca verrà somministrata una dose di due o tre millilitri di 50 micro molari di cloruro di magnesio. Quando la lumaca è adeguatamente sedata e rilassata, adagiatela nello stampo per mantenerla in una posizione stabile. Quindi, afferra l'estremità del tubo di silicone con un paio di pinze sottili e spingilo delicatamente nella parte femmina.

Quindi applicare delicatamente pressione sulla siringa e iniettare con cura il volume prescritto della soluzione di prova. Attendere mezzo minuto affinché la pressione nel tubo si diffonda nell'organo femminile. Dopodiché, rimuovete con cura il tubo e mettete la lumaca nel suo contenitore specifico.

Dopotutto, le lumache sono state inseminate artificialmente. Possono essere trasportati nelle loro vasche sperimentali e il biotest bios può iniziare. Le lumache si riprenderanno dalla sedazione dopo poche ore. Saggi biologici.

Per la selezione sessuale, gli esperimenti richiedono normalmente due settimane prima che la biosa possa essere avviata. È importante mettere tutti gli individui nei propri contenitori ed etichettarli. Quindi, misura la lunghezza del guscio di ogni lumaca.

Questo è un buon indicatore delle loro dimensioni, che può avere un effetto sul comportamento sessuale. Successivamente, le lumache vengono messe in una vasca sperimentale. Questa vasca ha le stesse condizioni standard dell'impianto di allevamento.

Come discusso nel primo capitolo, è importante posizionare i contenitori con il giusto orientamento in modo che le aperture seguano il flusso d'acqua nel serbatoio. Durante i biotest, le lumache devono essere nutrite regolarmente. Una quantità standard di dischi di lattuga viene tagliata con una perforatrice metallica.

Un dosaggio sufficiente è di due dischi a giorni alterni. Con la specie modello, lumia stauss, Le lumache dovrebbero essere controllate per le masse di uova a giorni alterni. Queste masse di uova saranno raccolte per le misurazioni.

Per la scansione delle uova, avrai bisogno di un laptop contenente il driver dello scanner, uno scanner piano, una scala millimetrica standard, un cucchiaio per il trasferimento di uova e lastre di vetro da deporre sopra le masse di uova. Per prima cosa, prendi il cucchiaio e raschia le masse di uova dalle pareti del contenitore. Le masse di uova opache sono state appena deposte e non possono essere utilizzate.

In questo evento di misurazione, posizionare le masse di uova sulle piastre di trasferimento e ripetere questi passaggi fino a quando le piastre non sono piene. Successivamente, metti le masse di uova sulle piastrelle di vetro nello stesso ordine delle piastre di trasferimento. Le masse di uova si attaccheranno alla piastrella di vetro, la capovolgeranno e la posizioneranno con cura sullo scanner piano appena sotto la bilancia.

Quindi applicare pressione sulle piastre per schiacciare le masse di uova. Questo aggiungerà anche ora tutte le uova in modo che vengano scansionate altrettanto bene. Prima della scansione, si consiglia di regolare le impostazioni per ottenere il miglior risultato.

Per la scansione, è importante regolare la risoluzione al massimo per eseguire una scansione di anteprima Per ritagliare successivamente l'area di lavoro e, infine, regolare la luminosità e il contrasto prima di eseguire la scansione finale. Dopo la scansione, le masse di uova verranno poste nelle proprie fiale etichettate per maturare e schiudersi. Queste fiale hanno l'acqua rinfrescata a giorni alterni per mantenere l'ossigeno a un livello adeguato.

Man mano che più lumache si schiudono, è necessario utilizzare tecniche diverse per rinfrescare l'acqua. L'ordine migliore è versare o traboccare all'inizio e successivamente aspirare l'acqua con una pipetta aperta immagine JA foglio di calcolo. Per registrare prima i dati e una foto dall'interno dell'immagine J, utilizzare lo strumento zoom Per passare alla scala millimetrica.

Ingrandisci e regola la finestra in modo che un millimetro riempia lo schermo. Disegna una linea usando lo strumento linea tra le due linee indicatrici. Quindi, vai ad analizza, quindi imposta la scala.

Nel menu a comparsa, vedrai la lunghezza misurata che regola la distanza nota a uno e l'unità di misura a millimetri. Seleziona la casella globale e chiudi la finestra. Ora che la scala è stata impostata, possiamo zoomare verso le prime masse di uova Fino all'800%Usa lo strumento ellittico per disegnare la circonferenza delle uova.

Premi D per disegnare la circonferenza. Questo aiuterà a evitare di misurare lo stesso uovo due volte. Premere M per misurare la circonferenza.

Verrà visualizzata una finestra dopo che sono stati raccolti dati sufficienti. La finestra dei dati può essere salvata come file Excel. I dati possono anche essere copiati direttamente in un foglio di lavoro.

Se le misure preferite non vengono visualizzate nella finestra popup, è possibile regolarle e analizzarle. Impostare le misurazioni, contare le singole uova per massa di uova può essere effettuato anche con l'aiuto del plug-in del contatore di cellule. Vai ai plug-in.

Quindi analizza e seleziona il contatore di celle. Verrà visualizzata la finestra del contatore di celle. Seleziona la casella Mantieni originale e premi inizializza.

È apparsa una nuova finestra del contatore. Seleziona lo strumento Croce qui dalla barra degli strumenti. Quindi selezionare un tipo di contatore nel menu del contatore di celle.

Cliccando nella finestra del contatore delle celle, le uova verranno contate. Il conteggio totale si trova accanto al tipo di contatore nel menu del contatore di celle. Con il contatore di cellule è possibile contare più masse di uova.

I tipi di contatore possono essere aggiunti e rimossi se lo si desidera, questo numero deve essere copiato manualmente in un foglio di calcolo o premere i risultati e verrà visualizzata una finestra. Mostra tutti i risultati. Con questo metodo, abbiamo dimostrato come raccogliere le proteine del liquido seminale, come testarle in modo significativo.

Lo abbiamo dimostrato utilizzando l'estratto completo della ghiandola prostatica, ma naturalmente le singole proteine del liquido seminale possono essere testate allo stesso modo. Inoltre, è possibile osservare altri processi e la deposizione delle uova. I risultati dei nostri esperimenti hanno dimostrato che esiste una singola proteina del liquido seminale chiamata statina avios che media una riduzione della corsia delle uova.

Inoltre, scopriamo che il trasferimento di liquido seminale aumenta le dimensioni o i perni. La statina è la prima proteina del liquido seminale completamente caratterizzata in un ermafrodito simultaneo. Mentre gli effetti del liquido seminale sono stati spesso riportati in specie con sessi separati, i nostri risultati evidenziano che i liquidi seminali sono altrettanto importanti negli ermafroditi.