Name: Un protocollo Infettare Caenorhabditis elegans Con Salmonella typhimurium (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-06-26T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 50 s
Description: Scopri come infettare Caenorhabditis elegans con Salmonella typhimurium per studiare le interazioni ospite-patogeno. Questo protocollo utilizza l'RNA interference per identificare geni essenziali nella difesa dell'ospite.

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Ringraziamo il Dott. Diane Baronas-Lowell per la lettura critica del manoscritto. Questo lavoro è stato supportato da un FAU Charles E. Schmidt College of Science Seed Grant e una borsa di studio invecchiamento della Ellison Medical Foundation di KJ

1. Piastre XLD (xilosio lisina Desoxycholate) Agar XLD agar è un terreno di coltura selettivo per Salmonella, che appare come colonie nere su piastre di agar XLD. Tuttavia, se non ci sono problemi di contaminazione, un piatto regolare LB può essere sostituito. <ol><li> Pesare 5,5 g di agar XLD e risospendere in 5 ml di acqua deionizzata. </li><li> Mescolare accuratamente fino a quando tutti agar è bagnato. Aggiungere 95 ml di acqua deionizzata fino a quando tutti i grumi sono andati e il mezzo è completamente risospese. </li><li> Far bollire il mezzo per sciogliere completamente (non autoclave). </li><li> Raffreddare il terreno a temperatura ambiente a 50 ° C. </li><li> Versare 25 ml di agar-agar in ciascuno di 95 x 15 mm (diametro x altezza) targa (targhe sigillati con parafilm possono essere conservati a 4 ° C per un massimo di 1 mese). </li></ol> 2. Nematode Growth Medium (NGM) RNAi alimentazione Piatti Preparazione di C. piastre NGM elegans è stato descritto in precedenza 19. Qui una procedura viene brevemente descritta aggiungere ampicillina e l&#39;RNAi induttore chimico isopropil β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) in media NGM per rendere le piastre di alimentazione RNAi. <ol><li> Sciogliere 3 g di NaCl e 2,5 g Bacto peptone in 1 L di acqua deionizzata. </li><li> Aggiungere 17 g di agar Bacto nei media. </li><li> Autoclavare media per 45 minuti e raffreddare il supporto a 50 ° C in un bagno d&#39;acqua. </li><li> Aggiungere le seguenti soluzioni: 1 ml di colesterolo (5 mg / ml in 95% etanolo), 1 ml di 1 M CaCl 2, 1 ml di 1 M MgSO4, e 25 ml di 1 M tampone fosfato di potassio (pH 6,0). Mescolare bene. </li><li> Aggiungere 1 ml di 1 M IPTG e 500 microlitri ampicillina (100 mg / ml in acqua sterile). </li><li> Mescolare bene la soluzione e versare in 60 x 15 mm (diametro x altezza) piastre di Petri con un apparecchio Pipettare e 25 ml pipetta sierologica seguenti procedure sterili. Riempire ogni piatto con 12 ml di agar. Le piastre possono essere conservati a 4 ° C per un massimo di 1 mese. </li></ol> Il gene essenziale autofagia bec-1 viene utilizzato come esempio per esaminare la funzione di un gene ospitante in difesa contro l&#39;infezione da Salmonella. Le procedure sperimentali sono illustrati nella figura 1 e nella tabella 1. Il protocollo per la preparazione RNAi animali trattati per l&#39;infezione segue, con il giorno di ogni fase sperimentale dato tra parentesi. <ol><li> Seminare bec-1 alimentazione RNAi e controllare vettore vuoto L4440 RNAi alimentazione batteri mettendo un fiocco di -80 ° C i batteri congelati in 2 ml di terreno LB integrato con 100 mg / ml ampicillina (1 ° giorno). Ripetere questa operazione una volta alla settimana durante l&#39;intero esperimento di avere batteri RNAi freschi. Conservare la cultura nel 4 ° C frigorifero quando non è utilizzato. </li><li> Seed 100 ml di coltura batterica durante la notte RNAi su lastre di RNAi. Preparare tre bec-1 RNAi e tre di controllo vuota vettore piatti RNAi. Incubare le piastre a 37 ° C per una notte (Day 2). </li><li> Rimuovere le piastre di RNAi dal 37 ° C incubatore e permettere loro di raffreddare a temperatura sulla panchina stanza. Pick up ben nutriti L4 wild type ermafroditi N2 e trasferire loro di Bec-1 RNAi e controllo vettoriale piatti RNAi vuoti. Inserire tre vermi per piastra, su piastre in triplo. Lo stesso giorno, preparare piatti RNAi come descritto al punto 3.2 (3 ° giorno). </li><li> Incubare le piastre RNAi con i vermi in incubatore a 20 ° C per 36-40 hr e trasferire i vermi a piatti freschi RNAi corrispondenti preparati nella fase 3.3. Dopo i vermi vengono trasferiti, incubare le piastre nel 20 ° C incubatore per 64 ore (giorno 4). </li></ol> 4. Preparare Salmonella per infezione <ol><li> Streak Salmonella -80 ° C Si congelati su 1 piastra XLD agar ed incubare la piastra a 37 ° C durante la notte (Day 5 </strong&gt;). </li><li> Scegli una ben isolata Salmonella bianco colonia e inoculare in 2 ml di terreno LB a 37 ° C con agitazione tutta la notte (Giorno 6). </li><li> Seed 80 ml ​​Salmonella cultura durante la notte il 1 ° C. elegans 60 x 15 mm (diametro x altezza) piastra NGM agar e preparare 6 piatti in totale. Incubare le piastre a temperatura ambiente per 6 ore. La coltura batterica devono asciugare e formare un prato sulla piastra (7 ° giorno). </li></ol> 5. Worms Infect RNAi trattati con Salmonella <ol><li> Trasferimento bec-1 RNAi-trattati e controllo vettoriale RNAi trattati ermafroditi L4 N2 vuoti (progenie di vermi istituito nel passaggio 3) alle piastre Salmonella. Mettere 40 vermi per piastra su 3 piastre per ogni gruppo. Incubare le piastre a vite senza fine a 20 ° C per 48 ore (7 ° giorno). </li><li> Preparare una serie di lastre di RNAi freschi come descritto nei punti 3.1 e 3.2 (Day 7 e <strong&gt; Giorno 8). </li><li> Dopo 48 ore l&#39;infezione, trasferire i vermi Salmonella-infetti ai corrispondenti piastre RNAi preparati in fase 5.2 e incubare a 20 ° C (9 ° giorno). </li></ol> 6. Sopravvivenza Assay <ol><li> Punteggio la sopravvivenza di vermi quotidiano e trasferire i vermi di corrispondenti lastre di RNAi freschi durante il periodo di deposizione delle uova. Preparare una serie di lastre di RNAi fresco prima di ogni trasferimento verme come descritto nei punti 3.1 e 3.2. Toccare il corpo senza fine (testa, parte centrale e la coda) delicatamente con un filo di platino end-appiattita. Un worm è segnato come morta, se si osserva alcun movimento del corpo worm. </li><li> Punteggio la sopravvivenza di vermi giorno o ogni altro giorno, e trasferire i vermi alle corrispondenti piastre RNAi freschi due volte a settimana dopo i vermi fermano la deposizione delle uova. </li><li> Dopo che tutti i vermi muoiono, riunire i dati di sopravvivenza da lastre triplice copia come un set di dati. Inserire i dati di sopravvivenza di ogni gruppo nel caso di software statistico come GraphPad Prism per generare curve di sopravvivenza e di effettuare analisi di sopravvivenza di Kaplan-Meier. L&#39;intero esperimento viene ripetuto almeno una volta a confermare la conclusione. </li></ol>

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</ol>

Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari in competizione.

C. elegans è un organismo semplice modello genetico che mangia i batteri come fonte di nutrienti. Così, è facile da sostituire la alimentare batterica normale con un patogeno intestinale per indagare le interazioni tra C. elegans e l&#39;agente patogeno scelto. Qui un protocollo è descritto combinare Salmonella infezione e C. elegans RNAi alimentazione trattamento per esaminare il ruolo dei geni ospitanti in difesa contro le infezioni da Salmonella. Protocolli di precedente i...

Il nematode del suolo a vita libera Caenorhabditis elegans è un semplice e geneticamente trattabili organismo modello utilizzato per studiare molte questioni biologiche. C. elegans esiste prevalentemente come ermafroditi auto-fertilizzazione. I maschi sono spontaneamente generati da non disgiunzione del cromosoma X durante la gametogenesi 1,2. In presenza di cibo abbondante, C. elegans sviluppare continuamente attraverso quattro stadi larvali all&#39;adulto. La temperatura influisce anche C. sviluppo elegans; sviluppo più rapido si osserva a temperature più elevate. In laboratorio, C. elegans è coltivato ad una temperatura standard di 20 ° C su piastre di agar con seminato batterio Escherichia coli (ceppo OP50) come alimento 1,2. Nell&#39;ultimo decennio, C. elegans è emerso come un organismo invertebrato per studiare le interazioni ospite-patogeno 3-5. In natura, C. elegans mangia i batteri come nutrient 1,2 fonte. La sua normale cibo laboratorio batterica, OP50, può essere facilmente sostituito con altri patogeni per esaminare le interazioni tra C. elegans e qualsiasi agente patogeno scelta. In queste condizioni, l&#39;intestino è il sito primario dell&#39;infezione. Infatti, una vasta gamma di patogeni batterici ha dimostrato di infettare lethally C. elegans 3-5. Il batterio Salmonella gram-negativa è un agente patogeno gastrointestinale che causa malattie di origine alimentare umana in tutto il mondo 6,7. C. elegans è un buon modello di accoglienza per la Salmonella typhimurium come questo batterio si replica e presenta infezioni intestinali persistenti 8-10. C. elegans è stato usato per identificare sia nuovo e precedentemente noto virulenza di Salmonella fattori 11. È interessante notare che il C. sistema immunitario elegans limita con successo la replica Salmonella. E &#39;stato riportato in precedenza che inibition di geni autofagia rende maggiore la replica di Salmonella in C. elegans, con conseguente morte precoce di vermi infetti 10. Macroautofagia (di seguito denominato autofagia) è un processo dinamico che coinvolge il riassetto delle membrane subcellulari di sequestrare citoplasma e organelli per la consegna agli lisosomi per la degradazione 12. Autofagia è stato segnalato per limitare la replica Salmonella in C. elegans e nei mammiferi 10,13. La C. elegans genoma è stato il primo genoma degli eucarioti multicellulari sequenziato; è sensibile alle RNAi trattamento 14-16. Inoltre, RNAi può essere somministrato efficacemente sottoponendo vermi ingerire batteri contenenti l&#39;RNA a doppio filamento del gene bersaglio, noto come RNAi alimentazione 16,17. Genoma biblioteche alimentazione RNAi interi sono stati generati per il genoma di screening RNAi 16,18. Qui, una Salmonella infezione proprotocollo è accoppiato con RNAi alimentazione per consentire la sperimentazione C. elegans geni di interesse per la loro capacità di proteggere contro l&#39;infezione da Salmonella.

<table><tbody><tr><td>LB Brodo</td><td>Fisher</td><td>BP9723-500</td><td></td></tr><tr><td>XLD agar</td><td>EMD Chemicals</td><td>1.05287.0500</td><td></td></tr><tr><td>Bacto Agar</td><td>Fisher</td><td>DF0140-01-0</td><td></td></tr><tr><td>Peptone</td><td>Fisher</td><td>BP1420-500</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro di sodio</td><td>Fisher</td><td>S671-500</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro di calcio</td><td>Fisher</td><td>C69-500</td><td></td></tr><tr><td>Solfato di magnesio</td><td>Fisher</td><td>M65-500</td><td></td></tr><tr><td>IPTG</td><td>Gold Biotechnology</td><td>12481C50</td><td></td></tr><tr><td>Colesterolo</td><td>Sigma</td><td>C8667-25G</td><td></td></tr><tr><td>Ampicillina</td><td>Fisher</td><td>BP1760-25</td><td></td></tr><tr><td>Salmonella typhimurium</td><td>ATCC</td><td>ATCC14028</td><td></td></tr><tr><td>Petri Piatto 95 x 15 mm</td><td>Fisher</td><td>FB0875714G</td><td></td></tr><tr><td>Piastra di Petri 60 x 15 mm</td><td>Fisher</td><td>08-757-13A</td><td></td></tr><tr><td>Pipetta sierologica Falcon</td><td>Fisher</td><td>13-668-2</td><td></td></tr><tr><td>Falcon Express Pipet-Aid</td><td>Fisher</td><td>13-675-42</td><td></td></tr><tr><td>MaxQ6000 incubatore a scuotimento&nbsp;</td><td>Thermo Scientific</td><td>SHKE6000-7</td><td></td></tr><tr><td>Incubatrice</td><td>Percival</td><td>I-36DL</td><td></td></tr></tbody></table>

un protocollo infettare<em&gt; caenorhabditis elegans</em&gt; con<em&gt; salmonella typhimurium</em

A Protocol to Infect Caenorhabditis elegans with Salmonella typhimurium

Nell&#39;ultimo decennio, C. elegans è emerso come un organismo invertebrato per studiare le interazioni tra i padroni di casa e agenti patogeni, tra cui la difesa ospite contro i gram-negativi batterio Salmonella typhimurium. Salmonella stabilisce infezione persistente nell&#39;intestino di C. elegans e si traduce in morte precoce di animali infetti. Un certo numero di meccanismi immunitari sono stati identificati in C. elegans per difendersi contro le infezioni da Salmonella. Autofagia, un evolutivamente conservata degradazione lisosomiale percorso, ha dimostrato di limitare la replica Salmonella in C. elegans e nei mammiferi. Qui, un protocollo è descritto per infettare C. elegans con Salmonella typhimurium, in cui i vermi sono esposti a Salmonella per un tempo limitato, simile alle infezioni da Salmonella nell&#39;uomo. Salmonella infezione riduce notevolmente la durata di C. elegans &lt;/ Em&gt;. Utilizzando il gene autofagia essenziale bec-1 come esempio, abbiamo combinato questo metodo infezione da C. elegans RNAi alimentazione approccio e ha mostrato questo protocollo può essere utilizzato per esaminare la funzione di C. geni ospitanti elegans in difesa contro le infezioni da Salmonella. Poiché C. elegans intero genoma librerie RNAi sono disponibili, questo protocollo permette di schermare completamente per la C. elegans geni che proteggono contro la salmonella e altri patogeni intestinali utilizzando le librerie RNAi genome-wide.

A 20 ° C, la durata mediana di wild type vermi N2 è 17 giorni (Figura 2a e Tabella 2). Infezione da Salmonella diminuisce significativamente la durata mediana di vermi N2 a 10,5 giorni (p = 0,0002, log-rank test) (Figura 2A ). Se una C. gene elegans svolge un ruolo importante nella difesa contro le infezioni da Salmonella, si prevede che la sua inibizione impartirà suscettibilità alle infezioni Salmone...

C. elegans è emerso come un nuovo modello genetico per studiare le interazioni ospite-patogeno. Qui si descrive un protocollo per infettare C. elegans con Salmonella typhimurium accoppiato con la tecnica RNAi doppio filamento interferenze per esaminare il ruolo dei geni ospitanti in difesa contro le infezioni da Salmonella.

Un protocollo Infettare<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; Con<em&gt; Salmonella typhimurium</em

In the last decade, C. elegans has emerged as an invertebrate organism to study interactions between hosts and pathogens, including the host defense ...

L'obiettivo generale di questa procedura è infettare *C. elegans* con *Salmonella* al fine di esaminare le interazioni tra ospite e patogeno. Questo viene ottenuto inizialmente inibendo l'espressione di un gene dell'ospite mediante RNAi. Il secondo passaggio della procedura consiste nell'infettare i vermi trattati con RNAi con *Salmonella*.L'infezione viene interrotta trasferendo i vermi infetti su piastre di coltura con rna eye non patogeno. I passaggi finali consistono nel registrare la sopravvivenza dei vermi infetti. Calcolare la sopravvivenza da questi dati e, in ultima analisi, identificare i geni essenziali per la protezione contro Salmonella.La procedura sarà dimostrata da Julie John, una tecnica di laboratorio. Iniziare preparando le piastre di coltura necessarie. Per prima cosa, preparare le piastre di agar XLD.Sono selettivi per salmonella, che appaiono come colonie nere su queste piastre. Assicurarsi di risospendere l'agar XLD in acqua a un grammo per millilitro prima di mescolarlo nel volume completo di acqua. Non autoclavare.Questo agar è stato appena riscaldato con una piastra riscaldante. Procedere con la preparazione di piastre XLD di 95 millimetri di diametro, agg

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Ricerca

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia e Infezioni

Fonte: Chen, Y., et al. Valutazione della virulenza e della patogenesi dell'infezione da Aeromonas in un modello di Caenorhabditis elegans . J. Vis. Esp. (2018)Questo video mostra un test di sopravvivenza che utilizza C. elegans per modellare la patogenesi di Aeromonas , dove l'ingestione orale del batterio porta a infezioni intestinali e mortalità, consentendo una valutazione quantitativa della virulenza batterica in un sistema ospite vivo.

Modellazione della patogenesi di Aeromonas in C. elegans utilizzando un test di sopravvivenza

Il wormsorter facilita schermi genetiche in Caenorhabditis elegans di classificare vermi secondo l'espressione di giornalisti fluorescenti. Qui, descriviamo un nuovo utilizzo: ordinamento secondo la colonizzazione da un agente patogeno-GFP che esprimono, e ci avvaliamo di esaminare il ruolo poco compreso del riconoscimento patogeno in avvio risposte immunitarie.

Separazione automatica di<em&gt; C. elegans</em&gt; Variabilmente Colonizzato da un batterio patogeno

C. elegans è di solito coltivate su piastre di agar solidi o liquidi in colture seminate con E. coli. Per evitare sottoprodotti batterici da confondere studi tossicologici e nutrizionali, abbiamo utilizzato un mezzo liquido axenic, CeHR, crescere e sincronizzare un gran numero di vermi per una gamma di applicazioni a valle.

Culturing Caenorhabditis elegans In axeniche Liquid Media e la creazione di transgeniche Worms da microparticelle Bombardamento

Qui, presentiamo il nematode Caenorhabditis elegans come un modello versatile host per studiare l'interazione microbica.

Il Nematode Caenorhabditis Elegans - un modello Versatile In Vivo per studiare le interazioni ospite-microbo

Zebrafish (Danio rerio) stanno diventando un modello animale vertebrato ampiamente usato per colonizzazione microbica e patogenesi. Questo protocollo descrive l'uso di protozoo Paramecium caudatum come veicolo di infezione alimentare nelle larve di zebrafish. P. caudatum prontamente interiorizza batteri e ottenere ripreso da larvale zebrafish attraverso il naturale comportamento di predazione.

Utilizzando il protozoo Paramecium caudatum come veicolo di infezioni di origine alimentare nelle larve di Zebrafish

Questo protocollo descrive un modello murino di fibrosi intestinale guidata da Salmonella che assomiglia ai segni chiave della malattia patologica della malattia di Crohn, tra cui l'infiammazione transmurale e la fibrosi. Questo metodo può essere utilizzato per valutare i fattori ospiti che alterano gli esiti fibrotici utilizzando topi mutanti mantenuti su un background genetico C57Bl/6.

Infezione da Salmonella cronica Fibrosi intestinale indotta

Il seguente protocollo descrive lo sviluppo e l'ottimizzazione di un flusso di lavoro ad alto rendimento per la coltivazione di vermi, l'imaging a fluorescenza e l'elaborazione automatizzata delle immagini per quantificare gli aggregati di poliglutammina come valutazione dei cambiamenti nella proteostasi.

Automatizzare la quantificazione aggregata in Caenorhabditis elegans

L'infezione di Caenorhabditis elegans da parte del parassita microsporidiano Nematocida parisii consente ai vermi di produrre prole altamente resistente allo stesso agente patogeno. Questo è un esempio di immunità ereditaria, un fenomeno epigenetico poco compreso. Il presente protocollo descrive lo studio dell'immunità ereditaria in un modello di verme geneticamente trattabile.

Studio dell'immunità ereditaria in un modello di infezione da microsporidi di Caenorhabditis elegans

I microbi intestinali possono avere un impatto positivo o negativo sulla salute del loro ospite attraverso meccanismi specifici o conservati. Caenorhabditis elegans è una comoda piattaforma per lo screening di tali microbi. Il presente protocollo descrive lo screening ad alto rendimento di 48 isolati batterici per l'impatto sulla resistenza allo stress dei nematodi, utilizzati come proxy per la salute dei vermi.

Screening ad alta produttività di isolati microbici con impatto sulla salute di Caenorhabditis elegans

Questo protocollo descrive un'interruzione di 96 pozzi di singole Caenorhabditis elegans colonizzate battericamente a seguito di paralisi fredda e sbiancamento superficiale per rimuovere i batteri esterni. La sospensione risultante è placcata su piastre di agar per consentire una quantificazione accurata e di media produttività della carica batterica in un gran numero di singoli vermi.

Utilizzo di dati single-worm per quantificare l'eterogeneità nelle interazioni caenorhabditis elegans-batteriche

Scopri come infettare Caenorhabditis elegans con Salmonella typhimurium per studiare le interazioni ospite-patogeno. Questo protocollo utilizza l'RNA interference per identificare geni essenziali nella difesa dell'ospite.

Un protocollo Infettare

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