Un test funzionale per Gap giunzionale esame; Elettroporazione di cellule aderenti su indio-Tin Oxide

L'elettroporazione è una tecnica in cui viene applicata una corrente elettrica alle cellule vive per aprire i pori transitori sulla membrana cellulare. Attraverso questi pori, coloranti e altre molecole che normalmente non attraversano la membrana cellulare possono entrare nella cellula, i pori si richiudono rapidamente, senza danneggiare la cellula. Descriveremo come le celle aderenti possono essere elettroporate mentre crescono su un vetrino rivestito in parte con materiale elettricamente conduttivo e trasparente.

Il materiale è l'ossido di indio-stagno e, mentre conduce la corrente elettrica, apre i pori che consentono a un colorante di entrare nella cella. Quindi è possibile esaminare se le cellule hanno giunzioni gap o meno, e quante giunzioni gap sono piccoli canali che collegano l'interno delle cellule vicine e permettono il passaggio di piccole molecole. È stato a lungo riconosciuto che la comunicazione giunzionale gap ha una varietà di funzioni importanti nella cellula, tra cui la trasformazione neoplastica e le metastasi.

Benvenuti a questa presentazione di progetti cellulari su come eseguire l'elettroporazione di celle aderenti utilizzando Insitu. Questa immagine mostra, cosa che saremo in grado di fare, il colorante fluorescente sciolto per il giallo, è stato introdotto in cellule che crescono su un vetro trasparente e conduttivo. Fino a questa linea, la linea è più facile da vedere sotto contrasto di fase.

Eccolo. Si può vedere che il colorante si è diffuso attraverso giunzioni gap dalle celle a sinistra, che sono state caricate con colorante mediante elettroporazione alle celle a destra. Il risultato di questo gradiente di celle di fluorescenza sono i trippi.

Iniettato poi trasferito in una provetta in centrifuga. È molto importante che le cellule siano ben diffuse man mano che crescono nella camera. Per questo motivo, è meglio centrifugare le cellule per rimuovere eventuali tracce di tripsina.

Il terreno con tracce di tripsina viene aspirato dalle cellule che vengono risospese in circa un millilitro di terreno di crescita e quindi piastrate nella camera. La pipetta contiene la sospensione cellulare, rimuovere il coperchio dalla camera e pipettare le cellule goccia a goccia nella camera per facilitarne il trasporto. La camera è posta in una capsula di Petri di sei centimetri.

La camera torna nell'incubatore per la crescita delle cellule. Le cellule placcate si diffonderanno bene e cresceranno fino a toccarsi e a formare giunzioni a fessura. Quando le celle sono pronte per l'elettrosfilata, impostare il generatore di impulsi in situ alle condizioni desiderate.

Fare riferimento al manuale per la descrizione del semplice processo di configurazione. Quando la tensione sull'insitu è impostata, la luce rossa sulla tastiera si accende. Togliete dal bagno d'acqua le due bottiglie riscaldate di DMEM senza calcio, ma con siero dializzato, una è DMEM.

Senza calcio, tenere le pipette pronte per caricare il giallo nella pipetta. Invece del sospiro, togli le cellule dall'incubatrice. Rimuovere il prodotto capovolgendolo inizialmente nel bicchiere di lavaggio.

Quindi, tamponandolo sul lavaggio dei tessuti una volta con DMEM senza calcio, non cercare di rimuovere assolutamente tutto il DMEM perché le cellule potrebbero seccarsi. Aggiungere il giallo Lucifero con cura sulla barriera in modo da non disturbare le cellule, ma abbastanza velocemente in modo che le cellule non si secchino. Utilizzare 200 microlitri per ogni metà della camera.

Metti il coperchio sulla camera interna, quindi caricalo nel cursore. Assicurarsi che le linguette terminali della camera si inseriscano nelle fessure del cursore spingendo il cursore. Inserire la camera nel supporto della camera.

Premere il pulsante a impulsi sulla tastiera del generatore di impulsi. Il LED sul generatore di impulsi e sul supporto della camera lampeggerà in rosso durante il processo di elettroporazione e poi lampeggerà in verde per indicare che il ciclo di inizializzazione è completo. Tirare indietro il cursore sotto il supporto della camera e rimuovere la camera.

Aspirare la maggior parte del giallo Lucifero per riutilizzarlo, ma fare attenzione a non asciugare le cellule. Aggiungi DMEM senza calcio. Con il siero dializzato, il siero aiuta i porosi a chiudere la camera e a rientrare nell'incubatrice per il trasferimento del giallo di Lucifero attraverso le giunzioni delle fessure.

La tempistica deve essere coerente da un esperimento all'altro. Lo standard è di tre minuti. Versare il substrato nel becher dei rifiuti.

Aggiungere il 4% di soluzione fissante della formaldeide con una pasta o una pipetta, attendere a temperatura ambiente per almeno due minuti. Versare la formaldeide e risciacquare un paio di volte. Con il PBS, le celle sono fissate al vetro, quindi c'è poco pericolo che si stacchino durante il lavaggio.

Per poter vedere le celle sotto contrasto di fase, è importante posizionare un vetrino coprioggetti sulla parte superiore della camera. Riempi la camera con PBS formando un orgoglioso menisco. Evitando bolle d'aria, posizionare il vetrino coprioggetto.

Non preoccuparti se il PBS trabocca, basta assorbire il PBS in eccesso sul tessuto. È necessario un microscopio fluorescente invertito, preferibilmente con contrasto di fase e con un blocco filtro per il giallo Lucifero. In fase di contrasto, cercare il bordo dell'area elettroporata.

Vedrai due linee Sotto le celle di fluorescenza. Su metà del vetrino sarà fluorescente intensamente. La linea più vicina alle celle incandescenti è il bordo dell'area elettroporata.

Qualsiasi fluorescenza oltre a quella è dovuta al trasferimento del giallo lucer attraverso le giunzioni delle fessure. Ad esempio, questa immagine di cellule epiteliali mostra cellule che sono state elettrolitiche sul lato sinistro dell'immagine, trasferendo il giallo di Lucifero alle cellule non elettroporate vicine, creando un gradiente di cellule incandescenti dal bordo del rivestimento conduttivo verso destra. Questa immagine mostra lo stesso fotogramma di celle sotto contrasto di fase.

Si noti che è possibile vedere la linea X molto chiaramente. Una misura quantitativa della quantità di trasferimento giunzionale del gap può essere effettuata manualmente lavorando con le immagini fluorescenti e a contrasto di fase delle celle elettroporate. Le stelle lungo il bordo dell'area conduttiva sono considerate cellule donatrici.

Sono stati elettroporati e portati via per il giallo. Passano luc per giallo alle celle vicine a destra, che lo passano. Ancora di più in quantità decrescenti.

Il rapporto tra i punti e le stelle di 41 a otto in questo caso può produrre un numero per confrontare quanto sia esteso il trasferimento giunzionale gap in questo caso. 5.1 è l'indice di giunzione gap. Un'alternativa alla marcatura e al conteggio manuale delle celle consiste nell'utilizzare un software di analisi delle immagini per misurare le quantità relative di incandescenza lungo il lato non eletto del bordo di una cella elettroporata.

Queste celle non hanno giunzioni gap. Ecco il bordo destro dell'area elettroporata. Si noti che non esiste un gradiente di fluorescenza, il che indica l'assenza di giunzioni gap sotto contrasto di fase.

Puoi vedere chiaramente tutte le celle. Si noti che anche la linea X è chiaramente visibile. In questo esempio.

Tutte le cellule della camera sono state stimolate con il fattore di crescita epidermico EGF e 10 minuti dopo fissate e sondate per l'arco fosfo. Si noti che le cellule colorate a destra non sono state elettroporate e le celle a sinistra fino a questa linea sono state elettroporizzate. Le cellule non elettroporate mostrano una colorazione marrone con un anticorpo fosfoirk e immunoperossidasi.

Le celle elettroporate non mostrano colorazione poiché il peptide fosfoopatico elettroporato ha bloccato il dominio SSH due di grab two e ha inibito la fosforilazione di IRK di EGF. Si noti che la regione di tre o quattro celle a destra della linea in cui le celle non erano elettro ma non mostrano colorazioni. Si tratta di cellule che hanno acquisito il peptide bloccante dai loro vicini elettroporati tramite giunzioni gap.

Questa è la dimostrazione più potente possibile che l'inibizione del segnale deve essere dovuta al peptide e non può essere un artefatto dell'elettroporazione. Poiché queste celle non sono elettroporate, questo è lo stesso fotogramma mostrato sotto contrasto di fase. Si noti l'assenza di qualsiasi cambiamento nella morfologia dopo l'elettroporazione.

Con alcuni pazienti gap la comunicazione giunzionale può essere quantitativa proprio in una grande varietà di cellule in coltura. L'introduzione di peptidi per interrompere specifiche vie di segnalazione è un approccio potente per valutare la rilevanza nelle cellule vive delle interazioni proteiche e proteiche che sono state identificate con proteine purificate. Questo può essere il primo passo importante nello sviluppo di farmaci peptid dome.