RNA Catalyst come reporter per lo screening dei farmaci contro l'RNA Editing in tripanosomi
22 luglio 2014
In questo articolo viene descritto un test altamente sensibile basato su ribozima, applicabile allo screening ad alto rendimento di sostanze chimiche mirate al processo unico di editing dell'RNA nei patogeni tripanosomatidi. Gli inibitori possono essere utilizzati come strumenti per l'analisi basata su ipotesi del processo di editing dell'RNA e, in ultima analisi, come terapie.
L'obiettivo generale di questa procedura è quello di analizzare l'editing dell'RNA utilizzando omi funzionali estratti da Trias Broce per una rapida identificazione degli inibitori degli omi. Ciò si ottiene isolando prima i mitocondri e le zone di edto bersaglio dal tbr. Il secondo passo consiste nel preparare il substrato reporter per l'editing dell'RNA sintetico.
I composti successivi vengono sottoposti a legame con zone edito purificate, insieme al reporter di editing dell'RNA. In presenza di composti che bloccano la funzione delle zone edito, l'RNA reporter non subirà editing e rimarrà inattivo. Il passaggio finale consiste nell'aggiungere il substrato del filo F e monitorare la capacità del reporter di editing dell'RNA di scindere selettivamente e specificamente questo substrato.
Nel caso di un composto inibitorio, l'editing dell'RNA viene bloccato e viene rilevato un segnale fluorescente ridotto o assente. In definitiva, una macchina PCR in tempo reale viene utilizzata per monitorare la fluorescenza emessa dal substrato del tasto in funzione del tempo. Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai saggi convenzionali di editing in vitro è che si tratta di un test reporter basato su fluorescenza semplice e rapido che può essere utilizzato per lo screening ad alto rendimento di composti chimici rispetto all'editing dell'RNA.
Per iniziare, preparare il terreno di coltura per le cellule in forma aciclica tusi pro come descritto nel protocollo di testo allegato. Quindi, coltiva 300 millilitri di TBRC 1.7. Un tipo selvatico pro aciclico forma celle a 28 gradi Celsius mentre le agita a 70 RPM per 48 ore.
Una volta che le cellule hanno raggiunto una densità di 1,5 volte 10 al settimo di cellule per millilitro, centrifugare le celle a 6.000 GS per 10 minuti a quattro gradi Celsius. Quindi lavare il pellet con 50 millilitri di fosfato refrigerato, soluzione salina tampone, glucosio o tampone PBSG e centrifugare le celle a 10.000 Gs per 10 minuti a quattro gradi Celsius. In primo luogo, sospendiamo le cellule raccolte in 30 millilitri di tampone DTE, distruggiamo la membrana cellulare utilizzando un omogeneizzatore sterile pre-raffreddato da 40 millilitri 10 volte su ghiaccio.
Successivamente, immediatamente a 4,3 millilitri di saccarosio al 60% nell'omogeneizzato e centrifugare. La soluzione a 15.800 Gs per 10 minuti a quattro gradi Celsius. Per abbattere i mitocondri, sospendere nuovamente il pellet mitocondriale in 4,6 millilitri di tampone STM.
Quindi aggiungere 13,8 microlitri di cloruro di calcio molare 0,1 e quattro microlitri di DNA libero da RNA e incubare la miscela per un'ora sul ghiaccio. Successivamente, inattivare i DNA aggiungendo 4,6 millilitri di tampone STE e centrifugare la miscela a 15.800 G per 10 minuti a quattro gradi Celsius. Quindi risospendere il pellet in 400 microlitri di tampone di lisi e trasferire la miscela in un tubo micro fuge.
Aggiungere il 10% di Triton X 100 alla provetta a una concentrazione finale dell'1% e incubare il lisato a quattro gradi Celsius su un rotatore per provette per 15 minuti. Quindi eliminare il lisato dei mitocondri centrifugando la soluzione due volte a 17.000 G per 15 minuti a quattro gradi Celsius e conservare ogni volta la fessura ripulita. Versare un gradiente di glicerolo lineare da 10 millilitri, dal 10% al 30%, in una provetta per ultracentrifuga utilizzando due tamponi di gradiente XHHE e un pennarello di gradiente seguendo le istruzioni nel manuale.
Quindi, rimuovere con cautela 500 microlitri di soluzione dalla parte superiore del gradiente di glicerolo e caricare delicatamente 500 microlitri di lisato mitocondriale chiarito nella provetta dell'ultracentrifuga. Far girare il tubo a 178.000 GS per sei ore a quattro gradi Celsius. Raccogli 500 frazioni di microlitri in sequenza dall'alto verso il basso del gradiente a quattro gradi Celsius.
Quindi spezzare, congelare le frazioni utilizzando azoto liquido e conservarle a meno 80 gradi Celsius. Anil il rispettivo modello di DNA contenente la sequenza complementare T sette in un rapporto molare uno a uno. Successivamente, trascrivi l'RNA utilizzando un kit di trascrizione in vitro e segui il manuale di istruzioni.
Arrestare la reazione di trascrizione aggiungendo un volume uguale di colorante ureico a sette molari. Funziona con un gel di poliacrilammide denaturante al 9% sterilizzato con filtro. Quindi utilizzare una lampada UV a onde corte per localizzare e asportare il rispettivo RNA.
Posizionare il pezzo di gel asportato in una provetta per microfusibili e aggiungere 400 microlitri di tampone di eluizione in gel, eluire l'RNA per una notte a temperatura ambiente su un rotatore di provette. Successivamente, precipitare l'RNA eluito aggiungendo un millilitro di etanolo freddo al 100% e incubando a meno 20 gradi Celsius per 30 minuti. Centrifugare la miscela a 16.000 GS per 30 minuti a quattro gradi Celsius per eliminare l'RNA.
Quindi lavare il pellet con un millilitro di etanolo al 75% e centrifugare la provetta a 16 GS per 20 minuti a quattro gradi Celsius. Successivamente, sospendiamo il pellet di RNA in acqua priva di RNA per ottenere le concentrazioni desiderate utilizzando le proporzioni elencate. Iniziare il test combinando un microlitro di pre A sei RBZ e un microlitro di GA sei RBZ in una provetta per microfuge.
Incubare la soluzione a 70 gradi Celsius per tre minuti e lasciarla riposare a temperatura ambiente per 10 minuti. Quindi, prepara un master mix e aggiungi l'anil pre A sei RBZ e GA sei RBZ al mix. Infine, erogare 18 microlitri della miscela master nei pozzetti.
Quindi, sigillare la piastra con un sigillante per piastre e ruotarla verso il basso per rimuovere eventuali bolle d'aria. Quindi incubare la piastra a 28 gradi Celsius per quattro ore dopo l'incubazione a due microlitri di concorrente GA sei RBZ. Per ciascuno, posizionare un nuovo sigillo sulla piastra, quindi girarlo ed eseguire la PCR in tempo reale con il seguente programma.
Una volta completato il programma, aggiungere un microlitro di substrato per tasti a ciascun pozzetto fino a un volume finale di 23 microlitri e sigillare la piastra con un sigillo fresco. Girare rapidamente la piastra e riposizionarla nella macchina per PCR in tempo reale. Successivamente, programma un nuovo esperimento con i seguenti passaggi.
Impostare quindi la piastra selezionando tutti i pozzetti che richiedono la lettura e scegliere il filtro FAM. Impostare il volume di ingresso su 23 microlitri e iniziare la corsa. Infine, calcolare la pendenza dei valori ottenuti da ciascun campione per ottenere una misurazione cinetica tracciando le pendenze su un grafico a barre per l'analisi.
Al fine di determinare la qualità di questo test, è stato calcolato il rapporto segnale/rumore di diversi substrati. I substrati per tasti con il Tamara Quinter e l'Iowa Black dark Quinter sono entrambe opzioni valide per l'uso in un vaglio ad alta produttività. Le frazioni del gradiente di glicerolo sono state testate per l'attività di editing in vitro utilizzando il saggio basato sulla fluorescenza, le frazioni più attive possono essere combinate quando è richiesta una zona di modifica più ampia.
Sono stati utilizzati diversi campioni di controllo per analizzare le variabili nelle reazioni di saggio, mancando qualsiasi componente di editing dell'RNA. Cleve la scissione del substrato si osserva in presenza di tutti i componenti delle reazioni di editing, in assenza di un inibitore o in presenza di tutti i componenti di editing e di un composto inattivo. Al contrario, un composto inibitorio può bloccare l'editing dell'RNA e viene utilizzato come controllo positivo durante il tentativo di questa procedura.
È importante mantenere un ambiente privo di RNA e proteggere il più possibile il substrato del fret e i composti sensibili alla luce dalla luce.
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Panoramica
Questo articolo presenta un saggio in vitro rapido basato sulla fluorescenza per il monitoraggio della modifica dell'RNA mitocondriale nei tripanosomi. Il metodo consente lo screening ad alto rendimento di composti chimici che potrebbero inibire il complesso editosoma, fornendo uno strumento prezioso per analizzare la funzione e l'assemblaggio dell'editosoma. Il saggio utilizza un sistema reporter di ribozima hammerhead basato sul trasferimento di energia per risonanza a fluorescenza (FRET), in cui l'attività di modifica dell'RNA produce un segnale fluorescente misurabile.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Biologia molecolare
- Modificazione dell'RNA
- Parassitologia
Sfondo
- La modifica dell'RNA mitocondriale nei tripanosomi è catalizzata dal complesso editosoma.
- Comprendere l'interazione tra i componenti dell'editosoma rimane una sfida.
- I tradizionali saggi di editing dell'RNA con marcatura radioattiva sono lunghi e non adatti per schermature ad alto rendimento.
- Sono necessarie nuove sonde chimiche per studiare la funzione e l'assemblaggio dell'editosoma.
Scopo dello studio
- Sviluppare un saggio sensibile, rapido e compatibile con l'alta produttività per la modifica dell'RNA in vitro.
- Permettere lo screening di composti chimici che inibiscono l'attività dell'editosoma.
- Fornire uno strumento per l'analisi funzionale del complesso editosoma.
Metodi Utilizzati
- Isolamento di mitocondri e complessi editosoma da cellule di Trypanosoma brucei.
- Preparazione di substrati sintetici per la segnalazione dell'editing dell'RNA mediante trascrizione in vitro e purificazione su gel.
- Assemblaggio di un sistema di segnalazione a ribozima hammerhead basato sul trasferimento di risonanza energetica a fluorescenza (FRET).
- Incubazione di frazioni di editosoma con RNA segnalatore e composti candidati in formato microplaca.
- Misurazione in tempo reale della fluorescenza mediante macchina PCR per monitorare l'attività di editing dell'RNA.
- Analisi dei dati mediante il calcolo delle pendenze cinetiche e dei rapporti segnale-rumore.
Risultati principali
- Il saggio basato sulla fluorescenza rileva in modo affidabile l'attività di editing dell'RNA in vitro.
- Composti inibitori bloccano l'editing dell'RNA, determinando una riduzione o l'assenza di segnali fluorescenti.
- Il saggio è compatibile con lo screening ad alto rendimento e consente una chiara differenziazione tra campioni attivi e inattivi.
- Esperimenti di controllo confermano la specificità e la sensibilità del saggio.
Conclusioni
- Questo saggio basato sul FRET offre un metodo semplice, rapido e sensibile per monitorare la modifica dell'RNA nei tripanosomi.
- È particolarmente adatto per lo screening ad alto rendimento di inibitori dell'editosoma.
- L'approccio facilita ulteriori indagini sui meccanismi molecolari della modifica dell'RNA e sull'assemblaggio dell'editosoma.
Domande Frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
L'identificazione ad alto rendimento di inibitori mirati al complesso editosoma del tripanosoma è fondamentale per promuovere la scoperta di farmaci antiparassitari e ridurre i rischi meccanicistici nella biologia della modifica dell'RNA. Il saggio fluorimetrico con reporter a ribozima hammerhead consente lo screening rapido e quantitativo di librerie chimiche, supportando la validazione precoce del bersaglio e l'analisi funzionale del complesso editosoma. Questa piattaforma aumenta l'affidabilità predittiva e facilita la selezione dei programmi terapeutici incentrati sulla modifica dell'RNA.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Target
- Consente l'interrogazione funzionale del complesso editosoma in un sistema in vitro controllato.
- Supporta la riduzione dei rischi biologici collegando direttamente l'attività del composto all'inibizione della modifica dell'RNA.
- Facilita il triage rapido di sonde chimiche per studi meccanicistici e validazione del bersaglio.
Sviluppo di screening e saggi
- Fornisce un formato di saggio omogeneo, basato su un semplice mixaggio e misurazione, adatto allo screening ad alto rendimento di composti.
- Offre letture quantitative e riproducibili mediante fluorescenza, per una standardizzazione del saggio affidabile.
- Accelera i cicli di sviluppo del saggio eliminando l'uso di radioattività e flussi di lavoro complessi.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Permette l'identificazione di composti modello per studi meccanicistici e traslazionali successivi.
- Garantisce continuità dalla fase iniziale di scoperta alla validazione preclinica fornendo sonde molecolari utilizzabili.
- Riduce il rischio di fallimento in fasi avanzate chiarificando la funzione dell'editosoma e la specificità degli inibitori.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Questo saggio basato sul FRET si integra nell'interfaccia tra la fase iniziale della scoperta e l'identificazione dei composti promettenti, fornendo una piattaforma scalabile per lo screening, la validazione dei risultati positivi e il follow-up meccanicistico nella ricerca sulla modifica dell'RNA.
- Biologia della scoperta: Supporta test basati su ipotesi riguardo alla funzione dell'editosoma e all'impatto degli inibitori.
- Screening: Fornisce output quantitativi ad alto rendimento per la priorizzazione di composti.
- Analisi: Permette misurazioni cinetiche e analisi comparativa dell'efficacia degli inibitori.
- Ricerca traslazionale: Fornisce composti strumentali validati per ulteriori studi biologici e pertinenti alle malattie.
- Riutilizzo aziendale: Offre una piattaforma saggistica riutilizzabile, adattabile a diversi bersagli di editing dell'RNA e librerie di composti.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Aumenta la fiducia predittiva nell'interazione con il bersaglio e nella riduzione del rischio meccanicistico.
- Valore operativo: Razionalizza i flussi di lavoro mediante formati sperimentali standardizzati, scalabili e non radioattivi.
- Valore strategico: Migliora il processo decisionale di avanzamento o interruzione e l'allocazione del capitale nei portafogli della fase iniziale.
- Impatto sul portafoglio: Consente l'avanzamento e la priorizzazione, corretti per il rischio, di attività mirate alla modifica dell'RNA.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze in biochimica dell'RNA e nello sviluppo di saggi fluorimetrici.
- Necessita dell'accesso a strumenti di PCR in tempo reale o lettori di piastre a fluorescenza per misurazioni cinetiche.
- Richiede condizioni di laboratorio rigorosamente prive di RNA e protette dalla luce per garantire l'affidabilità del saggio.
- Potrebbe essere necessaria un'adattamento del saggio per diverse varianti dell'editosoma o substrati a RNA.
- Gli esperimenti di controllo sono essenziali per validare la specificità e ridurre al minimo i falsi positivi.
