Name: Della media di Viral Busta Glicoproteina Spikes da Electron Cryotomography Ricostruzioni con Jsubtomo (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-10-21T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 29 s
Description: Scopri la media delle glicoproteine virali con cryotomografia elettronica e Jsubtomo. Questo metodo computazionale consente di risolvere strutture di spike a 35 angstrom, fondamentale per la biologia strutturale e la progettazione di farmaci antivirali.

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Questo lavoro è stato sostenuto dall'Accademia di Finlandia (130750 e 218080 a J.T.H.), dal Wellcome Trust (090532/Z/09/Z; 089026/Z/09/Z a T.A.B.), e dall'MRC (MR/J007897/1 a J.T.H e T.A.B; MR/L009528/1 a T.A.B.).

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</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

<html> La conoscenza della struttura glicoproteina virale punta sulla membrana virione è essenziale per comprendere la replicazione del virus e lo sviluppo di terapie per trattare e prevenire le infezioni. Electron crio-microscopia combinata con un&#39;unica media delle particelle è emerso come il metodo più utilizzato per risolvere le strutture di particelle del virus con involucro, comprese le punte glicoproteina. Tuttavia, questo metodo è limitato a icosahedrally virus simmetrici. Qui, attraverso l&#39;applicazione di elettroni tomografia crio-e subtomogram media in Jsubtomo, abbiamo delineato un protocollo generale per determinare picchi glicoproteina su pleomorfo avvolto virus che non sono suscettibili di altre correnti metodi di biologia strutturale. I nostri risultati rappresentativi dimostrano che la risoluzione di questo metodo è sufficiente a rivelare intuizioni architettura di dominio, oligomerizzazione, e l&#39;organizzazione di ordine superiore di punte glicoproteina su virioni intatti. jove_content &quot;&gt; La fase più critica all&#39;interno di questo protocollo sta costruendo due modelli di partenza affidabili che sono statisticamente indipendenti gli uni dagli altri. esecuzione di questa operazione presuppone che picchi glicoproteina sono sufficientemente grandi e non ammassata contro l&#39;altro troppo stretto, in modo che i singoli picchi può essere riconosciute visivamente e manualmente raccolte nel tomogrammi, e due modelli indipendenti media. Se ciò non è fattibile, due modifiche al protocollo possono essere tentate. Innanzitutto, due modelli casuali indipendenti possono essere costruiti in primo luogo la definizione di due sottoinsiemi casuali di subtomograms e poi media dei subtomograms all&#39;interno di questi sottoinsiemi 30. secondo luogo, se una struttura del picco isolato è stato ricavato con altri mezzi, ad esempio cristallografia a raggi X, può essere utilizzato come modello di partenza. Tuttavia, la cura deve essere presa per bassa filtro passa questo modello utilizzando un cut-off a bassa risoluzione (50-70 Å), come i due modelli risultanti nel prossimo turno di raffinatezza volontàessere statisticamente indipendenti solo oltre questa risoluzione. A causa di questo avvertimento, si raccomanda il primo approccio. La risoluzione ottenibile da questo protocollo dipende da quattro fattori principali: i. strategia di raccolta dei dati e la qualità dei dati in ingresso, ii. numero di subtomograms, iii. precisione di allineamento dei subtomograms, e iv. eterogeneità delle strutture. Mentre il primo e il secondo limite può essere ampiamente superato utilizzando rivelatori elevati segnale-rumore scalo elettroni combinati con CTF corretto tomografia e raccolta dati automatizzata, la precisione di allineamento è ulteriormente influenzata dalla dimensione e la forma della struttura di interesse stesso. Quando si applica questo protocollo sulle piccole punte prive di caratteristiche di spicco, può essere vantaggioso per legare i frammenti Fab per il picco di migliorare la precisione di allineamento e, quindi, la risoluzione 31. Infine, se le strutture siano in media presentano molteplici conformazioni, sub-TomogrMetodi di classificazione am possono essere utilizzati a media differenti conformazioni separatamente. A tal fine, Jsubtomo si integra con il pacchetto Dynamo, offrendo classificazione potente subtomogram 9. Il protocollo di cui sopra è complementare alla cristallografia a raggi X di glicoproteine ​​virali isolati. Strutture cristallografiche possono essere inseriti nelle medie sub-tomogramma per ottenere l&#39;orientamento preciso della glicoproteina rispetto alla membrana virione. L&#39;applicazione di questa metodologia sarà senza dubbio continuerà a far luce sulla struttura del virus avvolto e patobiologia.

Electron crio-tomografia è una tecnica di imaging elettronico crio-microscopia che permette il calcolo di una tridimensionale (3D) ricostruzione di campioni biologici complessi. I campioni idonei vanno da complessi macromolecolari purificate 1, 2 filamenti, vescicole rivestite 3, e virus membrana pleomorfi 4 a intere cellule procariote 5 e anche le aree sottili di intere cellule eucariotiche 6. Dopo la raccolta dei dati di un tilt-serie, volumi tomografiche 3D, o tomografie, può essere calcolato utilizzando diversi pacchetti software affermati, tra cui Bsoft 7 e IMOD 8. Due aspetti inerenti allo studio di campioni biologici dal limite elettroni tomografia crio-l&#39;interpretazione biologica dei corrispondenti volumi tomografiche. In primo luogo, a causa della dose di elettroni limitata che può essere applicato a materiali biologici prima di introdurre significativi danni da radiazioni, signaL-to-noise ratio nei dati tomografici sono in genere molto bassi. In secondo luogo, a causa della geometria del campione limitato inclinazione durante la raccolta dei dati, alcune viste dell&#39;oggetto rimangono assenti, portando ad un cosiddetto artefatto &#39;cuneo mancante&#39; nel volume tomografica. Tuttavia, entrambi questi limiti possono essere superati se il volume tomografica contiene ripetendo strutture identiche, come i complessi macromolecolari, che possono essere correttamente mediate 9-12. Prima di una media struttura di ricostruzioni tomogramma, oggetti di interesse devono essere trovate e allineati allo stesso orientamento. Individuazione tali strutture può essere raggiunto mediante cross-correlazione di una struttura modello nel volume tomografica utilizzando un approccio spesso indicato come modello di corrispondenza 13. Il modello utilizzato in questo processo di corrispondenza può essere derivata da elettroni crio-microscopia elettronica o crio-tomografia combinata con ricostruzione 3D, oppure può essere una mappa di densità simulato dauna struttura atomica. Alcuni pacchetti computazionali sono stati sviluppati per svolgere questi compiti 11. Della media dei picchi glicoproteina di membrana di virus, come l&#39;HIV-1, è stato un approccio particolarmente efficace per studiare la loro struttura 14-16. La comprensione della struttura è integrale per rivelare sia le basi molecolari delle interazioni virus-ospite e guidare lo sviluppo di design antivirali e di vaccini. Mentre la cristallografia macromolecolare è la tecnica di scelta per alta risoluzione (generalmente migliore di 4 Å) analisi strutturale delle singole glicoproteine ​​virali e loro complessi, le strutture raggi X risultanti da tale metodo di proteine ​​isolate dall&#39;ambiente membranosa naturale sul virione . Così, dettagli importanti come l&#39;architettura ordine superiore di glicoproteine ​​virali, nel contesto del virione, rimangono privi. D&#39;altra parte, elettrone crio-microscopia e singola particella ricostruzionedi intere virus con involucro è limitato a virioni con simmetria icosaedrica 17,18. Electron cryotomography combinato con l&#39;allineamento sub-volume è dunque emerso come tecnica complementare che permette lo studio dei picchi glicoproteina di forma irregolare, virus pleomorphic in situ. Abbiamo sviluppato un software chiamato Jsubtomo (www.opic.ox.ac.uk/jsubtomo) per la rilevazione, l&#39;allineamento e la media dei tomografiche sotto-volumi. Jsubtomo è stato utilizzato nella determinazione della struttura di un certo numero di strutture cellulari e virali 19-26. Qui, descriviamo un protocollo dettagliato, che permette alle strutture di picco virale di superficie determinazione. Per aggirare over-raffinamento di strutture mediati correlando rumore, il regime di perfezionamento &#39;gold standard&#39; è adottato 10,27. Infine, le strategie per la visualizzazione e l&#39;interpretazione dei risultati tipici sono discussi.

<table><tbody><tr><td>Jsubtomo (ver 1.3.1)</td><td>Università di Oxford</td><td>n/a</td><td>www.opic.ac.uk/jsubtomo</td></tr><tr><td>Bsoft (ver 1.8.7)</td><td>NIAMS, NIH</td><td>n/a</td><td>bsoft.ws</td></tr><tr><td>UCSF Chimera</td><td>UCSF</td><td>n/a</td><td>www.cgl.ucsf.edu/chimera</td></tr></tbody></table>

della media di viral busta glicoproteina spikes da electron cryotomography ricostruzioni con jsubtomo

Averaging of Viral Envelope Glycoprotein Spikes from Electron Cryotomography Reconstructions using Jsubtomo

Virus con involucro utilizzano glicoproteine ​​di membrana sulla superficie di mediare l&#39;ingresso nelle cellule ospiti. Tridimensionale analisi strutturale di queste glicoproteina &#39;punte&#39; è spesso tecnicamente impegnativo, ma importante per comprendere la patogenesi virale e nella progettazione di farmaci. Qui, un protocollo viene presentato per la determinazione della struttura virale picco attraverso media computazionale di elettroni dati crio-tomografia. Electron crio-tomografia è una tecnica di microscopia elettronica utilizzata per ricavare tridimensionali ricostruzioni tomografiche di volume, o tomografie, di campioni biologici pleomorfi come virus membrana in uno stato congelato-idratato quasi native. Queste tomografie rivelano strutture di interesse in tre dimensioni, anche se a bassa risoluzione. Media computazionale dei sotto-volumi, o sub-tomografie, è necessario per ottenere maggiore dettaglio la risoluzione di ripetere motivi strutturali, come ad esempio i picchi glicoproteina virale. Un approccio computazionale dettagliato per aligning e media sub-tomogrammi utilizzando il pacchetto software Jsubtomo è delineato. Questo approccio consente la visualizzazione della struttura di picchi glicoproteine ​​virali di risoluzione nell&#39;intervallo 20-40 Å e studio dello studio di ordine superiore picco-a-picco interazioni sulla membrana virione. I risultati tipici sono presentati per Bunyamwera virus, un virus con involucro della famiglia Bunyaviridae. Questa famiglia è un gruppo strutturalmente eterogeneo di agenti patogeni che costituiscono una minaccia per la salute umana e animale.

Dimostriamo l&#39;applicazione del flusso di lavoro media sub-tomogramma sopra descritta per il complesso busta glicoproteina del virus Bunyamwera (Orthobunyavirus, Bunyaviridae) utilizzando un set di dati precedentemente pubblicati 24. Parametri di raccolta dei dati e la raffinatezza sono elencate nella Tabella 1. Una tomogram rappresentativo è mostrato nella Figura 2. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> Parametri (unità) </td><td> Valore </td></tr><tr><td> La raccolta dei dati </td><td></td></tr><tr><td> Tensione (kV) </td><td> 300 </td></tr><tr><td> Ingrandimento calibrato (X) </td><td> 111.000 </td></tr><tr><td> Dimensione del pixel (Å) </td><td> 5.4 </td></tr><tr><td> Dose stimata (e - / A 2) </td><td> 100 </td></tr><tr><td> Underfocus (micron) </td><td> 4,0-4,5 </td&gt; </tr><tr><td> Prima di zero CTF (Å) un </td><td> 26-30 </td></tr><tr><td> Intervallo inclinazione (°) </td><td> -60-60 </td></tr><tr><td> Campionamento Tilt (°) </td><td> 3 </td></tr><tr><td> Dati e raffinatezza </td><td></td></tr><tr><td> Tomogrammi </td><td> 11 </td></tr><tr><td> Virioni </td><td> 29 </td></tr><tr><td> Semi per virione </td><td> 106 </td></tr><tr><td> Numero totale di semi </td><td> 3.074 </td></tr><tr><td> Spikes rilevati </td><td> 1.346 </td></tr><tr><td> Spikes dopo la rimozione di sovrapposizioni </td><td> 1.401 </td></tr><tr><td> Spikes dopo selezione basata cross-correlazione </td><td> 1.022 </td></tr><tr><td> Spikes inclusi nella media finale </td><td> 1.022 </td></tr><tr><td> Simmetria </td><td> C3 </td></tr><tr><td> Campionamento angolare (°) </td><td> 8 </td></tr><tr><td> Risoluzioneintervallo utilizzato nella raffinatezza (Å) </td><td> 42-334 </td></tr><tr><td> Stima risoluzione finale (A) B </td><td> 35 </td></tr></tbody></table> Tabella 1: raccolta di dati e statistiche Bunyamwera raffinatezza. un CTF, funzione di trasferimento di contrasto. b Calcolato utilizzando Fourier shell correlazione tra due strutture indipendenti raffinati ad una soglia di 0.143. <img alt="Figura 2" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/51714/51714fig2highres.jpg" width="600" /> Figura 2:. Fetta attraverso una tomografia di virioni Bunyamwera Diverse viste laterali picco evidenti nella periferia di ogni virione sono indicati con frecce. Il tomogramma è stato filtrato passa-basso a 60 Å. Barra di scala 100 nm. In primo luogo, abbiamo perfezionato un modello iniziale con 205 punte raccolte manualmente ( <strong&gt; Figura 3). Tre volte la simmetria del centro-picco più era evidente senza applicare alcuna simmetria (Figura 3B) ed è stato imposto nei successivi cicli di perfezionamento (Figura 3C). Per rilevare automaticamente tutte le punte sulle superfici virione, abbiamo generato 106 semi per ogni virione al raggio di 43 nm e la spaziatura di 20 gradi (Figura 4A) e iterativamente perfezionato le loro posizioni rispetto alla membrana (Figura 4B). <img alt="Figura 3" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/51714/51714fig3highres.jpg" width="600" /> Figura 3: affinamento della struttura iniziale del modello. (A) cilindrica media (C100) modello costruito da posizioni definite manualmente di picchi. (B) In media densità dopo cinque turni di raffinatezza senza alcuna simmetria (C1) ha imposto mostra un picco con triplicecaratteristiche simmetriche. La risoluzione del modello è di 48 Å. (C) media del picco è stato risolto a 41 Å dopo cinque turni di raffinatezza con triplice simmetria. <img alt="Figura 4" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/51714/51714fig4highres.jpg" width="600" /> Figura 4:. Affinamento dei semi AB) Un sottoinsieme di semi prima (A) e dopo B) affinamento (sono mostrate su una densità virione dalla figura 2 Semi in (B) sono stati codice colore in base ai rispettivi incrociata. coefficienti di correlazione (blu, bassa correlazione, rosso, alta correlazione). Le migliori patch correlando glicoproteina picco (superiore al 75% dopo la rimozione di sovrapposizioni; ~ 1.000 picchi) sono stati utilizzati per calcolare la media finale. La media è stato risolto a 35-risoluzione (Figura 5). Ha rivelato una struttura picco trimeric nel mezzo, inOltre a qualche contributo da sei picchi vicini. Modelli compositi dei virioni, calcolato ponendo la struttura nelle posizioni note, rivelato posizionamento dei picchi sulla superficie del virione (Figura 6A). Di tanto in tanto, le patch in ordine localmente di picchi erano evidenti (Figura 6B). <img alt="Figura 5" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/51714/51714fig5highres.jpg" width="600" /> Figura 5: struttura raffinata di una patch dello strato glicoproteina picco dopo il modello corrispondente. (AB) Due mappe &#39;anche&#39; e &#39;strano&#39;, ricostruiti da due metà dei dati vengono visualizzati. Le due mappe mostrano un notevole grado di somiglianza, verificare la Validità dell&#39;approccio. L&#39;orientamento intorno all&#39;asse lungo picco è diversa in quanto le due mappe sono state ricostruite completamente indipendente l&#39;uno dall&#39;altro. (C) media delle due mappe è mostrato inla risoluzione finale di 35 Å. <img alt="Figura 6" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/51714/51714fig6highres.jpg" width="600" /> Figura 6: Posizionamento delle punte sul virione Bunyamwera. (A) modello composito di un virione. Vedi vettori (bastoni) indicano gli orientamenti delle punte. I colori indicano la cross-correlazione tra ogni picco e la struttura del modello (blu, bassa correlazione, rosso, alta correlazione). (B) A close-up di una patch ordinata di picchi.

Viene presentato un approccio per determinare le strutture dei complessi glicoproteici di membrana virale utilizzando una combinazione di crio-tomografia elettronica e media del sottotomogramma con il pacchetto computazionale Jsubtomo.

Della media di Viral Busta Glicoproteina Spikes da Electron Cryotomography Ricostruzioni con Jsubtomo

Enveloped viruses utilize membrane glycoproteins on their surface to mediate entry into host cells. Three-dimensional structural analysis of these ...

L'obiettivo generale di questa procedura è studiare le strutture dei complessi glicoproteici presenti sulle superfici dei virus rivestiti. Questo viene raggiunto innanzitutto localizzando le particelle virali nei volumi tomografici precedentemente calcolati a partire dai dati di microscopia elettronica criogenica. Il secondo passaggio consiste nel creare due modelli iniziali statisticamente indipendenti dei complessi glicoproteici utilizzando un sottoinsieme di dati definito manualmente.Successivamente, questi modelli vengono perfezionati e utilizzati per rilevare automaticamente tutti i complessi glicoproteici sulle particelle virali. L'ultimo passaggio consiste nel perfezionare la struttura del complesso glicoproteico utilizzando l'intero set di dati. Infine, si utilizzano strumenti di visualizzazione molecolare per interpretare la struttura finale.L'analisi strutturale tridimensionale di queste sporgenze glicoproteiche è di grande valore per comprendere la patogenesi virale e per la progettazione di farmaci. Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti, come la cristallografia a raggi X, è che consente di risolvere le strutture di proteine di membrana nell'ambiente membranoso naturale. Questa tecnica può contribuire ad affrontare argomenti fondamentali nella biologia strutturale.Ad esempio, la struttura di molti virus contenenti membrane. Sebbene questa tecnica possa fornire informazioni sui complessi di glicoproteine in questi virus, può essere applicata anche ad altri sistemi, come proteine di membrana incorporate in liposomi. La procedura sarà dimostrata da due membri del mio gruppo, Slee e David Bittel.Per iniziare, aprire un file di autogramma in B show. Selezionare manualmente le particelle virali nei grammi definendo la coordinata centrale di una particella virale mediante lo strumento di selezione delle particelle. Ripetere questo passaggio fino a quando tutte le varianti sono state elaborate.Salvare le coordinate del virus in un file star. Procedere ripetendo questo processo per tutte le tomografie. Successivamente, eseguire J sub tomo py in modalità estrazione per estrarre le varie sotto-volumenti in file volumetrici individuali, utilizzando i file star salvati come file di input per generare due modelli iniziali indipendenti.Aprire innanzitutto il file della mappa del sottovolume ovarico. In B mostra. Selezionare un sottoinsieme di picchi nei sottovolumi Varian definendo la coordinata centrale di un picco mediante lo strumento di selezione delle particelle accessibile tramite la finestra della barra degli strumenti.Ripetere questo passaggio fino a quando non sono state elaborate tutte le punte chiaramente distinte. Salvare le coordinate delle punte in un file star. Ripetere questo passaggio fino a quando non sono state elaborate circa 200 punte di glicoproteine.Dopo aver assegnato le viste ai varians come descritto nel protocollo del testo, crea una maschera nello spazio reale utilizzando J sub tomo. Crea maschera py. Quindi genera una maschera nello spazio reciproco utilizzando J sub tomo crea maschera cuneo py.La maschera dello spazio reciproco viene utilizzata per escludere le regioni nella zona del cuneo mancante, risultante dall'acquisizione di dati tomografici con un solo asse. Successivamente, creare due medie iniziali utilizzando J.Sub tomo per generare medie. PY, usando un file di selezione salvato come file di input.Utilizzare l'iterazione per ridurre il rumore nelle medie iniziali, allineando e mediando iterativamente i due modelli precedentemente generati con J sub-tomo iterate gold PY. I dettagli per entrambe le fasi di questo processo sono disponibili nel protocollo testuale. Valutare il grado di simmetria nella struttura esaminando il file della mappa filtrata a bassa frequenza risultante in kyira. Ad esempio, se la proteina spike è un complesso trimerico, dovrebbe essere evidente una simmetria tripla.Continuare il perfezionamento della struttura come descritto nel protocollo testuale. Successivamente, generare dei punti iniziali distribuiti uniformemente sulla superficie di Varian per il confronto con modelli e assegnare ai punti iniziali un vettore di vista iniziale eseguendo JVs py. Utilizzare i file star generati in precedenza come file di input per produrre un numero di punti iniziali pari a circa 1,5 volte il numero previsto di punte.Questo vettore di vista approssima la direzione della punta più vicina a ciascun punto seme. Successivamente, generare due medie indipendenti della superficie virale come in precedenza. Quindi affinare la posizione dei semi come descritto nel protocollo testuale.Infine, genera i file di marcatori com dai file star del seme perfezionati utilizzando jvs.py. Esamina i semi aprendo i file CMM e i file della mappa dei virioni associati. In kyira.Assicurarsi che i semi raffinati siano allineati correttamente rispetto alla membrana virale. I marcatori raffinati possono essere colorati in base ai loro coefficienti di cross-correlazione. Localizzare automaticamente tutte le spicole nei volumi secondari utilizzando un abbinamento locale del modello intorno ai semi raffinati, allineare e mediare le spicole localizzate, utilizzare le medie generate da un sottoinsieme di spicole selezionate manualmente come modelli iniziali. Ulteriori dettagli su questo processo sono disponibili nel protocollo testuale. Per visualizzare i risultati, aprire la struttura raffinata della spicola in kyira per la visualizzazione.Procedere al posizionamento delle strutture atomiche. Quindi creare un modello composito del virione utilizzando j Subo Create model DO py. Infine, aprire il modello composito per la visualizzazione in kyira.Il modello iniziale è stato affinato utilizzando 205 picchi selezionati manualmente. Tre volte. La simmetria del picco più centrale era evidente senza applicare alcuna simmetria ed è stata imposta nei successivi cicli di affinamento per rilevare manualmente tutti i picchi sulle superfici di Varian. Sono stati generati 106 semi per ogni vion a un raggio di 43 nanometri e con un intervallo angolare di 20 gradi, e le loro posizioni sono state affinate iterativamente rispetto alla membrana.Sono state utilizzate le migliori porzioni di glicoproteine spike correlate per calcolare la media finale. La media è stata risolta con una risoluzione di 35 angstrom. Ha rivelato una struttura trimerica dello spike al centro, oltre a un certo contributo di sei spike adiacenti.I modelli compositi delle varis, calcolati posizionando la struttura nelle posizioni note rivelate, hanno mostrato il posizionamento delle punte sulla superficie della Varian. Di tanto in tanto, erano evidenti aree localmente ordinate di punte. Durante il tentativo di questa procedura, è importante utilizzare esclusivamente i dati migliori e controllare attentamente tutti i risultati intermedi.Seguendo questa procedura, le strutture ottenute mediante cristallografia a raggi X possono essere sovrapposte alla media finale per ottenere una visione più accurata delle interazioni proteina-proteina. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come mediare le strutture delle glicoproteine dell'involucro virale utilizzando J Omo.

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