Della media di Viral Busta Glicoproteina Spikes da Electron Cryotomography Ricostruzioni con Jsubtomo

L'obiettivo generale di questa procedura è studiare le strutture dei complessi glicoproteici presenti sulle superfici dei virus rivestiti. Questo viene raggiunto innanzitutto localizzando le particelle virali nei volumi tomografici precedentemente calcolati a partire dai dati di microscopia elettronica criogenica. Il secondo passaggio consiste nel creare due modelli iniziali statisticamente indipendenti dei complessi glicoproteici utilizzando un sottoinsieme di dati definito manualmente.

Successivamente, questi modelli vengono perfezionati e utilizzati per rilevare automaticamente tutti i complessi glicoproteici sulle particelle virali. L'ultimo passaggio consiste nel perfezionare la struttura del complesso glicoproteico utilizzando l'intero set di dati. Infine, si utilizzano strumenti di visualizzazione molecolare per interpretare la struttura finale.

L'analisi strutturale tridimensionale di queste sporgenze glicoproteiche è di grande valore per comprendere la patogenesi virale e per la progettazione di farmaci. Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti, come la cristallografia a raggi X, è che consente di risolvere le strutture di proteine di membrana nell'ambiente membranoso naturale. Questa tecnica può contribuire ad affrontare argomenti fondamentali nella biologia strutturale.

Ad esempio, la struttura di molti virus contenenti membrane. Sebbene questa tecnica possa fornire informazioni sui complessi di glicoproteine in questi virus, può essere applicata anche ad altri sistemi, come proteine di membrana incorporate in liposomi. La procedura sarà dimostrata da due membri del mio gruppo, Slee e David Bittel.

Per iniziare, aprire un file di autogramma in B show. Selezionare manualmente le particelle virali nei grammi definendo la coordinata centrale di una particella virale mediante lo strumento di selezione delle particelle. Ripetere questo passaggio fino a quando tutte le varianti sono state elaborate.

Salvare le coordinate del virus in un file star. Procedere ripetendo questo processo per tutte le tomografie. Successivamente, eseguire J sub tomo py in modalità estrazione per estrarre le varie sotto-volumenti in file volumetrici individuali, utilizzando i file star salvati come file di input per generare due modelli iniziali indipendenti.

Aprire innanzitutto il file della mappa del sottovolume ovarico. In B mostra. Selezionare un sottoinsieme di picchi nei sottovolumi Varian definendo la coordinata centrale di un picco mediante lo strumento di selezione delle particelle accessibile tramite la finestra della barra degli strumenti.

Ripetere questo passaggio fino a quando non sono state elaborate tutte le punte chiaramente distinte. Salvare le coordinate delle punte in un file star. Ripetere questo passaggio fino a quando non sono state elaborate circa 200 punte di glicoproteine.

Dopo aver assegnato le viste ai varians come descritto nel protocollo del testo, crea una maschera nello spazio reale utilizzando J sub tomo. Crea maschera py. Quindi genera una maschera nello spazio reciproco utilizzando J sub tomo crea maschera cuneo py.

La maschera dello spazio reciproco viene utilizzata per escludere le regioni nella zona del cuneo mancante, risultante dall'acquisizione di dati tomografici con un solo asse. Successivamente, creare due medie iniziali utilizzando J.Sub tomo per generare medie. PY, usando un file di selezione salvato come file di input.

Utilizzare l'iterazione per ridurre il rumore nelle medie iniziali, allineando e mediando iterativamente i due modelli precedentemente generati con J sub-tomo iterate gold PY. I dettagli per entrambe le fasi di questo processo sono disponibili nel protocollo testuale. Valutare il grado di simmetria nella struttura esaminando il file della mappa filtrata a bassa frequenza risultante in kyira. Ad esempio, se la proteina spike è un complesso trimerico, dovrebbe essere evidente una simmetria tripla.

Continuare il perfezionamento della struttura come descritto nel protocollo testuale. Successivamente, generare dei punti iniziali distribuiti uniformemente sulla superficie di Varian per il confronto con modelli e assegnare ai punti iniziali un vettore di vista iniziale eseguendo JVs py. Utilizzare i file star generati in precedenza come file di input per produrre un numero di punti iniziali pari a circa 1,5 volte il numero previsto di punte.

Questo vettore di vista approssima la direzione della punta più vicina a ciascun punto seme. Successivamente, generare due medie indipendenti della superficie virale come in precedenza. Quindi affinare la posizione dei semi come descritto nel protocollo testuale.

Infine, genera i file di marcatori com dai file star del seme perfezionati utilizzando jvs.py. Esamina i semi aprendo i file CMM e i file della mappa dei virioni associati. In kyira.

Assicurarsi che i semi raffinati siano allineati correttamente rispetto alla membrana virale. I marcatori raffinati possono essere colorati in base ai loro coefficienti di cross-correlazione. Localizzare automaticamente tutte le spicole nei volumi secondari utilizzando un abbinamento locale del modello intorno ai semi raffinati, allineare e mediare le spicole localizzate, utilizzare le medie generate da un sottoinsieme di spicole selezionate manualmente come modelli iniziali. Ulteriori dettagli su questo processo sono disponibili nel protocollo testuale. Per visualizzare i risultati, aprire la struttura raffinata della spicola in kyira per la visualizzazione.

Procedere al posizionamento delle strutture atomiche. Quindi creare un modello composito del virione utilizzando j Subo Create model DO py. Infine, aprire il modello composito per la visualizzazione in kyira.

Il modello iniziale è stato affinato utilizzando 205 picchi selezionati manualmente. Tre volte. La simmetria del picco più centrale era evidente senza applicare alcuna simmetria ed è stata imposta nei successivi cicli di affinamento per rilevare manualmente tutti i picchi sulle superfici di Varian. Sono stati generati 106 semi per ogni vion a un raggio di 43 nanometri e con un intervallo angolare di 20 gradi, e le loro posizioni sono state affinate iterativamente rispetto alla membrana.

Sono state utilizzate le migliori porzioni di glicoproteine spike correlate per calcolare la media finale. La media è stata risolta con una risoluzione di 35 angstrom. Ha rivelato una struttura trimerica dello spike al centro, oltre a un certo contributo di sei spike adiacenti.

I modelli compositi delle varis, calcolati posizionando la struttura nelle posizioni note rivelate, hanno mostrato il posizionamento delle punte sulla superficie della Varian. Di tanto in tanto, erano evidenti aree localmente ordinate di punte. Durante il tentativo di questa procedura, è importante utilizzare esclusivamente i dati migliori e controllare attentamente tutti i risultati intermedi.

Seguendo questa procedura, le strutture ottenute mediante cristallografia a raggi X possono essere sovrapposte alla media finale per ottenere una visione più accurata delle interazioni proteina-proteina. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come mediare le strutture delle glicoproteine dell'involucro virale utilizzando J Omo.