Della media di Viral Busta Glicoproteina Spikes da Electron Cryotomography Ricostruzioni con Jsubtomo

L'obiettivo generale di questa procedura è studiare le strutture dei complessi glicoproteici presenti sulle superfici dei virus avvolti. Ciò si ottiene localizzando prima le particelle virali nei volumi tomografici che sono stati precedentemente calcolati dai dati di criomicroscopia elettronica. Il secondo passo consiste nel creare due modelli iniziali statisticamente indipendenti dei complessi glicoproteici utilizzando un sottoinsieme di dati definito manualmente.

Successivamente, questi modelli vengono perfezionati e quindi utilizzati per rilevare automaticamente tutti i complessi glicoproteici sulle particelle virali. Il passo finale consiste nel perfezionare la struttura del complesso glicoproteico utilizzando l'intero set di dati. In definitiva, vengono utilizzati strumenti di visualizzazione molecolare per interpretare la struttura finale.

L'analisi strutturale tridimensionale di questi spike glicoproteici è preziosa per comprendere la patogenesi virale e nella progettazione di farmaci. Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti, come la cristallografia a raggi X, è che questa tecnica consente di risolvere le strutture delle proteine di membrana nell'ambiente naturale della membrana. Questa tecnica può aiutare ad affrontare argomenti chiave nella biologia strutturale.

Ad esempio, la struttura di molte membrane contenenti virus. Sebbene questa tecnica possa fornire informazioni sui complessi glicoproteici in questi virus, può essere applicata anche ad altri sistemi come le proteine di membrana incorporate nei liposomi. La procedura sarà illustrata da due membri del mio gruppo, Slee e David Bittel.

Per iniziare, apri un file di autogramma in B show. Prelevare manualmente le particelle di virus nei grammi definendo la coordinata centrale di una particella virale utilizzando lo strumento di selezione delle particelle. Ripetere questo passaggio fino a quando tutte le varianti non sono state elaborate.

Salva le coordinate dei virus in un file stellare. Procedi a ripetere questo processo per tutti i tomo. Eseguire quindi J sub tomo py in modalità di estrazione Per estrarre vari su sottovolumi in singoli file di volume, utilizzare i file stella salvati come file di input per generare due modelli iniziali indipendenti.

Innanzitutto, apri il file di mappa del sottovolume ovarico. Nello spettacolo B. Scegli un sottoinsieme di picchi nei sottovolumi Varian definendo la coordinata centrale di un picco utilizzando lo strumento di selezione delle particelle accessibile tramite la finestra della casella degli strumenti.

Ripeti questo passaggio fino a quando tutti i picchi chiaramente distinti sono stati elaborati. Salva le coordinate dei picchi in un file stellare. Ripetere questo passaggio fino a quando non sono stati elaborati circa 200 picchi di glicoproteine.

Dopo aver assegnato le viste alle variane come descritto nel protocollo di testo, creare una maschera spaziale reale utilizzando J sub tomo. Crea maschera py. Quindi genera una maschera spaziale reciproca usando J sub tomo crea maschera a cuneo py.

La maschera dello spazio reciproco viene utilizzata per escludere le regioni nella regione del cuneo mancante, risultante dalla raccolta di dati tomografici ad asse singolo. Quindi, crea due medie iniziali utilizzando J.Sub tomo crea medie. PY utilizzando un file di selezione salvato come file di input.

L'uso per ridurre il rumore nelle medie iniziali consiste nell'allineare e mediare in modo iterativo i due modelli precedentemente generati con J sub tomo iterare l'oro PY. I dettagli per entrambe le fasi di questo processo sono disponibili nel protocollo di testo. Valuta il grado di simmetria nella struttura esaminando il file di mappa filtrato passa-basso risultante a kyira. Ad esempio, se la punta è un complesso trimerico, la triplice simmetria dovrebbe essere evidente.

Continuare il perfezionamento della struttura come dettagliato nel protocollo di testo. Quindi, generare semi posizionati uniformemente sulla superficie Varian per la corrispondenza del modello e assegnare un vettore di visualizzazione iniziale ai semi eseguendo JV py. Utilizzare i file star generati in precedenza come file di input che generano circa 1,5 volte più seed rispetto al numero previsto di picchi.

Questo vettore di visualizzazione approssima la direzione della punta più vicina a ciascun punto di partenza. Quindi, generare due medie indipendenti della superficie del virus come in precedenza. Quindi perfezionare la posizione dei semi come dettagliato nel protocollo di testo.

Infine, genera i file dei marcatori com dei file stella seme raffinati utilizzando jvs.py. Esaminare i semi aprendo i file CMM e i file di mappa del virione associati. A Kyira.

Assicurati che i semi raffinati siano allineati correttamente rispetto alla membrana del virus. I marcatori raffinati possono essere colorati in base alla loro correlazione incrociata: i coefficienti individuano automaticamente tutti i picchi nei sottovolumi Varian utilizzando la corrispondenza dei modelli locali attorno ai semi raffinati, allineano e calcolano la media dei picchi localizzati, utilizzano le medie generate da un sottoinsieme di picchi selezionati manualmente come modelli iniziali. Ulteriori dettagli per questo processo possono essere trovati nel protocollo di testo per visualizzare i risultati, aprire la struttura raffinata del picco in kyira per la visualizzazione.

Procedere all'adattamento delle strutture atomiche. Quindi crea un modello composito del virione usando j Subo Crea modello DO py. Infine, apri il modello composito per la visualizzazione in kyira.

Il modello iniziale è stato perfezionato utilizzando 205 punte raccolte manualmente. Triplo. La simmetria della punta più centrale era evidente senza applicare alcuna simmetria e fu imposta ai successivi cicli di affinamento per rilevare manualmente tutte le punte sulle superfici di Varian. Sono stati generati 106 semi per ogni vione con un raggio di 43 nanometri e una spaziatura di 20 gradi, e le loro posizioni sono state affinate iterativamente rispetto alla membrana.

Per calcolare la media finale sono stati utilizzati i cerotti spike glicoproteici meglio correlati. La media è stata risolta con una risoluzione di 35 angstrom. Ha rivelato una struttura a spighe trimeriche nel mezzo, oltre a un certo contributo di sei punte vicine.

I modelli compositi del varis, calcolati posizionando la struttura nelle posizioni note, hanno rivelato il posizionamento di punte sulla superficie del Varian. Occasionalmente, erano evidenti chiazze di punte ordinate localmente. Durante il tentativo di questa procedura, è importante utilizzare solo i dati migliori e controllare attentamente tutti i risultati intermedi.

Seguendo questa procedura, le strutture di cristallografia a raggi X possono essere inserite nella media finale per ottenere una visione più accurata delle interazioni proteina-proteina. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come mediare le strutture glicoproteiche dell'involucro virale usando J Omo.