DNA purificato per affinità Chip (DAP-chip) metodo per determinare obiettivi del gene per batterica, due sistemi di regolamentazione dei componenti

L'obiettivo generale del seguente esperimento è determinare i siti di legame genomici dei regolatori di risposta batterici a due componenti, utilizzando un saggio basato su microarray in vitro. Questo viene ottenuto clonando e purificando una proteina regolatrice di risposta marcata, attivandola mediante fosforilazione in vitro e identificando un bersaglio genico mediante saggi di spostamento della mobilità elettroforetica, da utilizzare come controllo positivo per i passaggi successivi del microarray. Come secondo passaggio, la proteina regolatrice di risposta purificata viene mescolata con il DNA genomico, consentendo di separare il DNA legato alla proteina dal DNA in ingresso mediante purificazione per affinità.

Successivamente, il DNA legato alle proteine e il DNA in input vengono amplificati e verificati mediante qPCR per l'arricchimento della sequenza genica del controllo positivo nella frazione legata alle proteine, etichettati fluorescentemente, raggruppati e ibridati su un microarray a tassellazione. Per determinare i siti di legame genomici del regolatore di risposta, i risultati mostrano i geni più probabili regolati dal regolatore di risposta in studio e possono essere ulteriormente convalidati mediante saggi di spostamento della mobilità elettroforetica. Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ad altri metodi, come il chip-chip in vivo, è che può essere utilizzata anche quando i segnali attivatori e le condizioni non sono noti per i sistemi a due componenti.

Questo metodo riveste una grande importanza nel campo della segnalazione batterica, poiché la stragrande maggioranza dei regolatori presenta geni bersaglio sconosciuti e questo approccio consente di svelare reti regolatorie complesse. A dimostrare questa procedura sarà Amy Chen, assistente di ricerca del mio laboratorio, prima di iniziare la procedura.

Purificare un rr, in particolare la proteina DVU 3 0 2 3 espressa da una miscela di geni DVU 3 0 2 3 clonati. 0,5 picomoli di proteina DVU 3 0 2 3 con 100 femtomoli di un substrato di DNA precedentemente preparato in una soluzione tamponata fino a un volume totale di 20 microlitri. Dopo aver allestito una reazione senza alcuna proteina come controllo, incubare le reazioni a temperatura ambiente sul banco per 20 minuti.

Dopo l'incubazione, aggiungere cinque microlitri di buffer di caricamento 5x alle reazioni di legame. Caricare 18 microlitri di ogni reazione su un gel mini di poliacrilammide al 6% preparato in precedenza in 0,5 XTBE ed eseguire a 100 volt per due ore. Dopo aver eseguito il gel, tagliare una membrana di nylon carica delle dimensioni del gel e immergerla in 0,5 XTBE per almeno 10 minuti. Successivamente, rimuovere il gel dalla cassetta.

Rimuovere eventuali creste dal gel e posizionare il gel e la membrana tra due fogli spessi di carta filtrante inumiditi con TBE 0,5X. Inserire il gel e la membrana all'interno di un apparato per trasferimento semisecco ed eseguire il trasferimento a 20 volt per 30 minuti. Successivamente, inserire la membrana all'interno di un incrociatore a luce UV commerciale e impostare il tempo su tre minuti; dopo aver sviluppato la macchia utilizzando un kit di rilevamento chemiluminescente, acquisire l'immagine mediante un computer collegato a una telecamera dotata di sensore CCD.

Cercare uno spostamento nella mobilità del substrato di DNA in presenza della RR, il che indica che la RR si lega al DNA in esame. Successivamente, mescolare da due a tre microgrammi di DNA genomico con 0,5 picomoli di DVU 3 0 2 3 in una soluzione tamponata. Dopo aver incubato la reazione a 25 gradi Celsius per 30 minuti, trasferire 10 microlitri del campione in una provetta da 1,5 millilitro e etichettarla come DNA input.

Aggiungere 30 microlitri di resina aros NTA al nichel in una provetta microcentrifuga da 0,6 millilitri. Centrifugare il campione a 100 ×g per un minuto per raccogliere la resina sul fondo della provetta dopo la centrifugazione. Rimuovere il soprannatante a questo punto.

Aggiungere 100 microlitri di buffer di lavaggio e agitare delicatamente il tubo per mescolare il contenuto. Dopo la centrifugazione, applicare 100 G per due minuti ed eliminare il sopranatante. Aggiungere i restanti 90 microlitri della reazione di legame al lavaggio della resina nickel NTA.

Quindi incubare il campione in uno shaker rotatorio per 30 minuti. Al termine, centrifugare il campione a 100 G per due minuti. Dopo aver rimosso il soprannatante, ripetere i passaggi di lavaggio altre tre volte.

Aggiungere successivamente 35 microlitri di tampone di eluizione alla resina e mescolare mediante vortex. Incubare il campione in banco a temperatura ambiente per cinque minuti. Dopo la centrifugazione del campione, trasferire il soprannatante in un nuovo tubo da 1,5 millilitro e etichettarlo come frazione di DNA legato alle proteine.

Quindi aggiungere 35 microlitri del buffer eluente al DNA in ingresso dopo la purificazione delle frazioni di DNA in ingresso e di quello legato alle proteine. Aggiungere 10 microlitri di ciascuna frazione a provette PCR separate. Quindi aggiungere un microlitro di buffer di frammentazione 10x, due microlitri di buffer per la preparazione della libreria e un microlitro di soluzione stabilizzante per la libreria a ciascun campione, mescolando accuratamente i campioni mediante vortex.

Incubare i campioni in un termociclatore a 95 gradi Celsius per due minuti. Al termine, raffreddare i campioni su ghiaccio. Successivamente, aggiungere un microlitro di enzima per la preparazione della libreria ai campioni e mescolare il contenuto mediante pipettaggio.

Incubare i campioni in un termociclatore. Dopo l'incubazione, aggiungere 47,5 microlitri di acqua, 7,5 microlitri di mix master di amplificazione 10x e 5 microlitri di polimerasi a ciascun tubo. Una volta miscelati i campioni, riscaldarli in un termociclatore.

Impostare reazioni QPCR in triplice replicazione per ciascun template di DNA preparando un mix maestro 1x per ciascun set di primer precedentemente progettato, quindi aliquotare 18 microlitri del mix maestro per pozzetto di una piastra PCR a 96 pozzetti. Diluire i campioni di DNA di input amplificati e purificati e i campioni di DNA legati alla proteina con acqua fino a una concentrazione di cinque nanogrammi per microlitro e aggiungere due microlitri di ciascun campione nei pozzetti. Successivamente, sigillare la piastra con un film sigillante UltraClear per QPCR.

Centrifugare la piastra a 200 ×g per un minuto. Dopo aver posizionato la piastra in un termociclatore per QPCR in tempo reale, per etichettare il DNA in ingresso con s si tre e il DNA arricchito con sci cinque, mescolare un microgrammo di DNA con 40 microlitri di nonameri marcati S3 SCI-FI e portare il volume a 80 microlitri con acqua. Denaturare i campioni a 98 gradi Celsius per 10 minuti al buio in un termociclatore.

Una volta terminato, raffreddare rapidamente i campioni in ghiaccio per due minuti, quindi aggiungere due microlitri di polimerasi esonucleasi tre prime, cinque prime, cinque millimolari di deossinucleosidi trifosfati e otto microlitri di acqua a ciascuna reazione. Dopo aver mescolato, incubare le reazioni a 37 gradi Celsius per due ore al buio in un termociclatore. A questo punto, aggiungere EDTA fino a una concentrazione di 50 millimolari per arrestare le reazioni e soluzione di cloruro di sodio fino a 0,5 molare.

Trasferire quindi in provette da 1,5 millilitri contenenti un volume pari a 0,9 di isopropanolo, dopo un'incubazione al buio di 10 minuti. Centrifugare i campioni a 12.000 ×g per 10 minuti. Unire insieme sei microgrammi ciascuno di DNA marcato S3 e sci-fi in una provetta da 1,5 millilitri ed essiccare sotto vuoto in una centrifuga a bassa temperatura al buio, coprendo il coperchio della centrifuga se è trasparente.

Una volta che i pellet sono asciutti, li sospendiamo in cinque microlitri di acqua. Successivamente aggiungere 13 microlitri di una miscela maestra di soluzione di ibridazione 1x precedentemente preparata ai campioni dopo averli vortexati per 15 secondi, quindi incubare i campioni a 95 gradi Celsius in un bagno secco per cinque minuti. Rimuovere i campioni dal bagno secco e posizionarli in un sistema di ibridazione a 42 gradi Celsius fino al momento del caricamento.

Successivamente, posizionare l'assiemblea del vetrino mescolatore preparata in precedenza all'interno del sistema di ibridazione. Caricare 16 microlitri di campione nel foro di riempimento. Quindi sigillare i fori con una pellicola adesiva e attivare la funzione di mescolamento nel sistema dopo l'ibridazione per 16-20 ore a 42 gradi Celsius.

Fare scivolare il mescolatore, inserirlo in uno strumento di smontaggio e posizionarlo all'interno di una piastra contenente tampone tiepido uno. Staccare il mescolatore agitando vigorosamente lo strumento di smontaggio. Posizionare il vetrino in un contenitore con 50 millilitri di tampone di lavaggio uno e agitare vigorosamente per due minuti.

Quindi ripetere il passaggio precedente con 50 millilitri di tampone di lavaggio due e 50 millilitri di tampone di lavaggio tre RRR DVU 3 0 2 3 spostato. L'analisi della regione a monte di DVU 3 0 2 5 mediante qPCR ha mostrato che la regione a monte di DVU 3 0 2 5 è arricchita nella frazione legata alla proteina rispetto al DNA in ingresso, indicando così che le condizioni di legame erano appropriate per DVU 3 0 2 3. DVU 0 0 1 3 è stato utilizzato come controllo negativo. I quattro picchi principali ottenuti dopo l'analisi DAP-chip sono stati selezionati come i bersagli più probabili per DVU 3 0 2 3.

Il bersaglio positivo DVU 3 0 2 5 è stato il primo picco ottenuto con il punteggio più alto. Due bersagli genici sono due altre permeasi del lattato codificate in modo distinto. Il quarto bersaglio genico non si trova in una regione a monte, ma nella regione intergenica tra due geni trascritti in modo convergente; le regioni a monte dei bersagli ottenuti mediante DAP-chip sono state utilizzate con meme per prevedere un motivo del sito di legame.

Il motivo è stato ulteriormente convalidato introducendo sostituzioni nelle basi conservate all'interno del motivo, eliminando così lo spostamento di legame. Il motivo convalidato è stato utilizzato per analizzare i genomi di altre batteri solfato-riduttori che possedevano ortologhi di DVU 3 0 2 3; i loci sono stati scelti come possibili geni bersaglio quando il motivo era localizzato nelle regioni a monte dei quadri di lettura aperti, utilizzando sequenze del motivo predette per rs autologhi. È stato generato un motivo consenso per il sito di legame, che assomigliava strettamente a quello di Divo Garris Hilton Burrow.

Dopo aver visionato questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come utilizzare il metodo Daptive per determinare i bersagli genici delle proteine regolatorie. Questo metodo può essere impiegato per analizzare la dimensione del legame di qualsiasi proteina regolatoria, a condizione che la proteina possa essere purificata e che la sequenza del genoma sia nota.