In Vitro Pancreas Organogenesis da dislocati embrionali di topo Progenitori

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di espandere i progenitori pancreatici multipotenti associati in un'impalcatura Matrigel 3D in cui possono differenziarsi e auto-organizzarsi. Ciò si ottiene isolando prima il pancreas da embrioni embrionali di topo del giorno 10,5. Il secondo passo consiste nel rimuovere il mesenchima e dissociare l'epitelio in singole cellule e piccoli grumi.

Il passaggio finale consiste nel sospendere le cellule in matrigel e incubare il gel polimerizzato per l'espansione. In definitiva, questo porta a organoidi pancreatici ramificati auto-organizzanti, simili al pancreas embrionale di topo che possono essere visualizzati dal vivo o al punto finale mediante microscopia. Il principale vantaggio di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti, come tutti i pancreas spiegano, è che si parte da una popolazione cellulare ben definita e meno complessa.

I progenitori pancreatici sono meglio mantenuti nelle colture cellulari 3D che in quelle 2D. Questo metodo può aiutarci a rispondere ad alcune domande critiche all'interno del campo, come l'interazione cellulare o l'interazione cellulare con la matrice. Questo alla fine porterà alla comprensione di come emerge la polarizzazione, e quindi anche di come emerge la diversità cellulare.

Le implicazioni di questa tecnica si estendono alla terapia del diabete dopo l'adattamento nell'uomo, perché possiamo espandere il pancreas che darà origine a cellule migliori che producono insulina. La dimostrazione visiva di questo metodo è fondamentale in quanto la fase di rimozione del tempo straordinario è difficile da eseguire e la fase di dissociazione è importante per la formazione degli organoidi d'organo. Per iniziare, posizionare un embrione di topo che era stato precedentemente isolato al giorno embrionale 10,5 in una piastra di Petri pulita da 35 millimetri in PBS.

Quindi, usa una pinza sottile larga circa 0,05 millimetri per rimuovere l'arto anteriore. Inserire delicatamente la pinza nell'apertura per staccare il tratto digestivo dalla regione del midollo spinale. Individua lo stomaco, il fegato e l'intestino sull'embrione.

Quindi usa gli aghi per isolare il tratto gastrointestinale dallo stomaco all'intestino. Posizionare il tratto gastrointestinale in DMM freddo su ghiaccio. Ripetere il passaggio precedente per isolare ogni singolo tratto gastrointestinale.

Mantenere i singoli tratti gastrointestinali in pozzetti diversi. In una piastra a 24 pozzetti con DMM freddo su ghiaccio, è necessario tenerli separati solo se il genotipo è importante. Posizionare un tratto gastrointestinale in una capsula di Petri pulita da 33 millimetri in PBS freddo e visualizzarlo su un microscopio da dissezione utilizzando l'illuminazione dal basso come campo chiaro.

Una volta che il tratto gastrointestinale è a fuoco, sezionare la gemma pancreatica dorsale usando lingue elettrolitiche affilate piuttosto che aghi o aghi per siringa calibro 20. Isolare la gemma pancreatica con il minor mesenchima possibile attorno all'epitelio. Metti la gemma isolata in una capsula di Petri e incuba in una soluzione fredda a 25 milligrammi per millilitro per distanziare la soluzione per due o tre minuti.

Da questo punto, quando trasferisci la cima, usa un capillare di vetro da 50 microlitri tirato a fiamma attaccato a un tubo flessibile controllato dalla bocca. Metti il bocciolo nella soluzione mentre sei sotto controllo microscopico. Rimetti una gemma pancreatica nella PBS.

Quindi pulire la gemma pancreatica isolata dal mesenchima usando gli aghi e aspirando delicatamente con il capillare di vetro. Una volta rimosso l'intero mesenchima, sciacquare la gemma pancreatica in PBS freddo e trasferire ogni gemma in pozzetti individuali. In una piastra da 60 pozzetti contenente 10 microlitri di DMM freddo per pozzetto.

Per sciacquare le gemme pancreatiche sezionate, pipettare ogni gemma in pozzetti conici individuali e in un mini vassoio da 60 pozzetti contenente 10 microlitri di PBS per. Bene, quindi trasferisci la gemma pancreatica in un pozzetto contenente 10 microlitri di tripsina allo 0,05% e incuba per quattro minuti. A 37 gradi Celsius, inattivare la tripsina trasferendo la gemma in un pozzetto contenente 10 microlitri di DMM con il 10% di siero fetale di vitello convogliare la sospensione cellulare attraverso un sottile capillare tirato con un estrattore di pipette per dissociare le cellule.

La dissociazione parziale è raccomandata perché gli organoidi pancreatici partono in modo ottimale da piccoli gruppi da cinque a 15 cellule. Raggruppare le cellule di diversi embrioni in una provetta einor per ridurre al minimo le differenze che derivano dall'elaborazione individuale. Diluire la sospensione cellulare in un rapporto di uno a tre in matrigel refrigerato.

Aliquotare la sospensione cellulare diluita in una piastra a quattro pozzetti o in una piastra a 96 pozzetti mediante pipettaggio. Otto microlitri per pozzetto. Incubare la piastra a 37 gradi Celsius per cinque minuti per consentire al gel matri di addensarsi.

Riempire il micro pozzetto con terreno di coltura e posizionare la piastra in un ambiente umidificato a 37 gradi Celsius contenente il 5% di CO2 e il 95% di aria. Sostituisci il terreno ogni quattro giorni e monitora quotidianamente le colonie pancreatiche in crescita. Documentare il processo di crescita utilizzando la microscopia time-lapse, cellule progenitrici pancreatiche dorsali da topi a embrionale.

Il giorno 10.5, coltivato in terreno organoidico, ha mostrato l'espansione dei cluster cellulari durante il periodo di coltura di sette giorni e ha iniziato a ramificarsi dopo quattro giorni. Le singole cellule non si sono espanse e hanno perso l'espressione di PDX uno. Mentre i cluster di grandi dimensioni hanno mantenuto pdx.

Un'espressione, le cellule progenitrici pancreatiche cresciute in sfera. Il terreno si espande più frequentemente che nell'organoide. Inoltre, Illumina è stata rilevata al secondo o terzo giorno e un'ulteriore espansione ha portato a sfere cave monostrato con occasionali aree multistrato locali.

L'analisi istologica di un organoide a sette giorni ha confermato la composizione dei progenitori pancreatici, come dimostrato dalla colorazione positiva per H, NF uno, B e PDX uno, le cellule differenziate sono state identificate anche dalla colorazione per il marcatore esocrino amilasi e il marcatore endocrino insulina. Le sfere espresse in modo più omogeneo. I marcatori progenitori pancreatici hnf uno B e PDX one e differenziati meno degli organoidi.

Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare di non dissociare completamente le cellule Dopo questa procedura. È possibile trattare questi organoidi proprio come se fosse un piccolo organo. Pertanto, è possibile eseguire il normale QPCR.

È possibile eseguire QPCR a cella singola, eseguire l'imaging dal vivo. Si può fare immunoistochimica, e facendo tutti questi metodi, si può avere un, si può ottenere una comprensione delle dinamiche cellulari che avvengono in questo, in questa piccola struttura simile a un organo, si può incubare con piccole sostanze chimiche e quindi interagire con i diversi percorsi di interesse. Questa tecnica aprirà la strada ai ricercatori per identificare i meccanismi di sviluppo del pancreas e una migliore formazione cellulare al momento nel topo, ma in futuro, a partire da cellule ESL umane o IP S.

Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come creare un piccolo pancreas che imita il normale sviluppo del pancreas da alcuni progenitori in un ambiente culturale 3D.