Un test comportamentale semplice for Testing Funzione visiva in Xenopus laevis

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di testare la funzione visiva dei girini registrando la quantità di tempo che l'animale trascorre su metà della vasca di prova che è ricoperta di nero. Ciò si ottiene sollevando prima i girini agli stadi da 45 a 50. Il secondo passo è quello di allestire un carro armato metà nero e metà bianco insieme a una telecamera per il test del comportamento.

Quindi posiziona un secondo carro armato con un girino nel serbatoio esterno. Per ogni record di girino, il comportamento guidato dalla visione come sfondo nel suo ambiente viene modificato. Il passaggio finale consiste nell'eseguire una ex sodomia retinica sui girini e quindi ripetere il test del comportamento.

In definitiva, i dati di questo semplice ed economico test vengono utilizzati per dimostrare che i girini preferiscono nuotare su un lato della vasca rispetto all'altro, sotto i test di visione fototop. Il vantaggio principale dell'utilizzo di questo metodo rispetto ad altre tecniche come la risposta cinetica ottica o il saggio di capovolgimento della coda, è che si tratta di un metodo semplice ed economico che utilizza apparecchiature prontamente disponibili nella maggior parte dei laboratori opus. Per preparare i girini, per prima cosa, procuratevi embrioni di xenopus fecondati, mettete mark, ringer modificati, o MMR diluiti di un fattore 10 in piastre di Petri da 60 millimetri con 50 microgrammi per millilitro.

L'antibiotico gentamicina posiziona la blastula sugli embrioni allo stadio della placca neurale. Fasi da due a 15 a 18 gradi Celsius nelle piastre di Petri. Una volta che gli embrioni raggiungono una nuova coppa a favore di circa 27-30 anni, passarli a 0,1 XMMR senza antibiotici per consentire la crescita batterica intestinale.

Quando i girini raggiungono la fase di alimentazione intorno allo stadio 45, spostarli in piastre di Petri da 100 millimetri con 0,1 XMMR. Il giorno successivo, dai loro da mangiare surnatante in polvere di ortica. Dopo una settimana nella capsula di Petri da 100 millimetri, riempi un serbatoio da mezzo gallone con acqua di rana.

Sposta gli animali nella vasca e continua il programma di alimentazione del surnatante in polvere di ortica, ma cambia l'acqua solo due o tre volte a settimana. Quando gli animali si trovano in serbatoi da mezzo gallone, mantenerli in un ciclo di luce e buio di 12 ore con luci che si accendono alle 6:00 Prima del test, posizionare il serbatoio da mezzo gallone con i soggetti del test su una superficie bianca durante la notte per almeno 12 ore prima del test. Il test del comportamento deve essere eseguito in un'area tranquilla e a basso traffico con illuminazione fluorescente standard.

Preparare due serbatoi di prova da mezzo gallone nidificanti sugli angoli esterni di quello che sarà il serbatoio interno. Utilizzare un pennarello per contrassegnare la linea di galleggiamento a cinque centimetri sopra il fondo. Anche per la vasca interna, individuare eventuali avvallamenti al suo interno.

Riempili con un composto inerte per evitare che i girini rimangano al loro interno. Ora rivolgi l'attenzione al secondo serbatoio esterno. Per il passaggio successivo, procurarsi del nastro isolante nero e della carta velina bianca.

Usa il nastro adesivo per coprire l'esterno di una metà del serbatoio e la carta velina per coprire l'esterno dell'altra come mostrato qui. Una volta preparati i serbatoi, allestire una piattaforma girevole di inoculazione e posizionare i serbatoi nidificati su di essa. Posiziona un treppiede e una webcam in modo che la fotocamera possa riprendere l'interno dei serbatoi dall'alto.

Collegare la webcam a un computer con software di acquisizione e riproduzione video. Accendi la fotocamera e preparati a effettuare una nuova registrazione di filmati. Quindi, stendi un panno di cotone leggero sulla fotocamera e sui carri armati.

Per ridurre gli spunti esterni ai girini, utilizzare un misuratore di luminanza e verificare che la luminanza sotto il panno sia compresa tra 35 e 50 candele per metro quadrato. Avviare il test del comportamento recuperando il serbatoio di prova interno. Riempilo con acqua di rana fino al segno dei cinque centimetri.

Usa una rete per trasferire un animale dal suo contenitore da mezzo gallone alla vasca di prova interna del computer. Assicurarsi che il software di registrazione sia aperto e che si registri l'area di test per la registrazione. Scrivi il nome dell'animale, la data e l'ora su un foglio di carta.

Posizionalo sotto la fotocamera per la registrazione. Al termine, preimpostare un timer per due minuti. Quindi, orientare il serbatoio esterno sul giradischi, in modo che il lato nero sia a destra.

Ora posiziona il serbatoio di prova nel serbatoio esterno. Nell'area di registrazione, chiudere il telo e utilizzare lo schermo del computer per garantire l'orientamento del serbatoio esterno. Assicurati che il video sia in fase di registrazione e avvia il timer.

Quando il timer emette un segnale acustico, mantenere il telo in posizione e rimuovere il serbatoio di prova interno. Quindi, ruota il serbatoio esterno di 180 gradi in modo che il lato nero sia ora a sinistra. Riposizionare il serbatoio di prova nel serbatoio esterno e avviare il timer di due minuti.

Ancora una volta, rimuovere il serbatoio interno. Ruotare il serbatoio esterno di 180 gradi e sostituire il serbatoio interno ogni due minuti per un totale di 10 volte. Al termine, interrompi la registrazione video.

Rimetti il girino nel suo serbatoio da mezzo gallone. Preparare un microscopio per eseguire il retinolo ex sodomia. Riempite una capsula di Petri da 60 millimetri con l'1% di aros fuso in 0,1 XMMR e lasciate solidificare.

Togliete un pezzettino rettangolare dell'aros delle dimensioni del girino. Quando sei pronto per procedere, recupera l'animale da esperimento e posizionalo in 0,02% Trica. Continua quando non risponde a un pizzico di coda con una pinza numero tre.

Quindi trasferisci l'animale nel piatto. Procedere montando la capsula di Petri sul microscopio. Preparati a sostenere l'animale con una pinza su un lato.

Sul lato opposto, usa un ago calibro 25 per perforare la pelle dietro la regione dorsale dell'occhio con un angolo di 45 gradi, raggiungi con cura il foro con il numero cinque, la pinza e taglia il nervo ottico evitando la vena accanto ad esso. Sposta il nervo e ritrai il forcipe dopo l'intervento chirurgico. Recupera l'animale mettendolo in una capsula di Petri da 100 millimetri con 0,7 XMMR e 50 microgrammi per millilitro.

Gentamicina per 20 minuti. Dopodiché, trasferisci il girino in una vasca di recupero con acqua di rana. Posizionare il serbatoio su una superficie bianca in preparazione per il test.

Lascia riposare l'animale per una notte. La mattina successiva utilizzare il test comportamentale per testare la funzione visiva. Questo filmato mostra i dati rappresentativi dell'esperimento.

A sinistra ci sono gli animali prima dell'intervento chirurgico a destra ci sono gli stessi animali dopo che gli assoni retinici di entrambi gli occhi sono stati recisi. Ciò è indicato dallo schema negli angoli inferiori. L'acqua è stata disturbata per mostrare che non è stato aggiunto nulla per respingere gli animali dal lato nero o attirarli dal lato bianco.

I girini pre-intervento rispondono al colore di sfondo in meno di 30 secondi, mentre i girini ciechi nuotano senza meta intorno alla vasca. Questo grafico mostra la percentuale di tempo trascorso nelle regioni bianche e nere per un singolo animale in tre condizioni. In primo luogo, l'animale è stato osservato prima di qualsiasi intervento chirurgico utilizzando il test.

Per due giorni consecutivi dopo che il nervo ottico destro è stato reciso, il suo comportamento è stato osservato per due giorni di test. Infine, dopo che entrambi i nervi ottici sono stati recisi, ci sono stati altri due giorni di osservazione con il test. L'animale ha trascorso più giorni sul lato bianco della vasca quando almeno un nervo ottico era intatto.

Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come testare la vista dei girini utilizzando semplici reagenti e attrezzature che si trovano nella maggior parte dei laboratori di rane. Buona fortuna con i tuoi esperimenti.