Un test comportamentale semplice for Testing Funzione visiva in

L'obiettivo generale di questa procedura è testare la funzione visiva dei girini registrando il tempo trascorso dall'animale nella metà del serbatoio di prova coperta di nero. Questo viene realizzato innanzitutto allevando i girini fino agli stadi 45-50. Il secondo passaggio consiste nell'allestire un serbatoio diviso a metà, una bianca e una nera, insieme a una telecamera per il saggio comportamentale.

Successivamente, posizionare un secondo serbatoio contenente una rana pescatrice nel serbatoio esterno. Per ogni rana pescatrice, registrare il comportamento guidato dalla vista mentre lo sfondo del suo ambiente viene modificato. L'ultimo passaggio consiste nell'eseguire un'esosodomia retinica sulle rane pescatrici e quindi ripetere il saggio comportamentale.

In definitiva, i dati ottenuti da questo semplice e poco costoso saggio vengono utilizzati per dimostrare che i girini mostrano una preferenza a nuotare su un lato del serbatoio piuttosto che sull'altro, durante test di visione fototopica. Il vantaggio principale di questo metodo rispetto ad altre tecniche, come la risposta cinetica ottica o il saggio del movimento della coda, è che si tratta di un approccio economico e semplice che impiega attrezzature facilmente disponibili nella maggior parte dei laboratori di opus. Per preparare i girini, procurarsi innanzitutto embrioni di Xenopus fecondati, aggiungere Mark's Modified Ringers o MMR diluito di un fattore 10 in piatti di Petri da 60 millimetri con 50 microgrammi per millilitro.

Aggiungere l'antibiotico gentamicina ai blastocisti fino agli stadi embrionali della piastra neurale. Coltivare gli stadi da 2 a 15 a 18 gradi Celsius in piastre di Petri. Una volta che gli embrioni raggiungono lo stadio a tazza nuova, circa tra lo stadio 27 e 30, trasferirli in MMR 0,1 X senza antibiotici per permettere la crescita della flora batterica intestinale.

Quando i girini raggiungono la fase di alimentazione intorno alla fase 45, trasferirli in piatti di Petri da 100 millimetri contenenti 0,1 XMMR. Il giorno successivo, somministrare loro il soprannatante di polvere di ortica. Dopo una settimana nel piatto di Petri da 100 millimetri, riempire un serbatoio da mezzo gallone con acqua per anfibi.

Spostare gli animali nel serbatoio e continuare il programma di somministrazione del surnatante di polvere di ortica, ma cambiare l'acqua solo due o tre volte alla settimana. Quando gli animali si trovano in serbatoi da mezzo gallone, mantenerli in un ciclo di 12 ore di luce e 12 ore di buio, con l'accensione delle luci alle 6:00 del mattino. Prima del test, posizionare il serbatoio da mezzo gallone contenente i soggetti del test su una superficie bianca per tutta la notte, almeno 12 ore prima dell'esperimento. Il saggio comportamentale deve essere eseguito in un'area tranquilla e poco frequentata, con illuminazione fluorescente standard.

Preparare due serbatoi di prova da mezzo gallone agli angoli esterni di quello che sarà il serbatoio interno. Utilizzare un pennarello per segnare la linea dell'acqua a cinque centimetri sopra il fondo. Per quanto riguarda il serbatoio interno, identificare eventuali ammaccature nella sua parte interna.

Riempirli con un composto inerte per impedire che le girini vi si trattengano. Ora spostare l'attenzione sul secondo serbatoio esterno. Per il passaggio successivo, procurarsi del nastro isolante nero e della carta da cucina bianca.

Usare il nastro adesivo per coprire l'esterno di una metà del serbatoio e la carta da cucina per coprire l'esterno dell'altra, come mostrato qui. Una volta preparati i serbatoi, impostare un goniometro per inoculazione e posizionare i serbatoi concentrici su di esso. Posizionare un treppiede e una webcam in modo che la telecamera possa riprendere l'interno dei serbatoi dall'alto.

Collegare la webcam a un computer dotato di software per l'acquisizione e la riproduzione video. Accendere la telecamera e prepararsi a effettuare una nuova registrazione video. Successivamente, coprire la telecamera e i serbatoi con un telo di cotone leggero.

Per ridurre gli stimoli esterni ai girini, utilizzare un fotometro e verificare che la luminanza sotto il tessuto sia compresa tra 35 e 50 candele per metro quadrato. Iniziare il saggio comportamentale prelevando il serbatoio interno di prova. Riempirlo con acqua per anfibi fino al segno di cinque centimetri.

Utilizzare una rete per trasferire un animale dal suo contenitore da mezzo gallone al serbatoio interno di prova presso il computer. Assicurarsi che il software di registrazione sia aperto e stia registrando l'area di prova per la conservazione dei dati. Scrivere il nome dell'animale, la data e l'ora su un foglio di carta.

Posizionare questo sotto la telecamera per la registrazione. Una volta completato, impostare un timer di due minuti. Successivamente, orientare il serbatoio esterno sul piatto girevole in modo che il lato nero sia a destra.

Ora posizionare il serbatoio di prova all'interno del serbatoio esterno. Nell'area di registrazione, chiudere la tenda e utilizzare lo schermo del computer per verificare l'orientamento del serbatoio esterno. Assicurarsi che la registrazione video sia in corso e avviare il cronometro.

Quando il timer suona, mantenere il telo in posizione e rimuovere il serbatoio interno di prova. Successivamente, ruotare il serbatoio esterno di 180 gradi in modo che il lato nero si trovi ora a sinistra. Reinscrivere il serbatoio di prova all'interno del serbatoio esterno e avviare il timer di due minuti.

Di nuovo, rimuovere il serbatoio interno. Ruotare il serbatoio esterno di 180 gradi e reinserire il serbatoio interno ogni due minuti per un totale di 10 volte. Al termine, arrestare la registrazione video.

Riportare il girino nel suo contenitore da mezzo gallone. Preparare un microscopio per eseguire l'esame del retinolo ex sodomia. Riempire una piastra di Petri da 60 millimetri con l'aro al 1% fuso in 0,1 XMMR e lasciarlo solidificare.

Rimuovere una piccola porzione rettangolare dell'aros delle dimensioni di un girino. Quando si è pronti per procedere, recuperare l'animale da test e posizionarlo in Trica 0,02%. Continuare quando non risponde a una pinzatura della coda con pinze numero tre.

Quindi trasferire l'animale nella piastra. Procedere montando la piastra di Petri sul microscopio. Prepararsi a sostenere l'animale con una pinzetta da un lato.

Dal lato opposto, utilizzare un ago da 25 gauge per perforare la pelle dietro la regione dorsale dell'occhio con un angolo di 45 gradi; raggiungere con attenzione l'apertura con una pinzetta numero cinque e recidere il nervo ottico evitando la vena adiacente. Spingere il nervo da parte e ritrarre la pinzetta dopo l'intervento chirurgico. Ripristinare l'animale posizionandolo in una piastra di Petri da 100 millimetri contenente 0,7 XMMR e 50 microgrammi per millilitro.

Gentamicina per 20 minuti. Successivamente, trasferire la tadpa in un serbatoio di recupero con acqua per anfibi. Posizionare il serbatoio su una superficie bianca in preparazione al test.

Lasciare l'animale a riposo per tutta la notte. La mattina seguente, utilizzare il test comportamentale per valutare la funzionalità visiva. Questo filmato mostra dati rappresentativi dell'esperimento.

A sinistra sono mostrati gli animali prima dell'intervento chirurgico, a destra gli stessi animali dopo il taglio degli assoni retinici provenienti da entrambi gli occhi. Questo è indicato dallo schema negli angoli inferiori. L'acqua è stata agitata per dimostrare che nulla è stato aggiunto per allontanare gli animali dal lato nero o attrarli verso il lato bianco.

I girini preoperatori rispondono al colore di fondo in meno di 30 secondi, mentre i girini ciechi nuotano senza meta all'interno del serbatoio. Questo grafico mostra la percentuale di tempo trascorsa nelle regioni bianca e nera per un singolo animale in tre condizioni diverse. Innanzitutto, l'animale è stato osservato prima di qualsiasi intervento chirurgico utilizzando il saggio.

In due giorni consecutivi successivi al taglio del nervo ottico destro, il suo comportamento è stato osservato per due giorni di test. Infine, dopo il taglio di entrambi i nervi ottici, sono stati effettuati altri due giorni di osservazione con il saggio. L'animale ha trascorso più giorni nel lato bianco del serbatoio quando almeno un nervo ottico era integro.

Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come testare la visione dei girini utilizzando reagenti e attrezzature semplici reperibili nella maggior parte dei laboratori dedicati alle rane. Buona fortuna con i tuoi esperimenti.