Marker cellulare superficiale Purificazione mediata di cellule iPS intermedi da un modello riprogrammabile mouse

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di isolare i rari intermedi di riprogrammazione da colture di fibroblasti embrionali di topo riprogrammati. Ciò si ottiene derivando prima i fibroblasti embrionali di topo da embrioni E 13.5 di un ceppo di topo riprogrammabile. Nella seconda fase, i fibroblasti embrionali di topo a basso passaggio vengono seminati in cellule staminali pluripotenti indotte o IPS integrate con doxiciclina per avviare il processo di riprogrammazione.

Successivamente, le cellule vengono raccolte in punti temporali selezionati durante la riprogrammazione e marcate con anticorpi contro specifici marcatori di superficie cellulare. In definitiva, i rari intermedi di riprogrammazione possono essere isolati dai fatti per ulteriori analisi sperimentali. Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti è che gli studi meccanicistici possono essere eseguiti sui rari intermedi di riprogrammazione in assenza di cellule refrattarie al processo di riprogrammazione, che costituiscono la maggior parte della popolazione Per generare embrionali di topo, fibroblasti o mes iniziare trasferendo un corno uterino embrionale giorno 13,5 in una piastra di coltura tissutale di 10 centimetri contenente 10 millilitri di PBS sterile.

Quindi utilizzare forbici chirurgiche sterilizzate per tagliare il corno in singoli pezzi, ciascuno contenente un embrione. Successivamente, sotto un microscopio da dissezione in una cappa per colture tissutali, utilizzare una pinza sterilizzata per rimuovere con cura l'involucro uterino e la membrana embrionale extra che circonda ciascun embrione e trasferire ogni embrione denudato in piastre individuali da 10 centimetri con 10 millilitri di PBS fresco. Quindi procedi rimuovendo la testa, gli arti, la coda e gli organi interni di ogni embrione con una pinza.

Congelare le teste in singole provette da 1,5 millilitri per la genotipizzazione, se necessario. Trasferisci ogni busto in nuove piastre individuali da 10 centimetri e usa due lame chirurgiche per tritare ogni embrione per due minuti. Digerire i pezzi di tessuto in 200 microlitri di tripsina EDTA per tre-cinque minuti a temperatura ambiente, seguiti da altri due minuti di macinazione.

Quindi inattivare la tryin con due millilitri di metanfetamina e trasferire l'impasto cellulare in una provetta da 15 millilitri utilizzando una pipetta da 1000 microlitri. Dissociare ulteriormente meccanicamente il tessuto con un pipettaggio delicato e quindi trasferire la soluzione cellulare in un piatto di 10 centimetri rivestito di gelatina. Aggiungi altri 10 millilitri di metanfetamina alla coltura.

Dopo 24-48 ore, la piastra deve essere densamente ricoperta di MEF per riprogrammare i MEF prima scongelare una coltura di metanfetamina congelata a basso passaggio in un bagno d'acqua a 37 gradi Celsius, quindi trasferire il contenuto in un tubo contenente 10 millilitri di terreno di metanfetamina preriscaldato. Dopo aver fatto girare le cellule, risospendere il pellet in 12 millilitri di metanfetamina fresca e trasferire la sospensione cellulare in un recipiente di coltura T 75 rivestito di gelatina. Dopo un periodo di recupero da 24 a 48 ore, lavare i MEF con PBS e quindi staccare le cellule con tre millilitri di tripsina EDTA per tre-cinque minuti a 37 gradi Celsius.

Quindi interrompere la digestione enzimatica con cinque millilitri di metanfetamina e dissociare ulteriormente le cellule mescolando delicatamente con una pipetta da 10 millilitri. Successivamente, riprogrammare i mets seminando le cellule su nuovi flaconi di T 75 rivestiti di gelatina a 6,7 volte 10 per le terze cellule per centimetro quadrato in 12 millilitri di terreno IPSC contenente due microgrammi per millilitro di doxiciclina per i primi sei giorni. Sostituire il terreno a giorni alterni con un terreno IPSE fresco integrato con doxiciclina, raccogliendo gli intermedi di riprogrammazione nei punti temporali richiesti mediante il distacco di tripsina EDTA, come appena dimostrato per ciascuna sospensione intermedia raccolta.

Lavare le celle in PBS. Poi risu. Sospendere i pellet nei supporti fax per la marcatura degli anticorpi per stabilire colture IPSC completamente riprogrammate.

Far crescere le cellule in terreni IPSC privi di doxiciclina per altri quattro-sette giorni per marcare le cellule riprogrammate. Etichettare gli intermedi raccolti con gli anticorpi appropriati di interesse. Dopo 10 minuti, picchiettare delicatamente le provette per risospendere le cellule e poi posizionare le provette sul ghiaccio per altri 10 minuti.

Dopo la seconda incubazione, lavare le cellule in 10 millilitri di PBS freddo per provetta. Quindi aspirare con cura il surnatante e risospendere i pellet in un volume appropriato di mezzi di etichettatura integrati con strippin P di dimensione sette su ghiaccio. Dopo 20 minuti, lavare le cellule in altri 10 di PBS freddo e risospendere i pellet cellulari in un terreno di marcatura integrato con ioduro di propidio.

Filtrare eventuali grumi di cellule facendo passare la sospensione attraverso un colino da 70 micrometri e quindi trasferire le cellule nelle apposite provette fax corrispondenti su ghiaccio. Per i controlli di compensazione. Resus sospendere una fiala criogenica di cellule IPS mantenute su mes irradiato in 800 microlitri di tampone di marcatura.

Mettendo da parte 200 microlitri di cellule per il controllo in bianco. Quindi dividere la sospensione cellulare rimanente in tre provette da 15 millilitri per i controlli a colore singolo ed etichettare i campioni come appena dimostrato per analizzare gli intermedi mediante citometria a flusso. Inizia impostando un cancello nel grafico a dispersione anteriore laterale per escludere i detriti.

Quindi utilizzare l'altezza di dispersione diretta rispetto all'area di dispersione diretta per escludere gli aggregati e il canale PI rispetto alla dispersione diretta. Per il gate sulle cellule vive PI negative. Utilizzare le celle non etichettate per regolare le tensioni per i sette canali FITC e PSI blu del Pacifico.

Posizionamento ideale della popolazione cellulare all'estremità inferiore del rispettivo canale. Successivamente, imposta i cancelli con le cellule di controllo non marcate per sudfrazionare le colture di riprogrammazione in tre, sei e nove giorni. Popolazioni di SSEA un TH negativo, 1.2 cellule positive, SSEA un TH negativo, 1.2 cellule negative e gli intermedi di riprogrammazione SSEA uno TH positivo, 1.2 cellule negative.

Quindi suddividi ulteriormente la frazione negativa SSEA one TH 1.2 del giorno nove con il grafico SSEA one contro EPAM. Utilizzando il controllo non etichettato, disegnare i cancelli attorno alle celle EPAM positive e alle celle EPAM negative, come mostrato qui. Infine, raccogli le cellule in uno o due millilitri di terreno cellulare IPS.

Dopo l'induzione della doxiciclina, i miti della riprogrammazione subiscono cambiamenti morfologici distinti intorno al sesto giorno. Iniziano ad emergere macchie simili a colonie precoci che continuano a crescere di dimensioni con l'ulteriore coltura. Un buon esperimento di riprogrammazione si tradurrà in più di 500 colonie per T 75 inizialmente seminate con cinque volte 10 alla quinta cellula e le colture IPS stabilite possederanno caratteristiche colonie a forma di cupola e saranno per lo più prive di cellule differenziate.

I cambiamenti morfologici e molecolari durante la riprogrammazione si riflettono in cambiamenti nell'espressione della superficie cellulare della coscia 1.2 SSEA one e, infine, dell'epca. Mentre i MES sono prevalentemente positivi per la coscia 1,2 e negativi per gli altri marcatori, al terzo giorno, una grande percentuale di cellule ha iniziato a regolare l'espressione della coscia 1,2 e un sottogruppo molto piccolo è diventato SSEA one positivo. L'effettivo intermedio di riprogrammazione per questo punto temporale nei giorni sei e nove, un aumento della percentuale di cellule SSEA 1 positive, di solito ben al di sopra del 10%, può essere rilevato intorno al giorno 12.

Un sottoinsieme di cellule SSEA one positive può essere rilevato che sono anche positive. Per epca. Le colture cellulari di IPS in buona fede saranno fortemente positive.

Per SSEA one ed EPCA Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare di utilizzare solo mappe a basso passaggio che sono state adeguatamente genotipizzate in precedenza.