Name: Regia neuroni dopaminergici differenziazione da cellule staminali pluripotenti umane (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-09-15T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 40 s
Description: Scopri un protocollo ottimizzato per generare neuroni dopaminergici A9 da cellule staminali pluripotenti umane. Questo metodo avanzato consente di modellare il morbo di Parkinson e sviluppare terapie di sostituzione cellulare.

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Gli autori ringraziano i membri del laboratorio Renee Reijo Pera per l'aiuto durante lo sviluppo di questo protocollo e durante la preparazione di questo manoscritto. Questo lavoro è supportato dal laboratorio condiviso del California Institute for Regenerative Medicine (CIRM) (CL-00518).

1 Preparazione della Cultura media <ol><li> Preparare topo fibroblasti embrionali (MEF) medium combinando il seguente: 445 ml di DMEM, 50 ml di siero fetale bovino (FBS), e 5 ml 100x penicillina / ampicillina soluzione stock. Tenere il filtro medio sterilizzato a 4 ° C per non più di 14 giorni. </li><li> Preparare siero contenente HPSC terreno di coltura combinando il seguente: 385 ml DMEM / F12, 100 ml di siero sostituzione knockout (KSR), 5 ml di 100x non essenziali aminoacidi soluzione madre, 5 ml 100x penicillina / ampicillina soluzione madre, 5 ml di 100x -mercaptoethanol soluzione stock, e 10 ng / ml bFGF. Tenere il filtro medio sterilizzato a 4 ° C per non più di 10 giorni. </li><li> Preparare mTeSR1 terreno privo di siero combinando il seguente: 400 ml mTeSR1 medio basale, 100 ml 5x supplemento, e 5 ml 100x penicillina / ampicillina soluzione stock. Mantenere il substrato a 4 ° C per non più di 10 giorni. </li><li> Preparare IV soluzione madre 10x collagenasi: pesare 0,5 g potere collagenasi IV, esciogliere con 50 ml di DMEM / F12 e filtro sterilizzare. Preparare delle aliquote e li scorta a -20 ° C per mesi. </li><li> Preparare la soluzione di gelatina allo 0,1%: pesare 0,5 g di gelatina (da pelle bovina, di tipo B), il potere e scioglierlo con acqua deionizzata. Mantenere soluzione sterilizzata in autoclave a temperatura ambiente per settimane. </li><li> Preparare KSR medio differenziazione combinando il seguente: 410 ml di DMEM, 75 ml KSR, 5 ml di soluzione 100X non essenziali aminoacidi magazzino, 5 ml 100x penicillina / soluzione madre ampicillina, 5 ml di soluzione madre 100X -mercaptoethanol. Tenere il filtro medio sterilizzato a 4 ° C per non più di 10 giorni. NOTA: KSR varia da lotto a lotto, che possono influenzare l&#39;efficienza di differenziazione. E &#39;quindi meglio provare diversi lotti di KSR per trovare quello migliore per la differenziazione. </li><li> Preparare N2 medio differenziazione combinando il seguente: 98 ml di DMEM, 1 ml 100x supplemento N2 e 1 ml 100x penicillina / ampicillina soluzione stock. Tenere il filtro medio sterilizzato a 4° C per non più di 10 giorni. </li><li> Preparare B27 medio differenziazione combinando il seguente: 480 ml di mezzo Neurobasal, 10 ml 50x B27 supplemento, 5 ml di 100x Glutamax soluzione madre, e 5 ml 100x penicillina / ampicillina soluzione stock. Tenere il filtro medio sterilizzato a 4 ° C per non più di 10 giorni. </li></ol> 2. Cultura di hESC e hiPSCs su cellule di alimentatore MEF Le hESC H9 sono stati ottenuti da WiCell Research Institute e hiPSCs sono stati stabiliti in laboratorio Reijo Pera attraverso retrovirus-mediata trasduzione di Yamanaka fattori Oct3 / 4, SOX2, Klf4, e c-MYC 18. <ol><li> Almeno un giorno prima del passaggio delle cellule, preparare alcuni piatti gelatina aggiungendo 1 ml di 0,1% di gelatina a 1 pozzetto di piastre da 6 pozzetti e incubare le piastre a 37 ° C per almeno 30 min. </li><li> Dopo l&#39;incubazione, aspirare gelatina dalle piastre e sementi irradiazione inattivato cellule MEF sulle piastre alla densità di 1,6 x 10 5 cellule/ Pozzetto in mezzo MEF utilizzando un emocitometro per contare le cellule. NOTA: In alternativa preparare alimentatori MEF fin da 3 giorni prima del passaggio delle cellule. </li><li> Cellule Passage Un giorno, dopo la placcatura alimentatori MEF: media aspirato da hPSCs, aggiungere 1 mg / ml di collagenasi IV a celle a 1 ml / pozzetto e incubare le cellule a 37 ° C per 1 ora. </li><li> Durante questa incubazione, lavare alimentatori MEF una volta con PBS, e quindi aggiungere calda (37 ° C) siero contenente HPSC terreno di coltura a 1,5 ml / pozzetto. </li><li> Dopo 1 ora, toccare la piastra di coltura un paio di volte in modo che la maggior parte delle colonie indifferenziate si staccherà dalle piastre, mentre le colonie differenziate rimangono attaccati. Raccogliere accuratamente le colonie galleggianti, e trasferirli in provetta 15 ml. </li><li> Lavare delicatamente la piastra una volta con acqua calda (37 ° C) DMEM / F12 e trasferire DMEM / F12 nello stesso tubo da 15 ml. </li><li> Centrifugare le provette a 179 xg per 3 min. </li><li> Aspirare il terreno dai tubi, facendo attenzione a non disturbare il pellet. Aggiungi guerram HPSC terreno di coltura, le cellule pipettare su e giù più volte per romperli in piccoli gruppi e mescolare bene. </li><li> Trasferire le cellule su nuovi alimentatori MEF a 1: 3-1: 6 rapporto. </li><li> Cambiare la media ogni giorno e il passaggio delle cellule ogni 5-6 giorni. </li></ol> 3 Preparazione di cellule di Differenziazione <ol><li> Almeno un giorno prima della preparazione delle cellule, preparare alcuni piatti Matrigel (tipicamente 3 pozzetti di una piastra da 6 pozzetti). Diluire il Matrigel con il freddo (4 ° C) DMEM / F12 a 01:40 e aggiungere 1 ml di Matrigel per pozzetto di 6 pozzetti. Incubare le piastre Matrigel a 4 ° C durante la notte. NOTA: Si può sigillare le piastre Matrigel con Parafilm e scorta a 4 ° C per tutto il tempo una settimana. </li><li> Utilizzare cellule (vedi punto 2) 4 giorni dopo il passaggio. Rimuovere tutte le colonie differenziate dalle piastre. Aspirare il terreno dalla piastra di coltura, aggiungere 1 ml accutase per pozzetto e incubare le cellule a 37 ° C per 5 min. </li><li> Durante l&#39;incubazione, preparare alcuni gelAtin piatti con l&#39;aggiunta di 1 ml di gelatina a 1 pozzetto di 6 pozzetti. Posizionare questi piatti e le Matrigel piastre preparate il giorno prima in incubatrice. </li><li> Dopo 5 min di incubazione o quando le cellule sono diventati semi-flottante, le cellule pipetta su e giù più volte per farli in cellule singole. </li><li> Raccogliere singole cellule in provette da 15 ml e centrifugare a 258 xg per 3 min. </li><li> Risospendere le cellule con un&#39;adeguata quantità di siero contenente HPSC mezzo di coltura, e aggiungere Thiazovivin alla concentrazione finale di 2 micron. </li><li> Trasferire le cellule su piastre di gelatina rivestite in rapporto 1: 1, e incubare le cellule a 37 ° C per 30 minuti per rimuovere alimentatori MEF. </li><li> Trasferire le cellule in una provetta da 15 ml, aggiungere siero appropriato contenente HPSC medio e contare le cellule con un emocitometro. </li><li> Centrifugare le cellule a 258 xg per 3 min. </li><li> Durante centrifuga, aggiungere Thiazovivin appropriarsi mTeSR1 mezzo per effettuare una concentrazione di 2 mM. </li><li> Dopo centrifuga, unaspirano medio e aggiungere mezzo appropriato mTeSR1 con Thiazovivin modo che ci sono 1,8 x 10 5 cellule / ml medie. </li><li> Estrarre le piastre Matrigel dal termostato, aspirare il Matrigel e aggiungere 2 ml di cellule miste su 1 bene dei 6 pozzetti. NOTA: La densità delle cellule dovrebbe essere 3,6 x 10 4 cellule / cm 2 di superficie. </li><li> Riportare le piastre torna l&#39;incubatrice, e lasciare che le cellule attaccano per 24 ore. </li><li> 24 ore dopo la placcatura le cellule, aspirare vecchio medio e aggiungere 2 ml nuovo mezzo mTeSR1 per pozzetto e lasciare le cellule crescono per un altro 24 ore prima di iniziare la differenziazione. </li></ol> Differenziazione cellulare <ol><li> Inizia differenziazione 48 ore dopo replating le cellule su piastre Matrigel. </li><li> Aspirare il terreno di coltura dalla piastra, lavare le cellule una volta con PBS, e aggiungere 2 ml della seguente mezzo di differenziazione per pozzetto: medio differenziazione KSR supplementato con 10 mM SB431542 e 100 nM LDN-193189. Segna questo giorno come D0 di differenziazione. </li><li> Modificare media ogni giorno da D0 a D20. NOTA: Si può preparare mezzo per uso non più di 2 giorni alla volta. </li><li> Utilizzare il seguente mezzo per D1 e D2: media differenziazione KSR supplementato con 10 mM SB431542, 100 nM LDN-193.189, 0,25 mM SAG, 2 mM purmorphamine, e 50 ng / ml FGF8b. </li><li> Utilizzare il seguente mezzo per D3 e D4: media differenziazione KSR supplementato con 10 mM SB431542, 100 nM LDN-193.189, 0,25 mM SAG, 2 mM purmorphamine, 50 ng / ml FGF8b, e 3 mM CHIR99021. </li><li> Utilizzare il seguente mezzo per D5 e D6: 75% KSR terreno di differenziamento più il 25% medio di differenziazione N2 integrato con 100 nM LDN-193.189, 0,25 mM SAG, 2 mM purmorphamine, 50 ng / ml FGF8b, e 3 mM CHIR99021. </li><li> Utilizzare il seguente mezzo per D7 e D8: 50% KSR terreno di differenziamento più il 50% medio di differenziazione N2 integrato con 100 nM LDN-193.189 e 3 micron CHIR99021.</li><li> Utilizzare il seguente mezzo per D9 e D10: 25% KSR terreno di differenziamento più il 75% medio di differenziazione N2 integrato con 100 nM LDN-193.189 e 3 micron CHIR99021. </li><li> Utilizzare il seguente mezzo per D11 e D12: media B27 differenziazione integrato con 3 mM CHIR99021, 10 ng / ml BDNF, 10 ng / ml GDNF, 1 ng / ml TGF3, acido ascorbico 0,2 mM e 0,1 mM cAMP. </li><li> Utilizzare il seguente mezzo per il resto della differenziazione: B27 medio differenziazione supplementato con 10 ng / ml BDNF, 10 ng / ml GDNF, 1 ng / ml TGF3, acido ascorbico 0,2 mM e 0,1 mM cAMP. </li><li> A circa D16 di differenziazione, preparare alcuni piatti / laminina / fibronectina Poly-L-ornitina. Diluire Poly-L-ornitina soluzione madre con il freddo (4 ° C) PBS a 15 mcg / ml, aggiungere 1 ml a 1 pozzetto di 6 pozzetti e incubare le piastre a 37 ° C durante la notte. </li><li> Aspirare la soluzione di poli-L-ornitina, lavare i piatti 3 volte con acqua sterile e poi asciugare le piastre. </li><li> Diluire laminina magazzino solution con il freddo (4 ° C) PBS a 1 mcg / ml, aggiungere 1 ml di un pozzetto di 6 pozzetti e incubare le piastre a 37 ° C durante la notte. </li><li> Aspirare la soluzione laminina, lavare i piatti 3 volte con acqua sterile e poi asciugare i piatti. </li><li> Diluire la soluzione fibronectina magazzino con il freddo (4 ° C) PBS per 2 mcg / ml, aggiungere 1 ml a 1 pozzetto di 6 pozzetti e incubare le piastre a 37 ° C durante la notte. </li><li> Chiudere le piastre con parafilm e metterli a 4 ° C per la durata di due settimane. </li><li> Dopo 20 giorni di differenziamento, le cellule replate alle piastre / laminina / fibronectina Poly-L-ornitina. Aspirare il terreno di differenziazione, aggiungere 1 ml di acqua calda (37 ° C) Accutase a 1 pozzetto di 6 pozzetti e incubare le cellule a 37 ° C per 5 min. </li><li> Durante l&#39;incubazione, posizionare le piastre / laminina / fibronectina Poly-L-ornitina nell&#39;incubatrice. </li><li> Dopo 5 min di incubazione o quando le cellule sono diventati semi-flottante, delicatamente le cellule pipetta su e giù diverse volte pertrasformarli in cellule singole. </li><li> Raccogliere le singole cellule in 15 ml tubi conici, e aggiungere la giusta quantità di mezzo Neurobasal per il conteggio delle cellule, che variano a seconda espansione (dopo 11 giorni di differenziamento, le cellule possono espandersi 15-20 volte). Contare le cellule utilizzando un emocitometro. </li><li> Centrifugare le cellule a 258 xg per 3 min. Aspirare il surnatante e risospendere le cellule con terreno di differenziamento B27 in modo che la concentrazione cellulare è di 1 x 10 6 cellule / ml medie. </li><li> Aspirare fibronectina dalle piastre, lavare due volte con PBS e aggiungere 2 ml di cellule di 1 pozzo di 6 pozzetti. NOTA: La densità delle cellule per replating dovrebbe essere 2 x 10 5 cellule / cm 2 di superficie. </li><li> Modificare media 24 ore più tardi per rimuovere tutte le cellule morte senza legami. </li><li> Modificare media ogni giorno fino a quando i punti di tempo desiderati per un dato esperimento. </li></ol>

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</ol>

Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.

Le cellule staminali pluripotenti umane (inclusi sia hESC e hiPSCs) possono essere differenziate in vitro per generare la maggior parte, se non tutti, i tipi di cellule del nostro corpo tra cui neuroni DA, che è stata dimostrata in studi precedenti 19. Qui, sulla base delle conoscenze da dopaminergici embrionale neurone sviluppo 20 e protocolli pubblicati da altri laboratori 14,15, abbiamo ottimizzato le condizioni di coltura per la generazione di neuroni DA provenienti da hESC ...

Dopaminergica (DA), i neuroni possono essere trovati in diverse regioni del cervello, tra cui il mesencefalo, l&#39;ipotalamo, retina, e bulbi olfattivi. I neuroni A9 DA nella pars compacta della substantia nigra (SNPC) comportamento di controllo e il movimento proiettando alla striato nel proencefalo e formare il sistema motorio extrapiramidale. La degenerazione dei neuroni A9 DA conduce alla malattia di Parkinson (PD), che è la seconda malattia neurodegenerativa umana più comune e attualmente incurabile. Terapia di sostituzione cellulare è una delle strategie più promettenti per il trattamento della malattia di Parkinson 1, quindi, c&#39;è stato un grande interesse derivante neuroni A9 DA da cellule staminali umane pluripotenti (hPSCs), includendo sia le cellule staminali embrionali umane (hESC) e il recenti cellule staminali umane pluripotenti indotte (hiPSCs). Molta ricerca ha cercato di ricavare neuroni A9 DA da hPSCs utilizzando vari metodi. Le prime relazioni di tutti i neuroni DA generati attraverso una neuralefase progenitore rosetta. In co-coltura con MS5 2 o PA6 3-5 cellule stromali con o senza fattori di crescita esterna per 2-4 settimane, L. Studer e colleghi e di altri tre gruppi indotte con successo hESC per produrre rosette neurali. Hanno poi arricchito queste rosette di dissezione meccanica o digestione enzimatica per un&#39;ulteriore differenziazione. In altri rapporti, i ricercatori hanno generato rosette neurali attraverso il corpo embrioide (EB) galleggianti cultura differenziazione 6-9. In seguito, i ricercatori hanno stabilito un monostrato basato metodo differenziazione 10,11, dove si placcati hESC e hiPSCs sulla matrice extracellulare, aggiunti diversi fattori di crescita nella cultura di indurre la differenziazione di hPSCs di neuroni DA, che imita il vivo DA sviluppo embrionale dei neuroni in . Anche se tutti questi studi ottenuti tirosina idrossilasi (TH) cellule esprimente con alcune caratteristiche di neuroni DA, l&#39;intero processo di differenziazione è il tempo e il lavoro consumo,generalmente inefficiente, e, soprattutto, l&#39;identità A9 di questi neuroni non sono state dimostrate nella maggior parte degli studi, eccetto quella con Lmx1a espressione ectopica 12. Recentemente, un piatto nuovo piano (FP) basata su protocollo è stato sviluppato 13-16, in cui i precursori FP con DA potenziale del neurone sono stati generati dall&#39;attivazione del riccio Sonic e canoniche vie di segnalazione Wnt durante la fase iniziale della differenziazione, e quindi queste cellule FP sono stati ulteriormente specificati per neuroni DA. Anche se questo protocollo è più efficiente, ci sono ancora alcuni problemi; per esempio, l&#39;intero processo di differenziazione richiede molto tempo (almeno 35 giorni) ed è dipendente cella alimentatore 15, o è dipendente EB 16 o l&#39;identità A9 non è stato dimostrato 14. Qui, sulla base delle conoscenze di sviluppo embrionale in vivo DA neurone e risultati pubblicati di altri ricercatori, abbiamo ottimizzato le condizioni di coltura per l&#39;effgenerazione icient di DA neuroni da entrambi hESC e hiPSCs. In primo luogo abbiamo generato cellule FP precursori dalla attivazione del segnale Wnt canonica con piccola molecola CHIR99021 e sonic hedgehog segnalazione con piccole molecole SAG e purmorphamine. Queste cellule esprimono FP Foxa2, Lmx1a, CORIN, OTX2 e nestina. Abbiamo poi specificato queste cellule FP a neuroni DA con fattori di crescita, tra cui BDNF, GDNF, ecc. I neuroni DA generati sono di tipo cellulare A9 come sono positivi per GIRK2 mentre negativo per calbindin 17. Questo protocollo è cella alimentatore o EB indipendente, altamente efficiente e riproducibile. Usando questo protocollo, si può ricavare neuroni DA in meno di 4 settimane dalla hESC o hiPSCs di persone normali per lo studio trapianto di cellule, o da hiPSCs di pazienti PD per la modellazione in vitro di PD o testare potenziali agenti terapeutici per il PD.

<table><tbody><tr><td>DMEM</td><td>Life Technologies</td><td>10569-010</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Life Technologies</td><td>26140</td><td></td></tr><tr><td>penicillina/ampicillina</td><td>Life Technologies</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>Life Technologies</td><td>10565-018</td><td></td></tr><tr><td>KSR</td><td>Life Technologies</td><td>10828-028</td><td></td></tr><tr><td>Aminoacido non essenziale</td><td>Life Tecnologie</td><td>11140-050</td><td></td></tr><tr><td>b-mercaptoetanolo</td><td>Millipore</td><td>ES-007-E</td><td></td></tr><tr><td>bFGF</td><td>R& D Systems</td><td>233-FB-025</td><td></td></tr><tr><td>mTesR1</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>5850</td><td></td></tr><tr><td>Collagenasi IV</td><td>Life Technologies</td><td>17104-019</td><td></td></tr><tr><td>Gelatina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G9391</td><td></td></tr><tr><td>N2 integratore</td><td>Life Technologies</td><td>17502-048</td><td></td></tr><tr><td>B27 supplemento</td><td>Life Technologies</td><td>17504-044</td><td></td></tr><tr><td>Neurobasal</td><td>Life Technologies</td><td>21103-049</td><td></td></tr><tr><td>Glutamax</td><td>Life Technologies</td><td>35050-061</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Life Technologies</td><td>10010-023</td><td></td></tr><tr><td>Fattore di crescita ridotto matrigel</td><td>BD Biosciences</td><td>354230</td><td></td></tr><tr><td>Accutase</td><td>MP Biomedicals</td><td>1000449</td><td></td></tr><tr><td>Thiazovivin</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-361380</td><td></td></tr><tr><td>SB431542</td><td>Tocris Bioscience</td><td>1614</td><td></td></tr><tr><td>LDN-193189</td><td>Stemgent</td><td>04-0074</td><td></td></tr><tr><td>SAG</td><td>EMD Millipore</td><td>566660-1MG</td><td></td></tr><tr><td>Purmorphamine</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-202785</td><td></td></tr><tr><td>FGF8b</td><td>R & D Systems</td><td>423-F8-025</td><td></td></tr><tr><td>CHIR99021</td><td>Cellagen Technology</td><td>C2447-2s</td><td></td></tr><tr><td>BDNF</td><td>R& D Systems</td><td>248-BD-025</td><td></td></tr><tr><td>GDNF</td><td>R& D Systems</td><td>212-GD-010</td><td></td></tr><tr><td>TGF-beta3</td><td>R& D Systems</td><td>243-B3-002</td><td></td></tr><tr><td>Acido ascorbico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A4034</td><td></td></tr><tr><td>cAMP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D0627</td><td></td></tr><tr><td>Topo, anticorpo NESTIN umano</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-23927</td><td>1/1.000 diluizione</td></tr><tr><td>Coniglio anti umano OTX2 anticorpo</td><td>Millipore</td><td>AB9566</td><td>1/2.000 dilutione</td></tr><tr><td>Capra anti umano FOXA2 anticorpo</td><td>R& D Systems</td><td>AF2400</td><td>1/200 diluizione</td></tr><tr><td>coniglio anti umano LMX1a anticorpo</td><td>Millipore</td><td>AB10533</td><td>1/1.000 diluizione</td></tr><tr><td>Coniglio anti umano TH anticorpo</td><td>Pel Freez</td><td>P40101</td><td>1/500 diluizione</td></tr><tr><td>Pollo anti umano TH anticorpo</td><td>Millipore</td><td>AB9702</td><td>1/500 diluizione</td></tr><tr><td>Topo anti umano TUJ1 anticorpo</td><td>Covance</td><td>MMS-435P</td><td>1/,2000 diluizione</td></tr><tr><td>Coniglio anti umano GIRK2 anticorpo</td><td>Abcam</td><td>ab30738</td><td>1/300 diluizione</td></tr><tr><td>Coniglio anti umano Calbindina anticorpo</td><td>Abcam</td><td>ab25085</td><td>1/400 diluizione</td></tr><tr><td>Centrifuga</td><td>Eppendorf</td><td>5804</td><td></td></tr></tbody></table>

regia neuroni dopaminergici differenziazione da cellule staminali pluripotenti umane

Directed Dopaminergic Neuron Differentiation from Human Pluripotent Stem Cells

I neuroni dopaminergici (DA) nella substantia nigra pars compacta (noti anche come neuroni A9 DA) sono il tipo di cellula specifico che viene perso nella malattia di Parkinson (PD). C'è un grande interesse nel derivare neuroni A9 DA da cellule staminali pluripotenti umane (hPSC) per la terapia rigenerativa di sostituzione cellulare per il PD. Durante lo sviluppo neurale, i neuroni A9 DA originano dai precursori della placca del pavimento (FP) situati sulla linea mediana ventrale del sistema nervoso centrale. Qui, abbiamo ottimizzato le condizioni di coltura per la differenziazione graduale delle hPSC in neuroni DA A9, che imita lo sviluppo embrionale dei neuroni DA. Nel nostro protocollo, descriviamo prima l'efficiente generazione di cellule precursori di FP da hPSC utilizzando un metodo a piccola molecola, e poi convertiamo le cellule FP in neuroni DA A9, che potrebbero essere mantenuti in vitro per diversi mesi. Questo protocollo efficiente, ripetibile e controllabile funziona bene nelle cellule staminali embrionali umane (hESC) e nelle cellule staminali pluripotenti indotte umane (hiPSC) di persone normali e pazienti con PD, in cui si potrebbero derivare neuroni DA A9 per eseguire la modellazione della malattia in vitro e lo screening farmacologico e la terapia di trapianto di cellule in vivo per il PD.

Una panoramica del protocollo differenziazione è mostrato in Figura 1. L&#39;efficienza del protocollo differenziazione presentato qui invoca lo stato delle celle di partenza. Pertanto, è fondamentale fare in modo che, prima rimuove tutte le colonie differenziate prima di dissociare hPSCs in celle singole per la differenziazione, e la seconda, una esaurisce la maggior parte, se non tutte, le cellule di alimentazione MEF incubando le cellule su piastre di gelatina rivestite per 30 minuti, e il terzo, uno...

Noi, sulla base delle conoscenze della biologia dello sviluppo e della ricerca pubblicata, abbiamo sviluppato un protocollo ottimizzato per generare in modo efficiente neuroni dopaminergici del mesencefalo A9 sia da cellule staminali embrionali umane che da cellule staminali pluripotenti indotte umane, che sarebbero utili per la modellazione della malattia e la terapia di sostituzione cellulare per il morbo di Parkinson.

Regia neuroni dopaminergici differenziazione da cellule staminali pluripotenti umane

Dopaminergic (DA) neurons in the substantia nigra pars compacta  (also known as A9 DA neurons) are the specific cell type that is lost in ...

L'obiettivo generale di questa procedura è indurre una differenziazione altamente efficiente di neuroni dopaminergici in vitro. Ciò si ottiene innanzitutto preparando una coltura adesiva di cellule singole a partire da cellule staminali pluripotenti umane.Nel secondo passaggio, il mezzo di coltura cellulare viene sostituito con un mezzo di induzione neuronale per indurre i progenitori della piastra ventrale. Successivamente, i neuroni dopaminergici vengono coltivati in un mezzo di maturazione. Infine, i progenitori di neuroni dopaminergici singoli vengono coltivati su piastre di laminina di fibronectina con poli-L-ornitina, in mezzo di maturazione per 30 giorni.Infine, la microscopia a immunofluorescenza può essere utilizzata per valutare l'espressione di importanti marcatori dei neuroni dopaminergici. Questa tecnica presenta un vantaggio maggiore rispetto al protocollo neuro sfera esistente basato sull'acido neuro. Può generare una popolazione neurale doppia più omogenea con un'efficienza superiore.Quattro giorni dopo il passaggio, aspirare il mezzo dalle colture cellulari. Staccare le cellule utilizzando un millilitro di Accutase per pozzetto e incubarle a 37 gradi Celsius per cinque minuti. Durante l'incubazione, aggiungere un millilitro di gelatina in ogni pozzetto di una piastra a sei pozzetti, quindi posizionare la piastra insieme alle piastre appena preparate rivestite con Matrigel nell'incubatore.Quando le cellule diventano semi-adiacenti, aspirarle e rilasciarle più volte per ottenere una sospensione monocellulare. Quindi trasferire le cellule in un tubo da 15 millilitri e centrifugarle per tre minuti a 258 G e temperatura ambiente. Sospendere nuovamente il pellet nel quantitativo appropriato di mezzo di coltura per cellule staminali pluripotenti umane integrato con siero e aggiungere thi vivin fino a una concentrazione finale di due millimolari.Successivamente, incubare le cellule in piastre rivestite con gelatina in rapporto uno a uno a 37 gradi Celsius per 30 minuti. Per rimuovere i feeder di metotressato, trasferire quindi le cellule in un nuovo tubo da 15 millilitri. Diluire in mezzo per cellule staminali pluripotenti umane, integrato con siero, e contare le cellule dopo averle centrifugate nuovamente; risospendere le cellule nel mezzo MT.SR uno con thias Ivan a una concentrazione di 180.000 cellule per millilitro.Quindi aspirare il matrigel dalle piastre rivestite e distribuire due millilitri di cellule per pozzetto. 48 ore. Dopo il ripiattamento delle cellule nelle piastre con matrigel.Aspirare il mezzo da ogni pozzetto e lavare le cellule una volta con PBS. Quindi aggiungere due millilitri di mezzo di differenziamento KSR, integrato con SB 4 31, 50 42 e L DN 1 9 3 1 8 9 alle cellule, cambiando il mezzo ogni giorno dal giorno zero al giorno 20 come indicato nel grafico. Al giorno 20, aspirare il mezzo di differenziamento e staccare le cellule con un millilitro di acutus a 37 gradi Celsius per pozzetto, incubando a 37 gradi Celsius per cinque minuti. Durante l'incubazione, riscaldare le piastre di poli-L-ornitina, laminina e fibronectina nell'incubatore.Successivamente, dopo il risveglio, sospendere le cellule staccate in una sospensione di singole cellule e diluire le cellule in mezzo neurobasale. Dopo il conteggio, centrifugare le cellule e risospendere il pellet in B 27, mezzo di differenziamento, a una concentrazione di 1 milione di cellule per millilitro. Quindi aspirare la fibronectina dalle piastre di poli-L-ornitina, laminina e fibronectina.Lavarli due volte con PBS e trasferire 400 microlitri di cellule in ciascun pozzetto. Cambiare infine il mezzo dopo le prime 24 ore, quindi ogni due giorni fino al termine dell'esperimento, per rimuovere eventuali cellule morte non aderenti. Come illustrato in queste immagini, le colture di cellule staminali pluripotenti umane monocellulari ripiattate si espanderanno formando aggregati durante le prime 48 ore di differenziazione, raggiungendo una confluenza di circa il 70%.Dopo la differenziazione, le cellule raggiungono la piena confluenza già in tre o quattro giorni. Al giorno 20, le cellule differenziate si attaccano e crescono come piccoli ammassi. Nei successivi cinque giorni, all'interno degli ammassi compaiono assoni e neuriti molto più intensi e morfologicamente integri, formando alcune connessioni tra gli ammassi.Dopo 11 giorni di differenziazione, le cellule staminali pluripotenti umane possono essere convertite in modo efficiente in precursori della piastra ventrale. Come dimostrato in queste immagini, quasi tutte le cellule esprimono i marcatori cellulari dei precursori della piastra ventrale, ovvero NESTIN e FOXA2, e oltre il 90% delle cellule esprime CORIN, OTX2 e LMX1A. Dopo ulteriore differenziazione, le cellule precursori della piastra ventrale si specializzano in neuroni dopaminergici che esprimono TUJ1 e TH. Questi neuroni dopaminergici hanno un'identità di tipo medioencefalico poiché esprimono EN1 e sono negativi per calbindina. Esperimenti di immunomarcatura dimostrano inoltre l'assenza di astrociti GFAP e la presenza di un numero molto ridotto di neuroni GABAergici, indicando che la differenziazione è esclusivamente specifica per la linea dei neuroni dopaminergici.Durante il test di questa procedura, è importante mantenere una costanza nella coltura cellulare quotidiana e assicurarsi che il mezzo sia stato appena preparato con gli ingredienti corretti.

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Neuroscience

Neuroscienze

Abbiamo stabilito un protocollo per l'induzione di neuroblasti pluripotenti direttamente da cellule staminali embrionali umane conservati in condizioni definite con piccole molecole, che permette la derivazione di una grande quantità di progenitori neuronali umane e tipi di cellule neuronali nel sistema nervoso centrale per lo sviluppo neurale riparazione.

Derivazione efficiente di progenitori neuronali umane e Neuroni pluripotenti da cellule staminali embrionali umane con induzione piccole molecole

Protocolli per la differenziazione neuronale di cellule staminali pluripotenti umane (hPSCs) sono spesso molto tempo e richiedono notevoli capacità di colture cellulari. Qui, abbiamo adattato una piccola molecola procedura basata differenziazione di un formato di piastra multititre, permettendo la generazione semplice, rapido, efficace e di neuroni umani in modo controllato.

Generazione rapida e efficiente di neuroni da cellule staminali umane pluripotenti in un formato piatto Multititre

Questo video dimostra la generazione di cellule progenitrici neurali da cellule staminali pluripotenti umane (hPSC) non transgeniche e transgeniche. Le hPSC sono differenziate in cellule progenitrici neurali utilizzando un mezzo di differenziazione neuronale. Mentre la differenziazione è indotta nelle cellule non transgeniche utilizzando piccole molecole, le hPSC transgeniche vengono differenziate aggiungendo un antibiotico che induce il promotore di un fattore di trascrizione specifico per la...

Differenziazione di cellule staminali pluripotenti umane non transgeniche e transgeniche in cellule progenitrici neurali

Questo video dimostra il processo di induzione delle cellule staminali pluripotenti umane a differenziarsi in neuroni trasfettandoli con lentivirus ingegnerizzati che trasportano un gene del fattore di trascrizione neurogenico sotto il controllo dell'elemento responsivo alla tetraciclina, seguito da un trattamento con un derivato della tetraciclina e un mezzo di maturazione.

Differenziazione delle cellule staminali pluripotenti umane nei neuroni utilizzando lentivirus ingegnerizzati

Questo video dimostra la differenziazione delle cellule staminali embrionali umane (hESC) in neuroni dopaminergici, per fornire un modello per lo studio del morbo di Parkinson. Le hESC vengono coltivate in un mezzo di induzione neurale in una piastra a micropozzetti per formare neurosfere 3D. Questi vengono poi coltivati in un mezzo di induzione neurale per promuovere la differenziazione in neuroni progenitori dopaminergici. La maturazione finale dei neuroni avviene in un inserto di coltura in...

Generazione di organoidi neuronali dopaminergici da cellule staminali embrionali umane

Questa procedura produce neuroni telencefalici passando attraverso i punti di controllo che sono simili a quelli osservati durante lo sviluppo umano. Le cellule possono differenziarsi spontaneamente, sono esposti a fattori che li spingono verso il lineage neurale, sono isolati, e vengono piastrate su vetrini per consentire la differenziazione terminale e maturazione.

La specifica di telencefalici neuroni glutamatergici di cellule staminali umane pluripotenti

Modifichiamo e implementare un protocollo precedentemente pubblicato che descrive la differenziazione rapida, riproducibile ed efficiente di indotto umani cellule staminali pluripotenti (hiPSCs) in eccitatorio neuroni corticali 12. In particolare, la nostra modifica permette il controllo della densità delle cellule neuronali e uso su array micro-elettrodi per misurare le proprietà elettrofisiologiche a livello di rete.

Rapid neuronale differenziazione delle cellule staminali pluripotenti indotte per misurare l&#39;attività di rete su array Micro-elettrodo

Il protocollo presenta la riprogrammazione delle cellule mononucleari del sangue periferiche per indurre le cellule staminali neurali mediante l'infezione da virus Sendai, la differenziazione degli iNSC in neuroni dopaminergici, il trapianto di precursori DA nei precursori unilateralmente Modelli murini del morbo di Parkinson e valutazione della sicurezza e dell'efficacia dei precursori DA derivati da iNSC per il trattamento con LA PD.

Generazione di cellule staminali neurali indotte da cellule mononucleari periferiche e differenziazione verso i precursori dei neuroni dopaminergici per gli studi di trapianto

Presentato qui è un protocollo per la generazione di una coltura unicellulare di cellule staminali embrionali umane e la loro successiva differenziazione in cellule progenitrici neurali. Il protocollo è semplice, robusto, scalabile e adatto per lo screening farmacologico e le applicazioni di medicina rigenerativa.

Differenziazione neurale efficiente utilizzando la coltura a cella singola di cellule staminali embrionali umane

In questo protocollo, descriviamo una strategia di differenziazione stabile e altamente efficiente per la generazione di neuroni simpatici postganglionici dalle cellule staminali pluripotenti umane. Questo modello renderà i neuroni disponibili per l'uso di studi di disturbi autonomici multipli.

Differenziazione efficiente dei neuroni simpatici postganglionici utilizzando cellule staminali pluripotenti umane in condizioni di coltura senza alimentatore e definite chimicamente

Mostriamo l'automazione delle colture di cellule staminali pluripotenti indotte dall'uomo (hiPSC) e delle differenziazioni neuronali compatibili con l'imaging e l'analisi automatizzati.

Produzione automatizzata di neuroni corticali e dopaminergici pluripotenti indotti dall'uomo con monitoraggio integrato delle cellule vive

Scopri un protocollo ottimizzato per generare neuroni dopaminergici A9 da cellule staminali pluripotenti umane. Questo metodo avanzato consente di modellare il morbo di Parkinson e sviluppare terapie di sostituzione cellulare.

Regia neuroni dopaminergici differenziazione da cellule staminali pluripotenti umane

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