Regia neuroni dopaminergici differenziazione da cellule staminali pluripotenti umane

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di indurre una differenziazione neuronale dopaminergica altamente efficiente. In vitro. Ciò si ottiene preparando prima una coltura di adesione a singola cellula di cellule staminali umane P pluripotenti.

Nella seconda fase, il terreno di coltura cellulare viene commutato in terreno di induzione neuronale per indurre i progenitori della placca del pavimento. Successivamente, i neuroni dopaminergici vengono coltivati in mezzi di maturazione. E infine, i progenitori dei neuroni dopaminergici a singola cellula vengono coltivati su piastre di fibronectina laminate in poli L-ornitina e terreni di maturazione per 30 giorni.

In definitiva, la microscopia a immunofluorescenza può essere utilizzata per valutare l'espressione di importanti marcatori neuronali dopaminergici. Questa tecnica ha un vantaggio maggiore rispetto alla neurosfera esistente sul protocollo neuroacido. Può generare una popolazione neurale doppia più omogenea con una maggiore efficienza.

Quattro giorni dopo il passaggio, aspirare il terreno dalle colture cellulari. Staccare le cellule con un millilitro di Accutane per pozzetto e incubarle a 37 gradi Celsius per cinque minuti. Durante l'incubazione, aggiungere un millilitro di gelatina a ciascun pozzetto di una piastra a sei pozzetti, quindi posizionare la piastra insieme alle piastre rivestite di matri gel appena preparate nell'incubatore.

Quando le cellule sono diventate semi galleggianti, pipettarle su e giù più volte per ottenere una sospensione a singola cellula. Quindi tirare le cellule in una provetta da 15 millilitri e centrifugarle per tre minuti. A 258 gs e a temperatura ambiente, sospendere nuovamente il pellet nella quantità appropriata di terreno di coltura di cellule staminali pluripotenti umane integrato con siero e aggiungere thivivin a una concentrazione finale di due millimolari.

Quindi, incubare le cellule nelle piastre rivestite di gelatina in un rapporto uno a uno a 37 gradi Celsius per 30 minuti. Per rimuovere gli alimentatori di metanfetamine, trasferire le cellule in un nuovo tubo da 15 millilitri. Diluirli in terreno di cellule staminali pluripotenti umane, integrati con siero, e contarli dopo aver girato nuovamente le cellule, risospendere le cellule in MT.SR un mezzo con tias Ivan a una concentrazione di 180.000 cellule per millilitro.

Quindi aspirare il matrigel dalle piastre rivestite ed erogare due millilitri di cellule per pozzetto. 48 ore. Dopo aver riplaccato le cellule nelle piastre matrigel.

Aspirare il terreno da ogni pozzetto e lavare le cellule una volta con PBS. Quindi aggiungere due millilitri di differenziazione KSR, terreno integrato con SB 4 31, 50 42 e L DN 1 9 3 1 8 9 alle cellule cambiando il mezzo ogni giorno da D zero a D 20 come indicato nella tabella del giorno 20, aspirare il mezzo di differenziazione e staccare le cellule con un millilitro di 37 gradi Celsius per pozzetto a 37 gradi Celsius per cinque minuti. Durante l'incubazione, riscaldare le piastre di fibronectina in poli-L-orine laminina nell'incubatrice.

Quindi, dopo Resus, sospendendo le cellule staccate in una singola sospensione cellulare, diluire le cellule in mezzi neuro basali. Dopo il conteggio, far girare le cellule e risospendere il pellet in B 27, mezzo di differenziazione a una concentrazione di 1 milione di cellule per millilitro. Quindi aspirare la fibronectina dalle piastre di fibronectina della lamina del poliolo orina.

Lavarli due volte con PBS e trasferire 400 microlitri di cellule su ciascuno. Bene, finalmente cambia il terreno dopo le prime 24 ore, e poi a giorni alterni fino al punto finale sperimentale per rimuovere eventuali cellule morte non attaccate. Come illustrato in queste immagini, le colture di cellule staminali pluripotenti umane a singola cellula ripiastrate si espanderanno come cluster durante le prime 48 ore di differenziazione, raggiungendo circa il 70% di confluenza.

Dopo la differenziazione, le cellule raggiungono la completa confluenza in soli tre o quattro giorni. Entro il 20° giorno, le cellule differenziate si attaccano e crescono come piccoli grumi. Durante i cinque giorni successivi, assoni e neuriti molto più intensi e morfologicamente intatti compaiono all'interno dei grumi, formando alcune connessioni tra i grumi.

Dopo 11 giorni di differenziazione, le cellule staminali pluripotenti umane possono essere convertite in modo efficiente in precursori della placca del pavimento. Come dimostrato in queste immagini, quasi tutte le cellule esprimono il precursore della placca del pavimento, i marcatori cellulari si annidano e la volpe A due e oltre. Il 90% delle cellule esprime Corin O OTX due e LM X uno A.Dopo un'ulteriore differenziazione, le cellule precursori della piastra del pavimento si specializzano in neuroni dopaminergici che esprimono TUJ uno e TH. Questi neuroni dopaminergici hanno un'identità nove in quanto esprimono GK 2 e sono negativi per la calbindina Gli esperimenti di immunocolorazione dimostrano anche che non ci sono astrociti GFAP e pochissimi neuroni GABAergici, indicando che la differenziazione è esclusivamente specifica per la linea dei neuroni dopaminergici.

Durante il test di questa procedura, è importante mantenere la coerenza nella coltura cellulare quotidiana e assicurarsi che il terreno sia preparato al momento con gli ingredienti corretti.