Applicazione di due-macchiato Spider Mite

L'obiettivo generale di questa procedura è raccogliere rapidamente e in modo affidabile acari del ragno in uno stadio di sviluppo specifico. Questo risultato si ottiene innanzitutto facendo sviluppare gli acari su piante di fagiolo. Successivamente, la pianta sperimentale viene infestata con acari femmina utilizzando un pennello o una pompetta, a seconda del numero di acari da applicare su una singola pianta.

L'ultimo passaggio consiste nella quantificazione manuale del danno alle piante mediante il metodo della griglia in un programma di editing grafico. Infine, l'analisi statistica viene utilizzata per evidenziare la diversa suscettibilità di linee o ecotipi vegetali nei confronti dell'acaro rosso del ragno. Il vantaggio offerto da questa tecnica rispetto ai metodi esistenti è che fornisce un metodo efficiente per la rapida e semplice raccolta di un elevato numero di femmine adulte di acari, la loro applicazione su una pianta ospite sperimentale e la valutazione del danno alla pianta causato dall'alimentazione degli acari.

Il protocollo descritto consente la raccolta rapida ed efficiente di centinaia di individui in qualsiasi stadio di sviluppo, utilizzabili per successive applicazioni sperimentali. Per iniziare, coltivare piante di fagiolo rosso della California a partire da semi per due o tre settimane prima dell'infestazione, mescolando successivamente queste piante con piante già infestate. Gli acari adulti colonizzeranno rapidamente il materiale vegetale fresco.

Rimuovere le vecchie piante di fagiolo infestate ogni sette-dieci giorni e sostituirle con piante fresche per raccogliere gli acari utilizzando il metodo del lavaggio. Posizionare una pianta di fagiolo fresca a contatto con le piante infestate uno-due giorni prima dell'esperimento. Utilizzare 20-30 piante di fagiolo fresche per raccogliere da 1000 a 2000 femmine adulte di acari.

Nel giorno dell'esperimento, tagliare l'acaro. Investire le piante di fagiolo alla base, quindi lavare le piante di fagiolo infestate due o tre piante alla volta in una soluzione di tween 20 allo 0,001%. Ogni pianta viene lavata due o tre volte per raccogliere tutti gli acari dalle foglie.

Lavorare entro una finestra di 10 minuti per evitare la mortalità degli acari. Successivamente, preparare un setaccio da 500 micrometri per rimuovere i detriti e un setaccio da 300 micrometri per raccogliere gli acari adulti femmina. Filtrare la sospensione attraverso il setaccio da 500 micrometri, quindi ricaricare la sospensione attraverso il setaccio da 300 micrometri.

Le femmine adulte di acari vengono trattenute se si è accumulata troppa schiuma nel setaccio. Gli acari possono essere delicatamente lavati sotto acqua corrente a temperatura ambiente. Immergere in acqua di rubinetto pulita un setaccio da 300 micrometri contenente femmine adulte di acari per rimuovere il tween 20; distribuire quindi gli acari in un singolo strato sul fondo del setaccio.

Utilizzare un tovagliolo di carta per rimuovere l'acqua in eccesso dalla rete e dai lati del setaccio, in modo che gli acari possano asciugarsi rapidamente e riprendersi. Successivamente, posizionare un setaccio contenente acari sopra il setaccio utilizzato come supporto. Circondare il setaccio inferiore con acqua per impedire la dispersione degli acari.

Questo permetterà agli acari di muoversi liberamente, ma impedirà loro di scappare. L'infestazione con acari del ragno mediante un pennello viene utilizzata per applicare fino a 30 acari per pianta. Utilizzare un pennello tondo per arte con setole morbide, di misura zero, zero o più fine.

Inumidire il pennello con acqua del rubinetto a temperatura ambiente. Prelevare delicatamente gli acari dal setaccio utilizzando la punta del pennello e trasferirli sulla pianta. Quando si applicano più di 30 acari, l'infestazione della pianta viene ottenuta utilizzando acari raccolti mediante una linea a vuoto con pompa.

Per questo metodo, fissare una punta da un millilitro al tubo che si collega alla pompa o alla linea sottovuoto utilizzando un tubo centrifuga da 1,5 millilitri. Tagliare la parte inferiore per creare un adattatore tra il tubo sottovuoto della pompa e la punta; posizionare un pezzo di carta da filtro tra la punta della pipetta e l'adattatore. Lo scopo di questa procedura è intrappolare gli acari all'interno della punta della pipetta durante il processo di aspirazione e ridurre contemporaneamente il flusso d'aria, raccogliendo gli acari direttamente dal setaccio mediante la punta della pipetta.

In alternativa, raccogliere gli acari uno alla volta dalle foglie infestate utilizzando un stereomicroscopio. Una volta raccolto il numero richiesto di acari, rimuovere la punta della pipetta dal tubo, assicurandosi che il pezzo di carta da filtro situato dietro la punta della pipetta non venga perturbato.

Raccogliere gli acari battendo delicatamente la punta della pipetta in modo da raggrupparli. Successivamente, posizionarli sulla foglia. Entro pochi secondi, gli acari inizieranno a disperdersi sulla superficie della foglia.

Per registrare i danni alla pianta, coprire il piano dello scanner con un foglio trasparente per evitare di contaminare la superficie dello scanner. Con il materiale vegetale, tagliare un'intera rosetta e posizionarla sul piano dello scanner.

Quindi il lato adassiale delle foglie deve essere rivolto verso lo scanner. Fonte luminosa ed elemento di acquisizione consentono di scansionare contemporaneamente più rosette. In alternativa, se le rosette sono troppo fitte e non è possibile acquisire le singole foglie senza sovrapposizioni, si possono dissezionare le rosette in foglie singole o gruppi di foglie non sovrapposte utilizzando forbici fini prima di posizionarle sullo scanner.

Coprire le rosette o le foglie del letto con un foglio di carta bianca per evitare l'adesione e la contaminazione del coperchio dello scanner. Chiudere il coperchio dello scanner ed eseguire una scansione con una risoluzione di 1.200 DPI, la luminosità impostata a +25 e il tipo di file impostato su jpeg di qualità massima. Salvare i file delle immagini per successive analisi dei danni.

Per quantificare i danni alla pianta, aprire l'immagine della pianta con Photoshop. Creare un nuovo livello. Quindi sovrapporre l'immagine scannerizzata con la griglia di punti di 25 millimetri per punto.

Divisioni da 25 millimetri su un livello sovrapposto. Contrassegnare le aree fogliari danneggiate utilizzando un punto con lo strumento matita. Utilizzare un singolo punto per ogni quadrato della griglia sottostante in cui il danno copre più della metà dell'unità della griglia.

La dimensione del punto è definita in pixel. Quando tutti i quadrati della griglia che mostrano danni alle piante coprenti almeno metà dell'unità della griglia vengono contrassegnati con un punto, utilizzare uno strumento di istogramma per determinare il numero di pixel sul livello rappresentante il numero di punti, e di conseguenza il numero totale di quadrati contrassegnati.

Calcolare il numero di punti segnati dividendo il numero totale di pixel per il numero di pixel per punto. Calcolare l'area totale di danno moltiplicando il numero di punti segnati nell'immagine per l'area di un quadrato della griglia, poiché un punto corrisponde a un quadrato della griglia. Questo grafico mostra l'area di danno misurata su piante di AANA di tre settimane di età.

Quattro giorni dopo l'applicazione di 20 femmine di acari ragnetto. I risultati dei danni alle piante sono riproducibili, dimostrando che gli acari raccolti si trovano in uno stato fisiologico simile e sono adatti a studi sulle interazioni pianta-acaro ragnetto. Questo grafico mostra l'area di danno misurata su piante AANA di tre settimane di età quattro giorni dopo l'applicazione di 20 femmine di acari ragnetto.

Come esempio di applicazione sperimentale, la variazione naturale e la suscettibilità all'acaro rosso, orry, sono state valutate su tre essenze aana mediante l'applicazione di 20 acari rossi femmine per pianta utilizzando un pennello umido e la registrazione dei danni quattro giorni dopo l'infestazione. I dati sui danni possono essere quantificati e presentati come grafico a barre o grafico a scatola e analizzati con il metodo statistico appropriato. In questo esempio, la suscettibilità all'acaro rosso o a bry varia significativamente tra le sessioni.

Le operazioni di isolamento e infestazione possono essere completate entro 30 minuti, a seconda del numero di campioni e della scelta del flusso di lavoro. È importante ricordare che gli acari non devono rimanere immersi nella soluzione al 20% per più di 10 minuti. L'isolamento mediante il sistema di setacciamento può essere utilizzato per ottenere frazioni di acari a diversi stadi di sviluppo, che possono essere impiegate per una varietà di esperimenti, non solo nel campo dell'interazione pianta-parassita, ma anche in fisiologia dello sviluppo e biologia molecolare.