Un metodo di immunofluorescenza per la caratterizzazione di cellule esofago di Barrett

L'obiettivo generale del seguente esperimento è valutare gli effetti del trattamento farmacologico sulla struttura cellulare e sulla localizzazione delle proteine nelle cellule BE. Ciò si ottiene incubando le cellule BE coltivate sui vetrini coprioggetti con un farmaco scelto in condizioni di coltura cellulare standard. In una seconda fase, incubare le cellule trattate con un fissativo, che preserva la struttura e la localizzazione delle proteine.

Successivamente, le cellule be fissate vengono incubate in sequenza con anticorpi primari e secondari marcati in fluorescenza al fine di visualizzare i cambiamenti nella proteina bersaglio selezionata tramite microscopia a fluorescenza. Si ottengono risultati della microscopia a fluorescenza che mostrano come il trattamento farmacologico delle cellule be alteri la localizzazione delle proteine e la struttura cellulare sulla base della visualizzazione della colorazione in immunofluorescenza. Sebbene questo metodo possa fornire informazioni sull'esofago di Barrett, può essere applicato anche ad altri sistemi, tra cui il cancro e le cellule normali. Iniziare questa procedura inserendo i vetrini coprioggetti da 18 millimetri in una capsula di Petri di vetro e sterilizzarli in autoclave.

Quindi trasferire i vetrini di copertura dell'autoclave in una piastra di coltura tissutale a 12 pozzetti utilizzando una pipetta di vetro sterile collegata a una provetta a vuoto. Dopo il lavaggio, il coperchio scivola con PBS e terreno sterile. Prossima tripsina.

Le cellule immortalizzate contano le cellule utilizzando un contatore di cellule automatizzato o un emocitometro e successivamente diluiscono le cellule nei terreni di coltura a una concentrazione compresa tra 20.000 e 40.000 cellule per millilitro. Quindi inserire un millilitro di cellule in ogni pozzetto contenente un vetrino coprioggetti. Per una conta totale di cellule da 20.000 a 40.000 cellule per pozzetto, utilizzare una punta di pipetta sterile per spingere delicatamente il vetrino coprioggetto sul fondo del pozzetto per assicurarsi che le cellule si attacchino al vetrino coprioggetti.

Per trattare le cellule BE, diluire bene il farmaco selezionato in un terreno a 37 gradi Celsius alla concentrazione desiderata, invertendo ripetutamente il tubo o utilizzando un miscelatore a vortice. Iniziare il trattamento 24 ore dopo l'inserimento iniziale delle cellule BE per consentire l'attacco delle cellule sul coperchio Scivolare le piastre per campioni trattate con un farmaco e un veicolo con una penna da laboratorio per distinguere tra confronto e controllo. Trattare un ulteriore vetrino di copertura di cellule be con lo 0,1% di veicolo diluito nel terreno di coltura.

Successivamente, posizionare le cellule in un incubatore per colture cellulari a 37 gradi Celsius, 5% di anidride carbonica e 98% di umidità. Ora, dopo il tempo di incubazione desiderato del trattamento farmacologico, aspirare il terreno e lavare rapidamente i vetrini coprioggetto con un XPBS a temperatura ambiente. Quindi aspirare il PBS e aggiungere un millilitro di PBS contenente il 4% di PFA a ciascun pozzetto e incubare a temperatura ambiente per 30 minuti.

Quindi, aspirare il 4%P-F-A-P-B-S Lavare i vetrini coprioggetto tre volte cinque minuti ogni volta con PBS a temperatura ambiente. Conservare i vetrini coprioggetti per una settimana in PBS e 0,1% PFA a quattro gradi Celsius, se lo si desidera. Per consentire agli occhi permeabili le cellule PFA fissate per consentire all'anticorpo di accedere ai bersagli intracellulari, incubare le cellule con 50 millimolari di cloruro di ammonio diluito in PBS per 10 minuti a temperatura ambiente.

Quindi lavarli con PBS a temperatura ambiente una volta per cinque minuti. Ciò ridurrà il fondo per prevenire il legame non specifico degli anticorpi alle proteine cellulari. Incubare le cellule BE per 30 minuti in 100-300 microlitri di PBS contenente lo 0,1% di troponina e lo 0,5% di BSA.

Quindi preparare un piatto quadrato di biodosaggio stratificando il fondo della camera con tovaglioli di carta bagnati e posizionando sopra uno strato di profumo. Contrassegna il Parfum con una penna da laboratorio per identificare i vetrini. Trasferire delicatamente le cellule dei vetrini coprioggetto rivolte verso l'alto sul param utilizzando una pinza e un ago per siringa.

Ora diluire l'anticorpo primario nella PBS contenente sia lo 0,5% di BSA che lo 0,1% di saponina, tamponare delicatamente la soluzione bloccante. Utilizzando un fazzoletto di laboratorio, aggiungere 100 microlitri della soluzione di anticorpi primari e incubare le cellule be durante la notte a quattro gradi Celsius. Il giorno dopo.

Lavare i vetrini tre volte con PBS contenente lo 0,5% di BSA e lo 0,1% di troponina per cinque minuti ogni volta a temperatura ambiente. Quindi diluire l'anticorpo secondario coniugato con un tag fluorescente in PBS contenente lo 0,5% di BSA e lo 0,1% di ponente. Aggiungere 100 microlitri di anticorpo diluito a ciascun vetrino coprioggetti e incubare le cellule per due ore a temperatura ambiente Dopo due ore.

Lavare i vetrini coprioggetto tre volte cinque minuti ogni volta in PBS contenente lo 0,5% di BSA e lo 0,1% di troponina. Rimuovere il tampone di lavaggio e aggiungere da 100 a 300 microlitri di PBS ai vetrini. Sollevare delicatamente il vetrino coprioggetto con una pinza e tamponare il PBS con un fazzoletto da laboratorio o un tovagliolo di carta.

Quindi aggiungere 15 microlitri di un supporto di montaggio Antifa adatto contenente DPI al vetrino coprioggetto. Posizionare il vetrino coprioggetto rovesciato su un vetrino da microscopio con le cellule rivolte verso il basso. Successivamente, posizionare i vetrini in una cartella per vetrini e tenerli lontani dalla luce diretta durante la notte a temperatura ambiente per consentire al mezzo Antifa di polimerizzare.

Una volta che il mezzo Antifa si è solidificato, i vetrini possono essere conservati a quattro gradi Celsius o a 20 gradi Celsius negativi fino alla visualizzazione microscopica. In questo passaggio, rimuovere i vetrini di conservazione da una temperatura negativa di 20 gradi Celsius o quattro gradi Celsius e lasciarli riscaldare a temperatura ambiente. Accendere il microscopio e la lampada ad arco di mercurio.

Posizionare un vetrino da microscopio con il vetrino coprioggetto rivolto verso l'obiettivo sul tavolino del microscopio. Quindi, seleziona il filtro DAPI e apri l'otturatore. Metti a fuoco l'obiettivo guardando attraverso gli oculari finché non appare l'immagine.

Poiché tutte le cellule sono state colorate con dpi, i nuclei dovrebbero essere facilmente osservati. Raccogliere le immagini utilizzando un software di elaborazione delle immagini appropriato: in questa figura i vetrini coprioggetto con CPC e CPD sono stati trattati con un veicolo o un micromolare dell'inibitore SRC. SKI 6 0 6 per 24 ore le cellule sono state poi fissate e colorate.

Secondo il protocollo descritto, la beta catenina indicata in verde è stata visualizzata utilizzando un anticorpo specifico e un anticorpo secondario accoppiato a LOR 4 88 mentre il nucleo è stato colorato con DPI indicato in blu. Si noti il cambiamento nella posizione della beta-catenina dal nucleo alla membrana cellulare. Dopo il trattamento con SKI 6 0 6.

Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come colorare l'esofago di Barrett in immunofluorescenza per studiare la localizzazione delle proteine o la struttura cellulare.