Name: Un metodo di immunofluorescenza per la caratterizzazione di cellule esofago di Barrett (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-07-20T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 54 s
Description: Impara un metodo di immunofluorescenza per caratterizzare le cellule dell'esofago di Barrett. Questa tecnica permette di valutare gli effetti dei farmaci sulla localizzazione proteica e sulla morfologia cellulare.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni dal St, Fondazione Joseph (AJF, Lji) e American Lung Association, RG-224607-N (Lji).

1. Manutenzione Cell Line <ol><li> Umana immortalizzate BE displastiche di alto grado (CP-B, CP-C, CP-D) e metaplastica (CP-A) linee cellulari mediante trasfezione stabile della telomerasi umana trascrittasi inversa (TERT) proteina 11. </li><li> Mantenere BE linee cellulari in mezzi di cheratinociti, completata con estratto di ipofisi bovina (BPE), fattore di crescita epidermico (EGF), siero bovino fetale 5% (FBS), aminoacidi non essenziali (NEAA), penicillina-streptomicina-neomicina (PSN), e norma condizioni di coltura tissutale (37 ° C, 5% di CO 2, il 98% di umidità). </li></ol> 2. BE cellulare placcatura <ol><li> Preparazione di 12-pozzetti / lamelle. Mettere 18 millimetri vetrini in una piastra di Petri di vetro e autoclave. Trasferimento autoclavato 18 millimetri vetrini coprioggetto in un piatto di coltura tissutale a 12 pozzetti utilizzando una pipetta sterile di vetro collegata ad un tubo a vuoto. Lavare il vetrino con PBS sterile e dei media. </li><li> Trypsinize e contare le cellule essere immortalati. Contare le celle dell&#39;USIng un contatore automatico di cellule o un emocitometro. Diluire le cellule in coltura ad una concentrazione di 20.000-40.000 cellule / ml. </li><li> Mettere 1 ml di cellule in ciascun pozzetto contenente un vetrino per un conteggio di cellule totale di 20.000-40.000 cellule / pozzetto. </li><li> Utilizzare un puntale sterile per spingere delicatamente il vetrino sul fondo del pozzo per assicurare che le cellule attribuiscono al vetrino. </li></ol> Trattamento farmacologico delle cellule BE 3. <ol><li> Diluire farmaco selezionato in (37 ° C), i media caldi di concentrazione desiderata e mescolare bene invertendo il tubo più volte o utilizzando un vortex. Concentrazioni di farmaco determinato in modo empirico. Iniziare il trattamento 24 ore a seguito del seeding iniziale delle cellule essere quello di permettere alle cellule attaccamento al vetrino </li><li> Per confronto e controllo, trattare un vetrino aggiuntivo di cellule sia con 0,1% di veicolo (dimetilsolfossido [DMSO] o l&#39;agente usati per solubilizzare composto) diluito in coltura. Targhetta di identificazione con una penna laboratorio per identificare il farmaco e vehicle campioni trattati. Posizionare cellule in un incubatore di coltura cellulare impostato a 37 ° C, 5% CO 2, 98% di umidità e incubare per punti di tempo desiderati. </li></ol> 4. Immunofluorescenza <ol><li> Fissazione <ol><li> Seguendo tempo di incubazione desiderata del trattamento farmacologico, aspirare il supporto e lavare i coprioggetti rapidamente con 1x tampone fosfato salino (PBS) a temperatura ambiente (RT, 25 ° C). </li><li> Aspirare il PBS e aggiungere 1 ml di PBS contenente 4% PFA [4% PFA / PBS] in ciascun pozzetto ed incubare a temperatura ambiente per 30 min. </li><li> Aspirare il 4% PFA / PBS e lavare il coprioggetto 3x, 5 minuti ciascuno con PBS a temperatura ambiente. Il negozio di lamelle per una settimana in PBS/0.1% PFA a 4 ° C se lo si desidera. </li></ol></li><li> Permeabilizzazione / Blocco Permeabilize cellule PFA fisse per consentire l&#39;anticorpo per accedere ai bersagli intracellulari. Per extracellulare superficie proteine, eseguire tutti i passaggi successivi, senza saponina aggiunto alla soluzione BSA 1x PBS/0.5%. <ol><li> Ridurre sfondo incubando con 50 mM NH 4 Cl diluito in PBS per 10 minuti a RT e lavare con PBS RT volta per 5 min. </li><li> Incubare essere cellule per 30 minuti a 100-300 ml di PBS contenente 0,1% e saponina allo 0,5% albumina di siero bovino (BSA). Diluire saponina da filtro sterilizzato 10% stock, preparato in acqua e conservati a 4 ° C. </li></ol> NOTA: Questo impedisce il legame non specifico degli anticorpi verso proteine ​​cellulari bloccando coprioggetti causa dell&#39;aggiunta di 0,5% BSA. In alternativa, sostituire la BSA con siero di capra diluito al 5% per contribuire a ridurre il legame non specifico degli anticorpi. </li><li> Preparazione della Camera umano <ol><li> Preparare un piatto saggio biologico piazza stratificando il fondo della camera con asciugamani di carta bagnati e mettere uno strato di Parafilm sulla parte superiore. </li><li> Delicatamente trasferire i coprioggetti, celle rivolte verso l&#39;alto, sul Parafilm con pinze e un ago da siringa. </li><li> Segnare il Parafilm con una penna di laboratorio per identificare i vetrini. </li></ol></li><li>Incubazione Anticorpo Primario <ol><li> Diluire l&#39;anticorpo primario in PBS contenente BSA sia 0,5% e 0,1% saponina. </li><li> Tamponare delicatamente la soluzione di saturazione usando un tessuto di laboratorio e aggiungere 100 ml di soluzione di anticorpo primario. Incubare l&#39;anticorpo primario sulle cellule BE notte a 4 ° C. </li></ol></li><li> Incubazione secondario <ol><li> Lavare i vetrini 3x con PBS/0.5% BSA/0.1% saponina per 5 minuti ciascuno a RT. </li><li> Diluire anticorpo secondario coniugato con un tag fluorescente in PBS/0.5% BSA/0.1% saponina che l&#39;anticorpo secondario riconosce le specie in cui l&#39;anticorpo primario è stato sollevato. </li><li> Aggiungere 100 ml di anticorpo diluito ad ogni vetrino. Incubare l&#39;anticorpo secondario per 2 ore a temperatura ambiente. </li></ol></li><li> Lavaggio e Montaggio di Coprivetrini <ol><li> Lavare il coprioggetti 3x, 5 min ciascuno in PBS/0.5% BSA/0.1% saponina. Rimuovere il tampone di lavaggio e aggiungere 100-300 ml di PBS alle lamelle. NOTA: Per il doppio controcolorazione del corpo, ripetere i passaggi 4,4-4,5 con l&#39;anticorpo primario e secondario ulteriori desiderato in base alle informazioni descritte nella discussione. </li><li> Utilizzando pinze, delicatamente sollevare il vetrino e macchia al largo della PBS utilizzando un tessuto di laboratorio o un tovagliolo di carta. </li><li> Aggiungere 15 ml di un supporto di montaggio anti-sbiadimento adatto contenente 4 &#39;,6-diamidino-2-fenilindolo (DAPI) per il vetrino e invertire il vetrino, celle in basso, su un vetrino da microscopio in vetro. </li><li> Porre i vetrini in una cartella di diapositive e incubare al riparo dalla luce diretta durante la notte a temperatura ambiente per permettere al mezzo anti-sbiadimento difficile impostare curare, secondo le istruzioni del produttore. Una volta che il mezzo anti-dissolvenza è impostato, i vetrini possono essere conservati a 4 ° C o -20 ° C o fino visualizzazione microscopica. </li></ol></li></ol> 5. Visualizzazione microscopica di Coprivetrini Cellule colorate possono essere esposte sia tramite microscopia confocale o un IF in grado microscop verticalee. Sebbene microscopia confocale offre immagini ad alta risoluzione a profondità discrete, un microscopico verticale è in grado di produrre immagini utili più veloce. Per brevità, un metodo di imaging macchiato BE cellule con un microscopio normale è presentato. In generale, all&#39;immagine isotiocianato di fluoresceina (FITC) o fluorofori simili (cioè proteina fluorescente verde), Texas Red e DAPI, richiede un microscopio con filtri in grado di discriminare questi fluorofori. Controllare il microscopio prima di iniziare il protocollo per determinare fluorofori compatibili. <ol><li> Imaging su un IF microscopio standard <ol><li> Rimuovere memorizzati diapositive / vetrini da -20 ° C o 4 ° C e permettere loro di riscaldare a temperatura ambiente. Accendere il microscopio e lampada a vapori di mercurio. </li><li> Posizionare vetrino da microscopio con coprioggetto rivolto verso l&#39;obiettivo sul palco microscopio. Per l&#39;utilizzo di un obiettivo immersione in olio, aggiungere una goccia di olio di immersione sul vetrino. </li><li> Selezionare il filtro DAPI e aprire l&#39;otturatore. </li&gt; <li> Mettere a fuoco l&#39;obiettivo, mentre guardando attraverso gli oculari fino a quando appare l&#39;immagine. Poiché tutte le cellule si colorano con DAPI, i nuclei devono essere facilmente osservabile. </li><li> Raccogliere le immagini utilizzando rispettivo software di elaborazione delle immagini. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Reid, B. J., Li, X., Galipeau, P. C., Vaughan, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Barrett%27s+oesophagus+and+oesophageal+adenocarcinoma%3A+time+for+a+new+synthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Cancer%22%5BJournal%5D)">Barrett's oesophagus and oesophageal adenocarcinoma: time for a new synthesis.</a> Nat. Rev. Cancer. 10, 87-101 (2010).</li>
<li>Hayeck, T. J., Kong, C. Y., Spechler, S. J., Gazelle, G. S., Hur, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+prevalence+of+Barrett%27s+esophagus+in+the+US%3A+estimates+from+a+simulation+model+confirmed+by+SEER+data%5BTitle%5D)+AND+%22Dis.+Esophagus%22%5BJournal%5D)">The prevalence of Barrett's esophagus in the US: estimates from a simulation model confirmed by SEER data.</a> Dis. Esophagus. 23, 451-457 (2010).</li>
<li>Brown, L. M., Devesa, S. S., Chow, W. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Incidence+of+adenocarcinoma+of+the+esophagus+among+white+Americans+by+sex%2C+stage%2C+and+age%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Natl.+Cancer+Inst%22%5BJournal%5D)">Incidence of adenocarcinoma of the esophagus among white Americans by sex, stage, and age.</a> J. Natl. Cancer Inst. 100, 1184-1187 (2008).</li>
<li>Konturek, P. C., Burnat, G., Hahn, E. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+Barret%27s+adenocarcinoma+cell+growth+by+simvastatin%3A+involvement+of+COX-2+and+apoptosis-related+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Physiol.+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Inhibition of Barret's adenocarcinoma cell growth by simvastatin: involvement of COX-2 and apoptosis-related proteins.</a> J. Physiol. Pharmacol. 58 Suppl 3, 141-148 (2007).</li>
<li>Peng, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glutathione+peroxidase+7+protects+against+oxidative+DNA+damage+in+oesophageal+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Gut%22%5BJournal%5D)">Glutathione peroxidase 7 protects against oxidative DNA damage in oesophageal cells.</a> Gut. 61, 1250-1260 (2012).</li>
<li>Vona-Davis, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MAPK+and+PI3K+inhibition+reduces+proliferation+of+Barrett%27s+adenocarcinoma+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Surg.+Res%22%5BJournal%5D)">MAPK and PI3K inhibition reduces proliferation of Barrett's adenocarcinoma in vitro.</a> Surg. Res. 127, 53-58 (2005).</li>
<li>Inge, L. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((a+small+molecule+inhibitor+of+the+Src+kinase%2C+reduces+the+growth+and+activates+apoptosis+in+pre-neoplastic+Barrett%27s+esophagus+cell+lines%3A+evidence+for+a+noninvasive+treatment+of+high-grade+dysplasia%5BTitle%5D)+AND+%22Thoracic+Cardiovasc.+Surg%22%5BJournal%5D)">a small molecule inhibitor of the Src kinase, reduces the growth and activates apoptosis in pre-neoplastic Barrett's esophagus cell lines: evidence for a noninvasive treatment of high-grade dysplasia.</a> Thoracic Cardiovasc. Surg. 145, 531-538 (2013).</li>
<li>Jovov, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ion+transport+and+barrier+function+in+a+telomerase-immortalized+human+nondysplastic%2C+Barrett%27s+cell+line+%28BAR-T%29%5BTitle%5D)+AND+%22Dis.+Esophagus%22%5BJournal%5D)">Ion transport and barrier function in a telomerase-immortalized human nondysplastic, Barrett's cell line (BAR-T).</a> Dis. Esophagus. 22, 386-395 (2009).</li>
<li>Merlo, L. M., Kosoff, R. E., Gardiner, K. L., Maley, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+in+vitro+co-culture+model+of+esophageal+cells+identifies+ascorbic+acid+as+a+modulator+of+cell+competition%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Cancer%22%5BJournal%5D)">An in vitro co-culture model of esophageal cells identifies ascorbic acid as a modulator of cell competition.</a> BMC Cancer. 11, 461(2011).</li>
<li>Zhang, H. Y., Hormi-Carver, K., Zhang, X., Spechler, S. J., Souza, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+benign+Barrett%27s+epithelial+cells%2C+acid+exposure+generates+reactive+oxygen+species+that+cause+DNA+double-strand+breaks%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">In benign Barrett's epithelial cells, acid exposure generates reactive oxygen species that cause DNA double-strand breaks.</a> Cancer Res. 69, 9083-9089 (2009).</li>
<li>Palanca-Wessels, M. C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extended+lifespan+of+Barrett%27s+esophagus+epithelium+transduced+with+the+human+telomerase+catalytic+subunit%3A+a+useful+in+vitro+model%5BTitle%5D)+AND+%22Carcinogenesis%22%5BJournal%5D)">Extended lifespan of Barrett's esophagus epithelium transduced with the human telomerase catalytic subunit: a useful in vitro model.</a> Carcinogenesis. 24, 1183-1190 (2003).</li>
<li>Kumble, S., Omary, M. B., Cartwright, C. A., Triadafilopoulos, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Src+activation+in+malignant+and+premalignant+epithelia+of+Barrett%27s+esophagus%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Src activation in malignant and premalignant epithelia of Barrett's esophagus.</a> Gastroenterology. 112, 348-356 (1997).</li>
<li>Inge, L. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((alpha-Catenin+overrides+Src-dependent+activation+of+beta-catenin+oncogenic+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cancer+Ther%22%5BJournal%5D)">alpha-Catenin overrides Src-dependent activation of beta-catenin oncogenic signaling.</a> Mol. Cancer Ther. 7, 1386-1397 (2008).</li>
<li>Coluccia, A. M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SKI-606+Decreases+Growth+and+Motility+of+Colorectal+Cancer+Cells+by+Preventing+pp60%28c-Src%29-Dependent+Tyrosine+Phosphorylation+of+%CE%B2-Catenin+and+Its+Nuclear+Signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">SKI-606 Decreases Growth and Motility of Colorectal Cancer Cells by Preventing pp60(c-Src)-Dependent Tyrosine Phosphorylation of β-Catenin and Its Nuclear Signaling.</a> Cancer Res. 66, 2279-2286 (2006).</li>
<li>Nam, J. -S., Ino, Y., Sakamoto, M., Hirohashi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Src+Family+Kinase+Inhibitor+PP2+Restores+the+E-Cadherin%2FCatenin+Cell+Adhesion+System+in+Human+Cancer+Cells+and+Reduces+Cancer+Metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Src Family Kinase Inhibitor PP2 Restores the E-Cadherin/Catenin Cell Adhesion System in Human Cancer Cells and Reduces Cancer Metastasis.</a> Clin. Cancer Res. 8, 2430-2436 (2002).</li>
<li>Chu, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((p27+phosphorylation+by+Src+regulates+inhibition+of+cyclin+E-Cdk2%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">p27 phosphorylation by Src regulates inhibition of cyclin E-Cdk2.</a> Cell. 128, 281-294 (2007).</li>
<li>Inge, L. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Soluble+E-cadherin+promotes+cell+survival+by+activating+epidermal+growth+factor+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Res%22%5BJournal%5D)">Soluble E-cadherin promotes cell survival by activating epidermal growth factor receptor.</a> Exp. Res. 317, 838-848 (2011).</li>
<li>Gan, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+roles+of+ERK+and+Akt+pathways+in+regulation+of+EGFR-mediated+signaling+and+motility+in+prostate+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Differential roles of ERK and Akt pathways in regulation of EGFR-mediated signaling and motility in prostate cancer cells.</a> Oncogene. 29, 4947-4958 (2010).</li>
</ol>

Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari in competizione.

Abbiamo delineato un metodo per l&#39;applicazione di IF di cellule essere verso chiarire gli effetti fisiologici di terapie mirate su queste cellule. Mentre abbiamo descritto l&#39;uso di queste procedure verso cellule BE, abbiamo trovato che questi metodi sono applicabili ad una varietà di tipi cellulari 13,17,18 anche. Inoltre, queste procedure possono essere modificati in vari modi per ottimizzare la colorazione per target specifici. Troviamo un parametro che ha un effetto dir...

Esofago di Barrett (BE) è un cambiamento metaplastica nel normale epitelio squamoso dell&#39;esofago e a seguito di esposizione cronica al contenuto gastrico derivanti da malattia da reflusso gastroesofageo (GERD) 1. BE è pensato per essere un meccanismo protettivo in risposta a GERD, tuttavia, la presenza di BE conferisce un aumentato rischio di adenocarcinoma esofageo (EAC), una malattia che comporta una significativa scarsa sopravvivenza 1. Le stime attuali indicano che fino al 5,6% della popolazione americana hanno essere, tuttavia, come BE è spesso asintomatica, si ritiene che la maggioranza dei BE rimane non diagnosticata 2. Poiché i tassi di incidenza sia di GERD e EAC hanno visto una crescita continua 3, è diventato importante per comprendere i meccanismi molecolari coinvolti nella progressione di BE a EAC, tanto più che queste informazioni potrebbero potenzialmente fornire approcci terapeutici verso la prevenzione della progressione di BE EAC. 1. L&#39;infiammazione cronica, lesioni e danno genotossico derivante dall&#39;esposizione prolungata a contenuto gastrico esercitare una pressione selettiva sulla lesione BE promozione progressione neoplastica di EAC. Un certo numero di alterazioni genetiche sono state identificate durante BE alla progressione EAC. Tuttavia, nonostante questo c&#39;è una netta mancanza di comprensione circa le esatte variazioni di segnalazione cellulare e gli effetti conseguenti su struttura e funzione delle cellule. Immortalata in linee cellulari in vitro sono strumenti utili per studiare gli effetti di segnalazione cellulare, in particolare nei studio degli effetti di composti terapeutici mirati. La recente disponibilità commerciale di linee cellulari immortalizzate BE consente per tali studi. Anche se le analisi high-throughput, come i test di vitalità ampiamente utilizzati, possono essere utili nel valutare gli effetti delle terapie mirate su proliferazione cellulare e survival 4-6, questi test non sono utili per interrogare gli effetti di segnalazione cellulare su morfologia cellulare. Immunofluorescenza (IF) è una tecnica utile per studiare gli effetti delle terapie mirate sulle caratteristiche morfologiche, la crescita e la sopravvivenza delle cellule e le proteine ​​che sono coinvolte. Il nostro laboratorio ha adattato questi metodi verso linee cellulari immortalizzate BE, utilizzando IF per valutare gli effetti di un farmaco clinicamente disponibile su linee cellulari BE, nella speranza di delineare un possibile trattamento chemopreventative e biomarker per il trattamento farmacologico 7. Allo stesso modo, l&#39;applicazione di queste tecniche in EAC, BE e linee cellulari esofagee immortalizzate ha delineato i risultati critici in merito BE di EAC progressione 8-10. Troviamo se l&#39;analisi di cellule trattate con terapie mirate ha valore, consentendo per la caratterizzazione dei cambiamenti nella struttura cellulare e la localizzazione delle proteine. Qui vi presentiamo i nostri metodi di IF di essere cellule immortalizzate per characterize trattamento farmacologico.

<table><tbody><tr><td>CP-A (Linea cellulare metaplastica)</td><td>ATCC</td><td>CRL-4027</td><td></td></tr><tr><td>CP-B (Linea cellulare displastica di alta qualità)</td><td>ATCC</td><td>CRL-4028</td><td></td></tr><tr><td>CP-C (Linea cellulare displastica di alta qualità)</td><td>ATCC</td><td>CRL-4029</td><td></td></tr><tr><td>CP-D (Linea cellulare displastica di alta qualità)</td><td>ATCC</td><td>CRL-4030</td><td></td></tr><tr><td>Cheratinocita-SFM (1x), Liquid</td><td>Life Technologies</td><td>17005-042</td><td></td></tr><tr><td>0,25% tripsina-EDTA (1x), rosso fenolo&nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>25200056</td><td></td></tr><tr><td>Siero fetale bovino, qualificato, HI</td><td>Life Technologies</td><td>10438026</td><td></td></tr><tr><td>Miscela di antibiotici PSN</td><td>Life Technologies</td><td>15640</td><td></td></tr><tr><td>PBS - Soluzione salina tamponata con fosfato</td><td>Life Technologies</td><td>10010049</td><td></td></tr><tr><td>Reagente antidissolvenza Pro-long Gold con DAPI&nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>P36931</td><td></td></tr><tr><td>Vetrino coprioggetti circolare in vetro 18 mm</td><td>Fisher Scientific</td><td>15-183-86</td><td></td></tr><tr><td>&beta;-catenina Anticorpo primario (Coniglio)</td><td>Segnalazione cellulare</td><td>9562S</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 (Capra Anti-Coniglio)</td><td>Life Technologies</td><td>A11008</td><td></td></tr><tr><td>Piatto PS trattato TC da 10 cm, sterile</td><td>USA Scientific</td><td>CC7682-3394</td><td></td></tr><tr><td>Piastra PS trattata con TC a 12 pozzetti, sterile</td><td>USA Scientific</td><td>5666-5180</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>276855</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldeide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6148</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro di ammonio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9434</td><td></td></tr><tr><td>Saponina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>47036</td><td></td></tr><tr><td>Albumina sierica bovina - Frazione V</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>85040C</td><td></td></tr><tr><td>SKI-606 (Bosutinib)</td><td>Selleck Chemicals</td><td>S1014</td><td></td></tr><tr><td>Piatto quadrato per biodosaggio&nbsp;</td><td>Thermo Scientific</td><td>240835</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm&nbsp;</td><td>VWR</td><td>82024-546</td><td></td></tr><tr><td>Pipette Pasteur monouso, vetro di selce</td><td>VWR</td><td>14672-380</td><td></td></tr><tr><td>Nexcelom Mini contatore di celle</td><td>Nexcelom</td> Camere di conteggio per cellometro Nexcelom <td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Nexcelom</td><td>CHT4-SD100-014</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio Zeiss Apotome</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

un metodo di immunofluorescenza per la caratterizzazione di cellule esofago di barrett

An Immunofluorescent Method for Characterization of Barrett&#8217;s Esophagus Cells

Adenocarcinoma esofageo (EAC) ha un tasso di sopravvivenza inferiore al 17% e l&#39;incidenza di EAC è aumentato drammaticamente negli ultimi due decenni. Uno dei fattori di rischio primari di EAC è esofago di Barrett (BE), un cambiamento metaplastica del normale dell&#39;esofago squamoso in risposta al bruciore di stomaco cronica. Nonostante il collegamento consolidata tra EAC e BE, interrogatori degli eventi molecolari, in particolare le vie di segnalazione alterate che coinvolgono la progressione della BE a EAC, sono poco conosciute. Molto di questo è dovuto alla mancanza di idonei modelli in vitro disponibili per studiare queste malattie. Recentemente, BE linee cellulari immortalizzate sono diventati disponibili in commercio che consente per gli studi in vitro di BE. Qui, presentiamo un metodo per immunofluorescenza di linee cellulari immortalizzate BE, permettendo alla caratterizzazione in vitro di segnalamento e struttura cellulare dopo esposizione a composti terapeutici. L&#39;applicazione di queste tecniche sarà help sviluppare comprensione dei meccanismi coinvolti in BE per EAC progressione e fornire potenziali vie per il trattamento e la prevenzione di EAC.

Un esempio dei risultati ottenuti dall&#39;applicazione delle procedure descritte è illustrato nelle figure 1A-D. Coprioggetto con CP-D e BE cellule CP-C sono stati trattati per 24 ore con 1 mM dell&#39;inibitore Src famiglia, SKI-606, o di un veicolo (DMSO) e colorati con le modalità di cui sopra per il adherens Junction e Wnt segnalazione proteine, β -catenina. Visualizzazione di β-catenina è stata ottenuta mediante l&#39;etichettatura con IgG anti-coniglio accoppiato ad un fluorocromo verde, mentre l...

Vi è la necessità di migliorare discernibile informazioni sui driver molecolari dell&#39;esofago di Barrett. Immunofluorescenza è una tecnica utile per comprendere gli effetti di segnalazione cellulare sulla morfologia cellulare. Presentiamo un protocollo semplice ed efficace per l&#39;uso di immunofluorescenza per valutare il trattamento terapeutico nelle cellule esofago di Barrett.

Un metodo di immunofluorescenza per la caratterizzazione di cellule esofago di Barrett

Esophageal adenocarcinoma (EAC) has an overall survival rate of less than 17% and incidence of EAC has risen dramatically over the past two decades. One ...

L'obiettivo generale del seguente esperimento è valutare gli effetti del trattamento farmacologico sulla struttura cellulare e sul posizionamento delle proteine nelle cellule BE. Questo viene ottenuto incubando le cellule BE coltivate su coprivetri con un farmaco scelto, in condizioni standard di coltura cellulare. Come secondo passaggio, incubare le cellule BE trattate con un fissativo, che preserva la struttura e la localizzazione delle proteine.Successivamente, le cellule fissate vengono incubate in sequenza con anticorpi primari e secondari marcati con fluorocromo, al fine di visualizzare le variazioni nella proteina bersaglio selezionata mediante microscopia a fluorescenza; i risultati ottenuti mostrano come il trattamento farmacologico delle cellule modifichi la localizzazione proteica e la struttura cellulare, sulla base della visualizzazione della colorazione immunofluorescente. Sebbene questo metodo possa fornire informazioni utili sullo stato dell'esofago di Barrett, può essere applicato anche ad altri sistemi, inclusi cellule tumorali e normali. Iniziare questa procedura posizionando i coprioggetti da 18 millimetri in una piastra di Petri di vetro e sottoporli ad autocla

an-immunofluorescent-method-for-characterization-barretts-esophagus

Research

Ricerca

JoVE Journal

Biology

Biologia

Abbiamo descritto una procedura per la disaggregazione del tumore del colon-retto (CRC) per la produzione di singole cellule vitali, che vengono poi catturate su microarray anticorpi personalizzato riconoscere gli antigeni di superficie (DotScan CRC microarray). Sotto-popolazioni di cellule legato al microarray può essere profilato con multiplazione a fluorescenza utilizzando anticorpi monoclonali taggati con coloranti fluorescenti.

Carcinoma del colon-retto Profilo delle proteine ​​di superficie L&#39;utilizzo di un anticorpo Microarray e Multiplexing fluorescenza

Questo video illustra un metodo basato sull'immunofluorescenza per visualizzare le cellule del ciuffo intestinale in criosezioni di digiuno di topo fluttuanti. All'interno dei villi intestinali, la co-localizzazione della fluorescenza verde all'apice luminale con una massa estesa di radichette rosse indica la presenza di cellule del ciuffo.

Un metodo basato sull'immunofluorescenza per la visualizzazione delle cellule del ciuffo nelle criosezioni di digiuno

Fonte: Ear, P. H., et. al. Istituzione e caratterizzazione degli sferoidi del tumore neuroendocrino dell'intestino tenue. J. Vis. Exp. (2019)Questo video dimostra la colorazione in immunofluorescenza degli sferoidi dei tumori neuroendocrini dell'intestino tenue. Gli sferoidi vengono fissati, permeabilizzati e bloccati e vengono quindi incubati con anticorpi primari e secondari. Un colorante viene aggiunto ai nuclei colorati prima di montarli e visualizzarli al microscopio a fluorescenza.

Caratterizzazione degli sferoidi del tumore neuroendocrino dell'intestino tenue mediante immunofluorescenza

Vital-dye avanzata imaging di fluorescenza (VFI) è un romanzo in tecnica vivo che unisce imaging ad alta risoluzione epiteliale con contrasto fluorescente attualità esogeno per evidenziare la morfologia ghiandolare e delineare neoplasia (displasia di alto grado e cancro) nell'esofago distale.

La diagnosi di neoplasia in esofago di Barrett con Vital-dye avanzata di imaging di fluorescenza

Presentiamo un protocollo per generare colture primarie di cellule stromali esofagee murine e umane con un fenotipo di miofibroblasto. Le cellule in coltura hanno una morfologia a forma di fuso, esprimono α-SMA e vimentina e mancano di marcatori di superficie delle cellule epiteliali, ematopoietiche ed endoteliali. Le cellule stromali caratterizzate possono essere utilizzate negli studi funzionali delle interazioni epitelio-stromale.

Isolamento di miofibroblasti da mouse e Esofago umano

Questo manoscritto descrive la produzione, caratterizzazione e possibilità di utilizzo di un tessuto ingegnerizzato costrutto esofageo 3D preparati da normale fibroblasti esofageo umano primario e cellule epiteliali squamose seminate all'interno di un ponteggio suina de-cellularized. I risultati dimostrano la formazione di un epitelio stratificato maturo simile al normale esofago umano.

Produzione, caratterizzazione e possibilità di utilizzo di un 3D tissutale umano esofageo mucose Modello

L'immunohistochemistry di fluorescenza multiparametrica può essere utilizzato per valutare il numero, la distribuzione relativa e la localizzazione delle popolazioni di cellule immunitarie nel microambiente del tumore. Questo manoscritto descrive l'uso di questa tecnica per analizzare le sottopopolazioni delle cellule T nel cancro orofaringeo.

Immunohistochemia di fluorescenza a quattro colori delle sottopopolazioni delle cellule T in campioni di carcinoma a cellule squamose orofaringe umane incorporate in paraffina

L'analisi delle immagini con codici a barre multiplexed ha recentemente migliorato la caratterizzazione del microambiente tumorale, consentendo studi completi sulla composizione cellulare, sullo stato funzionale e sulle interazioni cellula-cellula. Qui, descriviamo un protocollo di colorazione e imaging che utilizza il codice a barre di anticorpi coniugati con oligonucleotidi e l'imaging ciclico, che consente l'uso di una tecnica di analisi delle immagini ad alta dimensionalità.

Analisi di immagini di codici a barre multiplexed per l'immunoprofilazione e la caratterizzazione della mappatura spaziale nell'analisi a singola cellula di campioni di tessuto di paraffina

Le co-colture organoide-fibroblasti forniscono un modello per studiare la nicchia delle cellule staminali in vivo . Qui viene descritto un protocollo per le co-colture organoide-fibroblasti esofagee. Inoltre, l'imaging a montaggio intero viene utilizzato per visualizzare l'interazione fibroblasto-organoide.

Caratterizzazione funzionale e visualizzazione di fibroblasti esofagei mediante co-colture organoidi

Il presente protocollo descrive la costituzione e l'analisi istologica di modelli di organoidi esofagei che rappresentano diversi stadi di progressione tumorale. Questo metodo consente ai ricercatori di studiare i cambiamenti nella morfologia cellulare, nell'organizzazione spaziale e nei modelli di espressione dei marcatori molecolari durante la transizione dai tessuti normali a quelli cancerosi.

Definizione e analisi istologica di organoidi esofagei che modellano la progressione da tessuti normali a cancerosi

Questo protocollo descrive un metodo per isolare simultaneamente organoidi tumorali, fibroblasti associati al carcinoma (CAF) e fibroblasti (CF) non associati al tumore provenienti dallo stesso paziente con carcinoma a cellule squamose esofagee (ESCC). L'impiego di questi materiali abbinati ai pazienti potrebbe evitare problemi legati alla variabilità tra pazienti e fornire una piattaforma sperimentale adeguata per la ricerca ESCC.

Stabilimento di organoidi tumorali, fibroblasti associati al carcinoma e fibroblasti corrispondenti dallo stesso paziente con cancro esofageo

Impara un metodo di immunofluorescenza per caratterizzare le cellule dell'esofago di Barrett. Questa tecnica permette di valutare gli effetti dei farmaci sulla localizzazione proteica e sulla morfologia cellulare.

Un metodo di immunofluorescenza per la caratterizzazione di cellule esofago di Barrett

Esplora altri video